抗HTNV中和性鼠/人嵌合抗體基因向植物轉化研究

謝偉強

摘 要：在由農桿菌介導的葉盤法轉化煙草的研究中，將含有重組質粒的農桿菌過夜培養后按1∶100接種于新鮮的LB培養液中培養6h至OD600≈0.6時，取菌液經梯度稀釋后分別對大小約0.5cm2的煙草葉片進行不同時間浸染。結果表明，用經20倍稀釋后的菌液浸染的煙草葉片其轉化率達97%以上，且不同時間浸染的處理間無顯著差異，培養基中激素濃度以6-BA 1.5mg/L IAA 0.5mg/L為宜。

關鍵詞：漢灘病毒；嵌合抗體；轉基因植物；煙草

中圖分類號 R392 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）23-0046-05

Transformation of Full-length Gene of Mouse/human Chimeric Antibody against HTNV into Plants

Xie Weiqiang

（Yangling Institute of Quality and Technology Inspection，Yangling 712100，China）

Abstract：In this thesis Agrobacterium-mediated transformation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens containing mouse/human chimeric antibody gene against Hantaan virus was studied.Overnight cultured Agrobacterium tumefaciens containing recombinant plasmid was inoculated in fresh LB culture medium by the Ratio of 1∶100 and incubated till OD600 was about 0.6.Then the pellet of Agrobacterium tumefaciens was diluted gradiently and used to immerse the tobacco leaf discs about 0.5cm2 for different length of time.The results showed that the highest transformation efficiency was obtained with the tobacco leaves immersed by the Agrobacterium tumefaciens which had been diluted 20 times，that no less than 97% leaf discs callused.There were no significant differences among treatments for different immersing time.In addition，it was appropriate for callusing of tobacco leaf discs when the concentrations of 6-BA being 1.5mg / L and IAA being 0.5mg / L.

Key words：Hantaan virus；Chimeric antibody；Transgenic plant；Tobacco

1 引言

1.1 腎綜合征出血熱（HFRS）的研究意義及其進展 腎綜合征出血熱（HFRS）是一類以發熱、出血和腎臟損害為主要臨床特征的疾病。全世界90%以上的HFRS病例發生在我國，疫情非常嚴重，年發病人數超過10萬，且以青壯年居多，死亡率約5%～10%。HFRS已成為目前我國死亡人數最多的急性病毒性傳染病之一。漢灘病毒（HTNV）隸屬于布尼亞病毒科漢灘病毒屬，在我國發生的HFRS主要由該病毒引起，因此對HTNV的研究具有十分重要的意義。

對HFRS的治療，迄今還沒有特異有效的治療藥物，臨床上主要是采取血液透析等方法進行對癥處理，費用昂貴。目前，對該病治療制劑研究最多的是抗HTNV鼠源性單克隆抗體（mAb），但由于其在人體內應用易導致人抗鼠抗體的產生，不僅影響其治療效果，而且還存在一定的安全性問題。而人源性mAb由于存在制備困難，產量低的問題，也難以廣泛應用。基因工程抗體主要是在原核及真核系統中表達，原核表達系統雖然表達產量高，但由于其加工修飾功能限制，會影響表達產物的生物學特性；而真核表達又存在表達產量低的難題[1]。運用合適的植物表達系統表達抗體不僅表達產量高，而且由于植物表達系統表達的抗體是以雙體形式存在，因此表達產物的親和力也較高。采用新興的植物表達技術，高效表達鼠/人嵌合植物抗體，不僅可以克服上述鼠源性mAb的缺點，而且具有高表達量、低成本等優點。

1.2 植物轉化的影響因素 自20世紀80年代首次獲得轉基因煙草植株以來，轉基因技術日益成熟和集中，針對不同植物也建立了切實可行的轉化方法。目前，轉基因植物開發主要采用農桿菌介導法和基因槍介導法。其中，農桿菌介導的遺傳轉化早期主要應用于雙子葉植物，近些年來在單子葉植物上也已取得突破。利用農桿菌介導法已向植物中導入了多個功能基因，獲得了大量轉基因植株，培育了一些轉基因新品種。利用農桿菌介導法可以獲得多種可穩定遺傳的植株，但其轉化條件因轉化對象的不同而有所差異。

