蓮藕節中多酚提取工藝優化

周瑋婧++李書藝++王文娟

摘要：利用作為廢棄物的蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）節資源，采用乙醇超聲浸提的方法從蓮藕節中提取多酚。通過單因素試驗確定了乙醇體積分數、料液比、pH、溫度和時間對蓮藕節中多酚提取率的影響，并進一步通過響應面試驗進行分析和實際應用考慮，確定蓮藕節中多酚提取的最佳工藝條件為pH 4.0，溫度40 ℃，乙醇體積分數61.04%，料液比1∶20.53（m∶V），提取時間45.20 min，經過該工藝優化后蓮藕節多酚提取率提高至6.27%。對通過優化工藝提取的蓮藕節多酚進行抗氧化性能測定，結果顯示蓮藕節多酚有較好的清除DPPH自由基的能力。

關鍵詞：蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）節；多酚；提取工藝；優化

中圖分類號：S645.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0938-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.037

Technology Optimization for Extracting Polyphenol from Lotus Festival

ZHOU Wei-jing1，LI Shu-yi2，WANG Wen-juan2

（1.Wuhan Institute for Food and Cosmetic Control， Wuhan 430000， China；2.College of Food Science & Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China）

Abstract： In order to make full use of the resources of lotus festival as wastes，the optimal conditions for extraction yield of polyphenol from lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival，so this issue with lotus festival for raw materials，ethanol ultrasonic extraction method for extracting polyphenol from multiple intersecting in. By single factor test to determine the alcohol concentration，solid-liquid ratio，pH，temperature and time on lotus festival polyphenol extraction and further analysis and consideration of the practical application of response surface experiments to determine the lotus root section of the ultrasonic extraction of polyphenol. The process conditions were pH 4.0， temperature of 40 ℃， ethanol concentration 61.04%， solid-liquid ratio of 1∶20.53（m∶V），extraction time 45.20 min. It is better for industrialized extraction and lotus festival polyphenol maximum extraction yield 6.27%. The polyphenol from lotus festival have strong scavenging effects to DPPH radicals.

Key words： lotus（Nelumbo nucifera Gaertn） festival； polyphenol； extraction technology； optimization

多酚具有較強的抗氧化特性，可以清除體內自由基，從而達到預防心血管疾病、延緩衰老的作用，植物多酚大部分都存在于植物的根、莖和葉子中。蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn）為睡蓮科蓮屬多年生大型水生草本植物，在中國栽培歷史悠久，種質資源豐富，是傳統的出口蔬菜，分布在湖北、湖南以及浙江等地。蓮藕的根、莖、葉到果實各個部位都是寶，有開胃消食、清熱解毒、滋生養性的功效，其中蓮藕節還可以用于治療咳血、尿血等疾病，具有較高的藥用價值。蓮藕節是蓮的干燥根莖節部，質地較硬，附有一些須根及須根痕[1]。中國每年消費大量的蓮藕，但由于有些部位不可食用，以及貯藏期很容易發生酶促褐變等原因，產生大量蓮藕廢棄物，然而蓮藕廢棄物中仍具有許多加工潛力的活性物質。蓮藕節就是其中一種，其含有多種有效成分如多酚。有研究表明[2]，蓮藕的平均多酚含量約為117 mg/100 g（FW），主要由多巴、兒茶酚、沒食子酸、兒茶素和表兒茶素等組成。所以作為蓮藕的主要功能活性成分，多酚的制備開發對促進產業精深加工并延展產業鏈具有重要意義，使蓮藕節更具有加工價值。

本研究從蓮藕節中提取多酚，通過單因素試驗和響應面試驗優化確定蓮藕節中多酚的超聲輔助浸提工藝，得出最佳的蓮藕節多酚提取率，并通過體外化學體系評價提取物的抗氧化活性，為蓮藕節的綜合利用和加工以及藕節中多酚類物質的開發利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮的蓮藕藕節，購于當地市場；沒食子酸（分析純），購于上海金錦樂實業有限公司；無水乙醇（分析純），購于深圳市華昌化工有限公司；福林酚試劑（分析純），購于合肥BIOSHARP生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7200型紫外分光光度計（德國斯派克分析儀器公司）；R-3型旋轉蒸發儀（瑞士步琦有限公司）；CHRIST ALPHA 2-4型真空冷凍干燥機（武漢利天科技儀器有限公司）；DS-1型高速組織搗碎機（上海標本模型廠）；FuheHH-4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市富華儀器有限公司）；SH2-Ⅲ型循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蓮藕節中多酚提取流程 稱取10 g蓮藕節并粉碎成渣→加入一定料液比的乙醇溶液→置于控溫超聲場中浸提→真空抽濾→旋蒸至10 mL→定容至25 mL→混勻后測定多酚含量。

1.3.2 測定蓮藕節中多酚含量 精密量取1.0 mL蓮藕藕節樣品溶液于10 mL刻度試管中，加5 mL去離子水，搖勻1 min后加1.5 mL 20% Na2CO3溶液，加入0.5 mL福林酚試劑，用去離子水定容至10 mL，室溫反應2 h，以去離子水為空白對照，在760 nm波長處測定樣品溶液的吸光度[3]。

