米邦塔仙人掌多糖提取工藝的研究

徐叢玥++林款++茹琴++梁征++李超英

摘要：對熱水提取米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）粗多糖的提取工藝進行研究。以新鮮米邦塔仙人掌為原料，采用單因素試驗考察料液比、提取溫度、提取時間和提取次數對米邦塔仙人掌粗多糖得率的影響，并通過響應面法優化工藝參數。結果表明，影響粗多糖得率的因素主次順序為提取溫度>料液比>提取時間。確定最佳提取工藝參數為提取溫度83 ℃，料液比1∶28（g∶mL），提取時間為3 h，在此條件下，仙人掌粗多糖的得率為2.05%。

關鍵詞：米邦塔仙人掌（Opuntia milpa alta Haw）；粗多糖；提取；響應面法

中圖分類號：S682.33；TS201.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0927-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.034

Studies of Extraction Technique of Polysaccharide from Opuntia milpa alta Haw

XU Cong-yue1， LIN Kuan1， RU Qin1， LIANG Zheng1， LI Chao-ying1，2

（1. Wuhan Institutes of Biomedical Sciences， Jianghan University， Wuhan 430056， China；

2. Hanjea Biological Technology （Wuhan） Limited Liability Company， Wuhan 430075，China）

Abstract：Polysaccharide in fresh Opuntia milpa alta Haw was extracted with hot water. The effects of the ratio of material to water，extraction temperature，extraction time and extraction times on the yield of polysaccharide were investigated by single factor experiments. Subsequently，a quadratic regression rotational combinational design was employed，and data obtained were analyzed with response surface methodology. Polysaccharide yield was most significantly affected by extraction temperature，followed by water to material ratio，and extraction time. An optimum polysaccharide yield of 2.05% was obtained when opuntia milpa alta was treated at 83 ℃ for 3 h in a material-to-water ratio of 1∶28（g∶mL）.

Key words：Opuntia milpa alta Haw； polysaccharide； extraction； response surface methodology

由于仙人掌（Opuntia stricta）悠久的藥用歷史、豐富的營養活性成分及易于栽培等因素，在農學、食品及醫學等方面已經受到廣泛關注[1]。米邦塔仙人掌是1997年中國農業部從墨西哥米邦塔地區引進的食用仙人掌，富含多種營養成分，如鈣、鉀、鋅、鐵等礦物質、蛋白質、維生素，還含有多種活性功能成分，如多糖類、黃酮類、生物堿類等[2]。黏液質細胞和黏液質是仙人掌植物的特征之一，其中含有大量糖類物質，而多糖是仙人掌重要的功能成分。目前，對仙人掌多糖的提取純化、藥理功能及應用開發等方面研究較多，因此仙人掌多糖的提取工藝及其應用已具備了實際價值[3]。

米邦塔仙人掌多糖的提取方法有很多種，如熱水提取、酶法提取、稀酸或稀堿提取以及微波或超聲波輔助提取法[4]，但研究最廣泛的是熱水提取法。采用熱水提取法提取多糖受許多因素影響，如料液比、提取溫度、提取時間及提取次數等，需經過合理設計和試驗才能得到最佳工藝。蔡為榮等[5]采用水提法提取仙人掌多糖，用響應面分析法得到最佳提取條件為提取溫度86.1 ℃，提取時間3.61 h，料液比 1∶3.72，多糖得率為0.694%；劉洋等[6]用相同的響應面分析法提取仙人掌多糖，得到最佳工藝條件為料液比1∶5.5，提取溫度75 ℃，提取時間2.2 h，浸提1次，在此條件下，仙人掌粗多糖的實際得率為0.81%。

響應面法（RSM）是利用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程擬合因素與響應值之間的函數關系，通過回歸分析優化工藝參數，可以形象、直觀地解決工藝優化問題[7]。因此，本試驗通過響應面法優化熱水法提取米邦塔仙人掌粗多糖工藝參數，旨在提高仙人掌粗多糖提取率，為仙人掌多糖進一步的功能活性研究及開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

新鮮米邦塔仙人掌，購自江蘇宿遷繁星花卉園藝中心；無水乙醇、95%乙醇、丙酮、無水乙醚、濃硫酸、苯酚、三氯乙酸、阿拉伯糖等均為分析純；考馬斯亮藍G250試劑盒，購自武漢博士德生物有限公司。