1.2.1 菌液濃度和浸染時間對植物轉化的影響 農桿菌懸浮液濃度及浸染時間是影響遺傳轉化最重要的2個因素。碭山酥梨離體葉片的外植體經過不同濃度的菌液浸染不同的時間處理，再進行選擇培養，結果表明：當OD600=0.5，浸染時間為5min時，再生頻率最高[1]。在農桿菌介導的小麥遺傳轉化試驗中，當OD600=0.5時，Alondra's中的gus基因瞬時表達頻率最高，而揚麥15則在OD600=1時表現最高的gus基因瞬時表達頻率。當浸染時間為10min時，揚麥15和Alondra's都表現最高的gus基因表達率。而降低或延長浸染時間都會使表達率降低[3]。根癌農桿菌浸染金邊狗牙根遺傳轉化表明，用根癌農桿菌浸染10min，GUS瞬間表達效果最好[4]。不同濃度的農桿菌菌液對草地早熟禾浸染表明，農桿菌菌液濃度OD600=0.6時草地早熟禾的轉化率最高。而當農桿菌濃度OD600大于0.6轉化率則下降[5]。

1.2.2 共培養對植物轉化的影響 有研究表明在微孔濾膜上進行共培養轉化效率顯著高于在玻璃紙上進行共培養的轉化效率。共培養溫度為20℃時轉化效率最高[5]。碭山酥梨離體葉片外植體用OD600=0.5的農桿菌浸染5min，然后共培養，結果表明，共培養48h時的再生頻率較高[2]。小麥愈傷組織經農桿菌浸染后，在相同條件下共培養1～3d后進行gus染色，結果表明當共培養1d時，揚麥15中的gus基因瞬時表達率最高；而Alondra's中gus基因表達率共培養2d時達到最高。對辣椒的研究表明，若共培養3d，比較有利于提高轉化率[5]。此外有報道稱共培養時光照時間對表達率有一定影響。在全天光照條件下，金邊狗牙根愈傷組織GUS瞬間表達率最高，但與每天16h光照處理差異不明顯。這2種條件下GUS瞬間表達率均明顯高于暗培養[5]。Kenjirou Ozawa等用富含N6和DKN的濕潤濾紙培養基代替固體培養基，將水稻愈傷組織和農桿菌進行共培養，在水稻上成功的獲得了高效率的轉化體系[7]。

1.2.3 乙酰丁香酮（AS）對植物轉化的影響 乙酰丁香酮可以誘導活化Vir區基因，使農桿菌T-DNA更易進入植物基因組并與其整合。因此，乙酰丁香酮也是影響遺傳轉化的重要因素之一[8]。碭山酥梨離體葉片外植體經農桿菌浸染后添加不同濃度的AS，其再生頻率顯著提高；而當AS濃度為100μmol/L時，再生頻率最高。對于小麥的研究表明，AS的濃度以100μmol/L為宜[2]。對辣椒進行實驗表明，在浸染液中加不同濃度的AS可以不同程度地提高轉化效率，當AS濃度在100μmol/L時達到較好的轉化效果[9]。

1.2.4 預培養對植物轉化的影響 預培養有利于農桿菌更好地將外源基因整合到植物基因組內，是影響植物遺傳轉化的又一重要因素。外植體預培養可以促進細胞分裂，分裂狀態的細胞更容易與外源DNA整合，因而可以提高轉化效率[10-11]。預培養也可以在一定程度上減少傷害脅迫而有利于農桿菌的侵[11]。子葉葉盤在接種農桿菌前，在預培養2d后，芽誘導分化率高，達到77.6%。預培養1～7d的栗子香胚性懸浮細胞的轉化結果表明，預培養2d的胚性懸浮細胞，GUS瞬時表達率最高，達71.13%[9]。

