茶湯中兒茶素與生物堿測(cè)定的HPLC法及其優(yōu)化

摘 要 目的：建立茶湯內(nèi)含物質(zhì)兒茶素和生物堿檢測(cè)方法體系，為研究茶湯滋味物質(zhì)做基礎(chǔ)。方法：以X-select-T3（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)waters）為色譜柱，流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇；甲醇洗脫方式：0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），檢測(cè)波長(zhǎng) 275 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30℃。利用保留時(shí)間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量，分析茶湯滋味物質(zhì)兒茶素組分和生物堿類物質(zhì)。結(jié)果：兒茶素組分和生物堿回歸方程相關(guān)性系數(shù)都在0.999 0以上，有良好的線性關(guān)系，各組分加樣回收率為103.68%～82.94%，RSD為0.23%～3.31%。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于茶湯滋味物質(zhì)兒茶素組分及生物堿的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 茶湯；HPLC；兒茶素；生物堿；測(cè)定

中圖分類號(hào)：TS272；O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.13.001

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170508.2151.027.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-5-8 21：51：00

茶湯中苦澀滋味主要成分為茶多酚、生物堿。兒茶素類是茶葉多酚類最主要的成分，占多酚類總量的70%～80%。兒茶素具有苦味和澀味，兒茶素滋味閾值較低，特別是酯型兒茶素閾值更低，在茶湯中含量較高，因此是影響茶湯苦澀味的關(guān)鍵化學(xué)成分[1]。施兆鵬等發(fā)現(xiàn)以兒茶素為主體的茶多酚類物質(zhì)對(duì)茶湯滋味的影響可能存在著明顯的二次曲線關(guān)系[2]。茶葉中生物堿主要有咖啡堿、可可堿和茶堿，咖啡堿是茶葉中重要滋味物質(zhì)[3]。楊亞軍等研究表明，咖啡堿含量在3.8%～4.5%范圍內(nèi)，不僅可以降低茶湯的苦澀味還能提高鮮爽度，當(dāng)咖啡堿含量超過4.5%，非絡(luò)合的咖啡堿越多，使得苦味越重[4]。目前，檢測(cè)兒茶素和生物堿類物質(zhì)主要用高效液相色譜法，但對(duì)于茶湯中兒茶素和生物堿的測(cè)定目前尚無國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)范。為了更好地分析茶湯中的兒茶素和生物堿，本試驗(yàn)對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱的選擇、色譜條件等條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，為快速檢測(cè)茶湯中的滋味物質(zhì)提供參考。

1材料與方法

1.1材料

甲酸（分析純，上海國(guó)藥），甲醇（色譜級(jí)，merck），乙腈（色譜級(jí)，merck）；生物堿：咖啡堿Caf（Sgima，>99%），可可堿TB（TRC，>99%），茶堿TP（EP，>99%）；兒茶素組分：表兒茶素EC（Sgima，>99%），兒茶素C（Sgima，>99%），表沒食子兒茶素EGC（Sgima，>99%），表沒食子兒茶素沒食子酸酯EGCG（Sgima，>99%），沒食子酸GA（Sgima，>99%），表兒茶素沒食子酸酯ECG（Sgima，>99%）。

1.2主要儀器

Waters2695高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），2998型PDA檢測(cè)器（美國(guó)Waters公司）；色譜柱ZORBAX-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Agilent）；X-select-T3（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)Waters）；FA1004型電子天平（北京，賽多利斯有限公司）；pH計(jì)（ohrus）；UNIQUE-R20純水系統(tǒng)（廈門，銳思捷科學(xué)儀器有限公司）；HWS-16電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；微量移液（Eppendorf Research）；SB-5200DT型超聲波清洗機(jī)（寧波，新芝生物科技股份有限公司）；微型研磨PULVERISETTE 23（德國(guó)飛馳，F(xiàn)RITSCH），Sartorius MA150水分測(cè)定儀（德國(guó)，賽多利斯）。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 液相色譜流動(dòng)相配制