1.3.3 多酚提取率計算 蓮藕節中多酚提取率按公式（1）計算：

X=■×100% （1）

式中，X為多酚提取率（%）；n為稀釋倍數；C為多酚質量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；m為蓮藕節質量（g）。

1.3.4 蓮藕節多酚提取工藝優化 在其他條件一致時，分別以乙醇體積分數、料液比、pH、溫度和時間作為試驗因素，每個因素分別設置5個水平進行單因素試驗，并根據試驗數據分析每個因素對蓮藕節中多酚提取的影響。通過單因素試驗，得出每個因素條件下蓮藕節多酚的提取率，從中選出對蓮藕節多酚提取率影響較大的3個因素，進行三因素三水平響應面試驗。

1.3.5 蓮藕節多酚清除DPPH自由基能力 取不同稀釋度的蓮藕節多酚提取液2 mL和2×10-4 mol/L的DPPH甲醇溶液2 mL，加入同一具塞試管中，搖勻，在室溫避光反應30 min后于515 nm處測定其吸光度，并用維生素C溶液作為陽性對照，去離子水為空白對照，計算蓮藕節多酚對DPPH·的清除率[4]， DPPH自由基清除率按公式（2）計算：

P=（1-■）×100% （2）

式中，A0為去離子水空白試劑的吸光度；A1為不同濃度提取液的吸光度。

2 結果與分析

2.1 多酚含量標準曲線制作

精確稱取干燥至恒重的沒食子酸10.0 mg，溶解后加水定容到100 mL，配成0.1 mg/mL的沒食子酸標準溶液。移液管依次準確吸取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL沒食子酸標準溶液于10 mL刻度試管中，按照“1.3.2”方法測定吸光度，以沒食子酸的質量為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線（圖1）。計算回歸方程為y=0.994 9x-0.075 4，R2=0.995 4。通過線性方程計算樣品中多酚含量，并根據公式折算出蓮藕節多酚提取率。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對蓮藕節多酚提取率的影響 在提取時間20 min、料液比1∶15（g∶mL，下同）、提取溫度40 ℃和pH 4.0的條件下，測定不同乙醇體積分數（30%、40%、50%、60%、70%）對蓮藕節多酚提取效果的影響。如圖2所示，不同體積分數的乙醇溶液對蓮藕節中多酚提取率有影響，隨著乙醇體積分數的增加，提取率逐漸增大，當乙醇體積分數為60%時，蓮藕節中多酚的提取率最大，但隨著乙醇體積分數的繼續增加，多酚提取率呈下降趨勢，故蓮藕節中多酚提取的乙醇體積分數選為50%～70%。

2.2.2 料液比對蓮藕節多酚提取率的影響 在提取時間20 min、60%乙醇、提取溫度40 ℃和pH 4.0的條件下，測定不同料液比（1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25）對蓮藕節多酚提取效果的影響。如圖3所示，隨著料液比的增加，蓮藕節多酚的提取率逐漸增加，當料液比為1∶20時，蓮藕節多酚提取率達到最大值，在料液比1∶15以下和1∶25以上時多酚提取率變化不明顯，故蓮藕節多酚提取的料液比范圍選定為1∶15～1∶25。

2.2.3 pH對蓮藕節多酚提取率的影響 在提取時間20 min、60%乙醇、提取溫度40 ℃、料液比1∶15的條件下，將pH分別調為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，分析不同pH對蓮藕節多酚提取效果的影響。如圖4所示，在pH為2.0～6.0時，蓮藕節多酚提取率變化不大，所以pH的變化對蓮藕節多酚提取率影響不大。

2.2.4 溫度對蓮藕節多酚提取率的影響 在提取時間20 min、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的條件下，測定不同提取溫度（20、30、40、50、60 ℃）對蓮藕節多酚提取效果的影響。如圖5所示，溫度對蓮藕節多酚提取率的影響不明顯，在20～60 ℃蓮藕節多酚提取率變化不明顯。據文獻報道[5]，溫度的升高有利于植物中多酚類物質的溶出和擴散，從而提高多酚的浸提效率，但由于本試驗采用超聲浸提的方法，超聲作用掩蓋了溫度的影響，所以使得溫度對多酚提取率的影響較小。

2.2.5 提取時間對蓮藕節多酚提取率的影響 在提取溫度40 ℃、60%乙醇、pH 4.0和料液比1∶15的條件下，測定不同提取時間（5、10、20、40、60 min）對蓮藕節多酚提取效果的影響。如圖6所示，隨著超聲提取時間的增加，蓮藕節中多酚提取率明顯增大，但在超聲處理20 min后，多酚提取率增加較緩慢。隨著提取時間的延長，多酚提取率基本不變，由于超聲處理時耗能較大，從經濟、節能的角度綜合考慮，將較為理想的蓮藕節多酚提取時間選為20、40、60 min。