1.2.5 其他影響因素 除了研究共培養、菌液濃度和浸染時間、乙酰丁香酮（AS）、預培養對植物轉化的影響外，一些學者考察了諸如負壓強度、超聲波處理時間、懸浮培養天數、抗生素選擇壓等因素對植物轉化的影響。子葉葉盤轉化結果表明，預培養3d的胚性懸浮細胞，GUS瞬時表達率最高[12]。對金邊狗牙根進行不同負壓處理表明，給予一定的負壓處理有利于提高轉化率，但負壓過大則會對植物細胞本身產生較大的傷害甚至導致細胞死亡[5]。農桿菌對苦豆子子葉和下胚軸的轉化率隨超聲波處理時間的延長逐漸遞增，當超聲波處理25min時GUS瞬時表達率最高，再延長處理時間轉化率下降[13]。王欣等在對甘薯聲波輔助的農桿菌遺傳轉化方法（SAAT）條件的優化的研究中對懸浮培養不同天數的胚性懸浮細胞進行遺傳轉化。GUS瞬時表達率檢測結果表明，培養105d的愈傷GUS瞬時表達率最高。在各培養階段不同濃度的羧芐青霉素（Carb）均不影響未浸染農桿菌的胚性愈傷生長及植株再生，濃度為100mg/L反而對細胞的生長有明顯的促進作用。不同培養階段的胚性愈傷在含Kan0～50mg/L的培養基上培養結果表明，14d內Kan對愈傷無明顯影響，28d后影響則逐漸明顯[12]。

1.3 擬開展研究的內容及方法 農桿菌介導的轉化技術已成功運用到植物的遺傳轉化中。農桿菌介導的外源基因轉化是農桿菌菌株與植物細胞之間相互作用的結果，凡是能夠影響植物細胞轉化應答能力和農桿菌侵染能力以及轉化體再生能力的各種因素都會對其轉化效果產生影響。因此，農桿菌轉化頻率的提高依賴于對各種影響因子的優化和轉化條件的改善。就菌懸液濃度及浸染時間對轉化率影響方面來看，大多數植物在OD600=0.6浸染10min時能達到較高的轉化率。但考慮到種屬特異性，我們有必要在現有條件下對菌懸浮液濃度及浸染時間作進一步研究。

本研究將改造過的抗HTNV鼠/人嵌合抗體基因導入農桿菌進而通過葉盤法轉化煙草，通過抗生素對轉基因植株進行初步篩選，獲得抗性植株，并初步檢測外源基因在煙草中的表達。繼而，建立適合本實驗室的煙草轉化與再生系統，確定本實驗室煙草的最優轉化條件，獲得可穩定表達抗HTNV中和性鼠/人嵌合抗的抗性植株。本實驗著重對菌液濃度及浸染時間進行了研究。待含有重組質粒的農桿菌培養至0.6時，取菌液梯度稀釋后分別用于對煙草葉片進行不同時間的浸染。運用組織培養技術，將浸染后的煙草葉片經共培養、選擇培養后統計其在不同條件下的轉化率。另外，本實驗對部分葉片采用不同的共培養時間探究了共培養時間對煙草轉化的影響。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 植物材料 無菌煙草苗CV品種。

2.1.2 菌種 農桿菌EHA105，由本實驗室保存。

2.1.3 質粒 抗漢灘病毒鼠/人嵌合抗體植物表達載體3G1MH-pCAMBIA2301，由第四軍醫大學微生物學教研室構建。

2.2 實驗儀器 臺式高速離心機（Eppendorf），數顯振蕩培養箱（蘇坤），超低溫冰箱（中科美菱），電泳儀（北京鼎國1100型），PCR儀（MJ），光照培養箱，超凈工作臺，數碼凝膠成像系統（Wealtech公司）。

2.3 實驗試劑

2.3.1 質粒提取試劑 質粒小量提取試劑盒，購自博大泰克公司。

2.3.2 抗生素：利福霉素（rif） 工作濃度50mg/L；卡那霉素（kan）：工作濃度50mg/L；羧芐青霉素（carb）：工作濃度50mg/L 均為Sigma產品。

2.3.3 轉化液 MS+AS（200μM/L）+二巰基乙醇（0.003%）。

2.3.4 培養基 （1）LB液體培養基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，pH≈7.0。（2）LB固體培養基：胰蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，瓊脂粉0.7%，pH≈7.0。（3）MS培養基：大量元素+微量元素+鐵鹽+有機元素+蔗糖（3%）+瓊脂（0.7%），pH≈5.8。（4）共培養培養基：MS+AS（40μM/L）+6-BA+IAA。（5）選擇培養基：MS+Kan（100mg/L）+carb（200mg/L）+6-BA+IAA。