DFY-1000V型高速萬能粉碎機，上海比朗儀器有限公司；RE-2000A型旋轉蒸發儀，SHZ-Ⅲ型循環水式真空泵，上海亞榮生化儀器廠；FD-1A-50型冷凍干燥機，上海豫明儀器有限公司；高速落地冷凍離心機，德國BECKMAN公司；全波長酶標儀，美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 米邦塔仙人掌粗多糖提取工藝流程 新鮮米邦塔仙人掌→預處理→仙人掌干粉→熱水提取→離心→取上清液，加4倍體積95%乙醇靜置12 h→離心→沉淀加500 mL去離子水復溶→濃縮→三氯乙酸法除蛋白質→透析除雜→取上清液，加4倍體積95%乙醇靜置12 h→離心→分別用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌沉淀3次→冷凍干燥→得到米邦塔仙人掌粗多糖。

1.2.2 操作要點 預處理[8]：取新鮮米邦塔仙人掌洗凈、去皮、切片，置于80 ℃烘箱內烘干，然后粉碎成粉末，過60目篩，以1∶2的料液比添加石油醚，脫脂脫色素后晾干，密封保存。

熱水提取：精確稱取10.0 g米邦塔仙人掌干粉，按設定水提條件（料液比、提取溫度、提取時間）進行提取試驗，得到粗多糖浸提液。

采用三氯乙酸法除去蛋白質[9]：等體積加入3%三氯乙酸溶液，攪拌均勻后于4 ℃靜置12 h，10 000 r/min離心10 min，上清液用NaOH調pH至中性，重復操作3次。

1.2.3 米邦塔仙人掌粗多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定粗多糖含量[10]，以阿拉伯糖為標準品測定粗多糖中多糖含量。粗多糖得率=粗多糖重量/仙人掌干粉重量×100%。

1.2.4 單因素和響應面試驗 通過單因素試驗，分別考察料液比、提取溫度、提取時間、提取次數對米邦塔仙人掌粗多糖得率的影響。根據單因素試驗結果，以料液比、提取溫度和提取時間為參數，以粗多糖得率為響應值，按照Design-Expert 10.0分析軟件中的Box-Behnken中心組合設計法，設計三因素三水平的響應面試驗，并對數據進行分析，得到響應面回歸方程，進一步尋找最優工藝參數。

2 結果與分析

2.1 熱水提取仙人掌粗多糖工藝單因素試驗

2.1.1 料液比對仙人掌粗多糖得率的影響 固定提取溫度為75 ℃，提取3 h，提取1次，調節料液比分別為1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶mL，下同），考察不同料液比對粗多糖得率的影響，結果如圖1所示。由于多糖等大分子物質的溶解度不高，因此提取過程中用水量是一個重要因素。由圖1可知，隨著料液比的增加，仙人掌粗多糖得率明顯增加，當料液比為1∶30時粗多糖得率最大。仙人掌中水分較高，黏性強，烘干后加水提取依然黏稠，當料液比較低時，溶液呈糜狀，需要較強的攪拌力度，不容易分離多糖，且損失較大；增加料液比，有利于粗多糖的提取。

2.1.2 提取溫度對仙人掌粗多糖得率的影響 固定料液比為1∶20，提取3 h，提取1次，提取溫度分別設定為65、70、75、80、85、90 ℃，分析不同提取溫度對仙人掌粗多糖得率的影響，結果如圖2所示。由圖2可知，在65～85 ℃，仙人掌粗多糖得率隨著溫度的升高而增加，但85 ℃后，溫度升高粗多糖得率反而下降。可能是因為溫度過高，粗多糖穩定性降低，高溫條件下部分粗多糖降解，因此提取溫度不宜太高。

2.1.3 提取時間對仙人掌粗多糖得率的影響 固定料液比為1∶20，提取溫度75 ℃，提取1次，設計提取時間為1、2、3、4、5 h，考察不同提取時間對仙人掌粗多糖得率的影響，結果見圖3。由圖3可知，提取時間在2 h以內，仙人掌粗多糖得率增加，時間過長粗多糖得率反而下降。在粗多糖提取過程中，粗多糖浸出程度與時間有關，時間過短，提取不充分，但時間過長，可能會引起粗多糖結構的變化從而降低得率。

2.1.4 提取次數對仙人掌粗多糖得率的影響 在料液比1∶20，提取溫度75 ℃，提取時間3 h的條件下，考察提取次數對仙人掌粗多糖得率的影響，結果見圖4。由圖4可知，第1次粗多糖得率為1.5%，提取2次累計為1.7%，而第3次粗多糖得率僅為0.1%。重復提取3次，粗多糖得率增加不明顯，而且增加提取次數會使后續濃縮任務加重，延長提取時間，考慮到提取成本，因此選擇提取1次。