2.3 蓮藕節中多酚提取的響應面試驗結果

2.3.1 響應面試驗設計 根據單因素試驗選擇3個關鍵因素乙醇體積分數（X1）、料液比（X2）和提取時間（X3）為研究對象，以蓮藕節多酚提取率為響應值，進行三因素三水平響應面試驗。響應面試驗因素與水平如表1所示，響應面試驗結果如表2所示，在17組處理組合中12組為分析因素試驗，5組為零點。

2.3.2 響應面試驗結果的方差分析 試驗數據采用Design-Expert 9.0統計軟件對響應面結果進行回歸分析，得出乙醇體積分數（X1）、料液比（X2）和提取時間（X3）對蓮藕節多酚提取率的影響可以用二次多項回歸方程表示為Y=6.20+0.21X1+0.16X2+0.39X3-0.09X1X2-0.16X1X3-0.019X2X3-0.75X12-0.66X22-0.71X32。對超聲波輔助乙醇提取蓮藕節中多酚的數學模型進行方差分析，結果見表3。從表3可以看出，模型一次項X1、X3，二次項X12、X22、X32均極顯著，一次項X2影響顯著，交互項X1X2、X1X3、X2X3均不顯著，因素影響的順序為X3>X1>X2。

其中二次響應面回歸模型的F值為44.25，P<0.000 1，且Y的模型確定系數為R2=0.902 7，說明該模型能解釋90.27%響應值的變化，因而該模型擬合程度良好，試驗誤差小，自變量與響應值之間線性關系顯著，因此可用此模型對蓮藕節中提取多酚工藝進行分析和預測。

2.3.3 響應曲面分析與優化 按照回歸方程進行軟件編程運算，得到交互因子的響應面圖，當乙醇體積分數、料液比和提取時間這3個因素當中的一個因素固定時，另外2個因素及其交互作用對蓮藕節多酚提取率的影響見圖7、圖8、圖9。根據數據分析得出，蓮藕節多酚的提取率隨著乙醇體積分數的增大而增加，但當乙醇體積分數增大到一定程度后，多酚提取率有下降的趨勢；料液比也表現出和乙醇體積分數一樣的趨勢，即蓮藕節多酚提取率隨著料液比的增大先增大后略微減小。然而提取時間的變化是隨著時間的增加，多酚提取率增大，由響應曲面的陡峭程度可知，提取時間對蓮藕節多酚提取率的影響極顯著，其次是乙醇體積分數，這與方差分析結果一致。乙醇體積分數（X1）與提取時間（X3）的作用最為明顯。

根據Design Expert 9.0軟件建立二次多項回歸模型，經檢驗該模型合理可靠，可用于蓮藕節中多酚的提取。根據模型優化，采用RSREG Procedure分析得到一個極值點（Y=6.27%），即從蓮藕節中提取多酚的最優工藝參數為乙醇體積分數為61.04%，料液比1∶20.54，提取時間45.20 min。在此條件下，蓮藕節多酚提取率為6.27%。

2.4 蓮藕節中多酚提取的抗氧化活性試驗

從圖10可以看出，維生素C和蓮藕節多酚對DPPH自由基都有較強的清除能力，并且隨著濃度的增加，清除率也逐漸增加。當蓮藕節多酚提取液的濃度達到400 μg/mL時，對DPPH自由基清除率達到60%以上。但蓮藕節的IC50為153.76 μg/mL，略高于維生素C，表明蓮藕節中多酚的清除能力比維生素C弱，這可能與蓮藕節的多酚提取物為粗提物有關。

3 小結

結合單因素試驗和響應面試驗結果分析，以提取率為指標優化蓮藕節多酚的超聲波提取條件為乙醇體積分數61.04%，料液比1∶20.53，提取時間45.20 min。在這個條件下所提取的蓮藕節多酚提取率為6.27%。影響蓮藕節多酚制備效果的各因素主次關系為提取時間>乙醇體積分數>料液比，應用該方法制備蓮藕節中的多酚，其工藝較為簡單、操作較方便快捷。

蓮藕節中多酚的抗氧化性研究結果表明，在測定DPPH自由基清除率中，蓮藕節多酚的IC50為153.76 μg/mL，說明蓮藕節多酚有一定的抗氧化能力，并且隨著樣品濃度的增加，蓮藕節中的多酚對DPPH的清除力先增強后趨于水平。試驗表明，蓮藕節多酚作為一種天然抗氧化劑，具有廣闊的開發應用前景，但在試驗中從蓮藕節中提取的多酚含量仍然不是很高，還需要進一步優化分離純化方法提高其純度。

參考文獻：

[1] 熊桂云，童 軍，劉冬碧，等.湖北省蓮藕生產與施肥現狀調查[J].湖北農業科學，2011，50（19）：3934-3939.

[2] 郭長江，韋京豫，楊繼軍，等.66種蔬菜、水果抗氧化活性的比較研究[J].營養學報，2003，25（2）：203-207.

[3] 楊冬梅.蓮藕抗氧化特性研究[D].杭州：浙江大學，2007.

[4] 劉煥云，劉月英，陳延峰，等.蓮藕皮多酚的提取及抗氧化性能研究[J].林產化學與工業，2011，31（2）：87-90.

[5] 嚴守雷.蓮藕多酚提取分離鑒定及生物活性研究[D].武漢：華中農業大學，2003.