2.4 實驗方法

2.4.1 制備農桿菌轉化子及鑒定

2.4.1.1 農桿菌EHA105的培養 取-70℃保存的農桿菌EHA105菌株劃線接種于含rif 50mg/L的LB平板上，28℃培養36～48h后挑取單菌落，接種于6ml含rif 50mg/L的LB液體培養基中，28℃ 200r振蕩培養24h后，按1∶100轉接于新鮮LB液體培養基中繼續培養6h（OD600≈0.6）。

2.4.1.2 農桿菌感受態細胞的制備 取新鮮轉接的培養菌液1.5mL，10 000r離心1min，棄上清；用100μL的TSS重懸菌體沉淀，制備的感受態細胞置于冰上現用或-70℃凍存。

2.4.1.3 重組質粒向農桿菌感受態細胞的轉化（凍融法） 向農桿菌感受態細胞（100μL）中加入10μL重組質粒3G1MH-pCAMBIA2301，混和均勻，置于液氮中速凍3min，立即28℃水浴5min，28℃200r振蕩培養5h后，涂布于含rif 50mg/L、kan 50mg/L的LB平板上，培養48～72h[14]。

2.4.1.4 農桿菌轉化子的鑒定 從平板上挑取已轉化的農桿菌單菌落，接種于10mL的含rif 50mg/L、kan 50mg/L的LB液體培養基中，28℃振蕩培養過夜，留取甘油菌備用，并提取質粒。提出的質粒進行PCR擴增。PCR擴增產物經電泳鑒定。

（1）重鏈Fd基因的擴增：

引物：

P1：5′-ATTCTAGAGCCATGGCCGAGGCGCAGCTG-3′

P2：5′-TCACTAGTTCATTTGTCACAAGATTTGGC-3′

反應體系（50μL）：

①H2O 35.0μL；②10×PCR Buffer 5.0μL ③Mgcl2 3.0μL；④dNTP 2.0μL；⑤P1 2.0μL，P2 2.0μL；⑥質粒DNA 0.5μL；⑦TaqDNAPolymerase 0.5μL。

PCR擴增條件：

預變性：95℃10min；循環擴增：94℃ 1min，50℃ 1min，72℃1min，30個循環；延伸：72℃ 10min。

（2）輕鏈全基因的擴增：

引物：

PⅠ：5′-GCGCCATGGACATTGTGATGACGCAG-3′

PⅡ：5′-TCCACTAGTTTAACACTCTCCCCTGTT-3′

反應體系（50μL）：

①H2O 35μL；②10×PCR Buffer 5.0μL③Mgcl2 3.0μL；④dNTP 2.0μL；⑤PⅠ 2.0μL，PⅡ 2.0μL；⑥質粒DNA 0.5μL；⑦TaqDNAPolymerase 0.5μL。

PCR擴增條件 預變性：95℃10min；循環擴增：94℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環；延伸：72℃10min。

2.4.2 農桿菌介導的葉盤法轉化 （1）將含有重組質粒的農桿菌EHA105培養24h后按1：100接種于新鮮的LB培養液中培養6h至OD600≈0.6，分別取2mL離心，用2mL轉化液重懸菌體，取菌液經梯度稀釋后分別對大小約0.5cm2的煙草葉片進行不同時間浸染。具體處理如表1所示。

（2）用無菌濾紙吸干煙草葉片表面的菌液。

（3）共培養：將浸染過的煙草葉片接種于共培養基上，22℃黑暗培養。

（4）選擇培養：將經共培養數天的煙草葉片轉入含有Kan和carb的誘導愈傷組織及芽的選擇培養基上進行培養（溫度：22℃光周期：暗8h；光16h）。

3 實驗結果

3.1 農桿菌的轉化提取及鑒定 利用TSS凍融法將3G1MH-pCAMBIA2301質粒轉入農桿菌EHA105中，提取質粒，插入序列經PCR擴增鑒定，結果如圖1所示，分別擴增出大小為750bp左右的片段。與預期相符，說明重組質粒3G1MH-pCAMBIA2301已成功轉入農桿菌。