2.2 響應面優化試驗

2.2.1 響應面試驗設計 為優化單因素試驗得到的工藝條件，根據Box-Behnken中心組合設計原理，在單因素試驗的基礎上，選擇料液比（X1）、提取溫度（X2）和提取時間（X3）3個對仙人掌粗多糖得率影響較大的因素為自變量，以粗多糖得率為響應值，進行三因素三水平的響應面分析。結合前期單因素試驗結果，設計響應面試驗各因素水平（表1），具體試驗方案和結果如表2所示。

響應面分析試驗共有15個試驗，其中1～12號為析因試驗，13～15號為中心試驗。析因點是三個自變量構成的三維頂點為區域的中心點，三個中心試驗則用來估計試驗誤差。

2.2.2 模型方差分析 通過Design-Expert 10.0軟件對數據進行分析，得到響應面回歸方程，回歸模型方差分析結果見表3，回歸方程各系數顯著性分析結果見表4，回歸方程中各系數的估計值見表5。

從表3回歸方差分析可知，該模型P<0.01，方程模型達到極顯著，失擬檢驗P=0.473 322>0.05，影響不顯著，說明無失擬因素存在。該回歸模型的總決定系數R2=0.996 7，調整決定系數R2Adj=0.990 7，說明該模型的擬合程度較好，試驗誤差小。故此回歸方程模型成立，可以用此模型對熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖進行分析和預測。

由表4可知，熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖的工藝參數中，料液比、提取溫度、提取時間3個因素對仙人掌粗多糖的影響均極顯著。在所選取的各因素水平范圍內，影響粗多糖得率的因素主次順序為提取溫度（X2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。料液比（X1）與提取時間（X3）存在交互作用，達到顯著水平。

對表4中的各項數據進行回歸擬合，得到表5中各項系數的估計值，故自變量與米邦塔仙人掌粗多糖得率的二次多項回歸方程為Y=2.056 67+0.036 25X1+0.057 50X2+0.033 75X3-0.007 50X1X2-0.010 00X2X3+0.007 50X2X3-0.018 33X12-0.050 83X22-0.013 33X32。

2.2.3 響應面分析 熱水提取米邦塔仙人掌粗多糖工藝中料液比、提取溫度和提取時間3個因素之間的交互作用對粗多糖得率的影響見圖5、圖6和圖7。

等高線的形狀可直觀地看出交互作用的強弱，橢圓形反映了兩因素的交互作用較強，呈圓形則相反，而響應面曲線較陡也說明交互作用較強。由圖5可知，與料液比相比，提取溫度的響應面曲線較陡，對仙人掌粗多糖得率的影響較大，說明提取溫度對粗多糖得率的影響較料液比明顯。由圖6可知，提取時間與料液比的交互作用對仙人掌粗多糖得率的影響顯著。由圖7可知，隨著提取溫度和提取時間的同時增加，仙人掌粗多糖得率也在增大。

根據Design-Expert 10.0軟件分析得到最優提取工藝參數為料液比1∶27.96，提取溫度82.97 ℃，提取時間2.99 h，此時仙人掌粗多糖得率為2.10%。為檢驗響應面法優化米邦塔仙人掌粗多糖提取工藝的可靠性，采用優化后的提取條件進行驗證試驗。參考實際操作，將優化的工藝參數調整為料液比1∶28，提取溫度為83 ℃，提取時間為3 h。在此條件下，仙人掌粗多糖得率為2.05%，與理論預測值基本吻合。因此，利用此模型優化得到的工藝參數真實可靠，具有可行性和實用價值，測得該粗多糖中多糖含量為54.18%。

3 小結

本研究采用熱水法提取米邦塔仙人掌粗多糖，為進一步優化熱水法提取粗多糖的工藝條件，考察了料液比、提取溫度、提取時間和提取次數4個因素對仙人掌粗多糖得率的影響。

通過單因素試驗和響應面試驗，得到影響粗多糖得率的因素按主次順序排列：提取溫度（X2）>料液比（X1）>提取時間（X3）。確定最佳提取工藝參數為料液比1∶28，提取溫度83 ℃，提取時間3 h，在此條件下，仙人掌粗多糖的得率為2.05%，多糖含量為54.18%。

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