3.2 農桿菌介導的煙草葉片轉化 將煙草葉片接種到誘導愈傷組織培養基上，培養3d后，部分葉片的邊緣開始膨脹，再繼續培養，切塊膨大成圓拱形，并開始出現有綠色半透明的愈傷組織。愈傷組織生長迅速，根據色澤、質地，可分為以下2種類型：第一類，開始透明狀后轉為褐色、質地疏松的愈傷組織；第二類，開始為黃綠色后轉為綠色致密愈傷組織。

3.2.1 菌懸浮液濃度及浸染時間對出愈率的影響 取OD600≈0.6的含有重組質粒的農桿菌EHA105菌液經梯度稀釋后，分別對大小約0.5cm2的煙草葉片進行不同時間浸染。葉片共培養3d后轉入選擇培養基培養，其出愈率如表2所示，方差分析結果如表3所示。

3.2.2 共培養時間對出愈率的影響 對經30倍稀釋菌液浸染的煙草葉片分別進行不同時間的共培養后轉入選擇培養基培養。觀察發現不同的處理間葉片被包埋的程度不同，隨著浸染時間的縮短，農桿菌長勢呈下降趨勢。

3.2.3 激素濃度對出愈的影響 將浸染過的煙草葉片共培養后轉入激素濃度為：6-BA 2.0mg/L、IAA 0.5 mg/L 的選擇培養基培養，結果葉片均未出現愈傷組織。將激素濃度調整為：6-BA 1.5mg/L、IAA 0.5mg/L后部分葉片產生愈傷組織。

4 討論

在農桿菌介導的植物遺傳轉化過程中，由于受體組織是直接浸染在農桿菌懸浮液之中，因此，菌液濃度以與遺傳轉化效率有著最為直接的關系。當菌液濃度過低時，會由于單位體積農桿菌細胞數過少而達不到浸染效果，以至于遺傳轉化效率較低；過高則會由于農桿菌細胞的過度生長而影響受體細胞的正常生長及分化，也達不到較高的遺傳轉化效率。與菌液濃度最為密切的是浸染時間，因此，需要將2個因素綜合考慮，當菌液濃度過大時，可以適當減少受體組織浸染的時間；當菌液濃度過小時，可以適當延長浸染時間。

本研究中，將含有重組質粒的農桿菌過夜培養后按1∶100接種于新鮮的LB培養液中培養6h至OD600≈0.6時取菌液經梯度稀釋后分別對大小約0.5cm2的煙草葉片進行不同時間浸染。結果用經20倍稀釋后的菌液浸染的煙草葉片其轉化率達97%以上，且不同時間浸染的處理間無顯著差異。農桿菌懸浮液濃度及浸染時間是影響遺傳轉化最重要的2個因素，但相比之下菌懸浮液濃度對轉化的影響更為明顯。

將含重組質粒的菌體振蕩培養過夜，取菌液2mL離心后用轉化液重懸菌體，并進行20～40倍的稀釋，黑暗處22℃共培養3d，葉片常會被農桿菌包埋，而導致實驗失敗。分析原因：其一，可能是菌液濃度過大，導致經其浸染的葉片上菌濃度過高，從而快速生長將組織葉片包埋；其二，可能是共培養的時間過長，應適當縮短共培養的時間，當共培養至肉眼可見的微小菌落出現時，立即轉入選擇培養基中；其三，在選擇培養的過程中，可能是抗生素的濃度較小，而無法將農桿菌抑制，可將抗生素的濃度加大或是采用另一種更有效的廣譜抗生素。

雖然有文獻稱煙草轉化再生系統中激素濃度以6-BA 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L時再生率最高[15]。但本研究中煙草轉化后按其再生條件進行再生，再生率為0%，然將激素濃度調整為6-BA 1.5mg/L+IAA 0.5mg/L時再生情況良好。出現以上情況可能是因為加入抗生素后使再生條件發生變化進而影響了煙草的再生。

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（責編：張宏民）