流動(dòng)相A：2 mL甲酸加入100 mL容量瓶中，水定容至刻度，搖勻，過0.45 μm的膜；流動(dòng)相B：甲醇。

對(duì)照品溶液分別取Caf， TB， TP， EC， C， EGC， EGCG， GA， ECG適量，用30%甲醇水超聲溶解，配制成1 000， 500， 600， 500， 200， 500， 400， 600， 500 μg·mL-1做儲(chǔ)備液，放置在-20℃?zhèn)溆谩Ｈ?chǔ)備液適量，適度稀釋成不同濃度的對(duì)照品溶液；另取9種對(duì)照品儲(chǔ)備液混合成混合對(duì)照品，放置在4℃保存。

1.3.2 供試品溶液

參照GB/T8303-2003，取適量的茶鮮葉，用微型研磨機(jī)適度粉碎茶樣至粉末；茶湯制備參照Zhang Y N方法[5]略有改進(jìn)，具體操作如下：稱取茶樣0.20 g，加入10 mL沸水，浸提5 min，迅速在冰浴中冷卻到室溫，離心吸取上清液，定容至100 mL，用0.22 μm微孔水系濾膜過濾，備用。

1.3.3 色譜條件單因素試驗(yàn)

對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)、色譜柱選擇、流動(dòng)相、流動(dòng)相pH值、流動(dòng)相流速、柱溫進(jìn)行單因素色譜條件優(yōu)化篩選。

2結(jié)果與分析

2.1檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

取對(duì)照品溶液，置于二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行紫外掃描，設(shè)置全波長(zhǎng)（220～400 nm）掃描，提取9種物質(zhì)各個(gè)對(duì)應(yīng)3D光譜圖吸收峰最大時(shí)候的波長(zhǎng)（見圖1）。結(jié)果表明，275 nm能使9種組分有較強(qiáng)的靈敏度和近似的響應(yīng)值，且干擾度小，分離基線較穩(wěn)定。在樣品定性過程中，采用保留時(shí)間和光譜圖同時(shí)作為依據(jù)，可提高目標(biāo)物質(zhì)定性的準(zhǔn)確性。

2.2色譜條件

2.2.1 色譜柱的選擇

參照文獻(xiàn)[6～8]的洗脫方式，對(duì)流動(dòng)相略做改動(dòng)。采用流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇，梯度洗脫0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫32℃，流速1 mL·min-1。選用ZORBAX ODS與X-select-T3兩種色譜柱對(duì)9種物質(zhì)進(jìn)行分離，由于兩種色譜柱填料的類型和孔徑不同，因此9種物質(zhì)的出峰順序不同。此外，出峰順序的不同，還受到流動(dòng)相、pH值、柱溫等影響。如圖1的結(jié)果表明，對(duì)ZORBAX ODS色譜柱采用梯度洗脫的方式，TP和EGCG很難分離，同時(shí)Caf出現(xiàn)拖尾，X-select-T3對(duì)9種物質(zhì)的分離效果雖基本不錯(cuò)，但Caf和EC的尚未達(dá)到基線分離，分離度<1.5，因此后續(xù)用X-select-T3，從洗脫方式、流動(dòng)相pH值、柱溫與流速等方面優(yōu)化。

2.2.2 柱溫

選用X-select-T3設(shè)置不同的柱溫（36℃，34℃，32℃，30℃）對(duì)9種物質(zhì)進(jìn)行分離優(yōu)化。色譜條件：梯度洗脫0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流速1 mL·min-1，結(jié)果表明，在柱溫36℃時(shí)Caf和EC完全重合，未分離。隨著柱溫的降低，Caf和EC逐漸達(dá)到基線分離，30℃的時(shí)候最佳（見圖3）。

2.2.3 洗脫方式

因物質(zhì)EGC， C， ECG， Caf在6 min之后出峰，在優(yōu)化其梯度洗脫方式時(shí)，選擇在6 min之前（5 min）時(shí)，6 min之后（7 min、9 min）時(shí)對(duì)其進(jìn)行流動(dòng)相比例優(yōu)化，以確定物質(zhì)分離的最佳梯度。選用X-select-T3設(shè)置不同的梯度，梯度洗脫方式A：0 min（83%A， 17%B）-5 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B）；B：0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B）對(duì)9種物質(zhì)進(jìn)行分離。進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫30℃，流速1 mL·min-1。圖4結(jié)果表明，對(duì)X-select-T3采用0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B）梯度洗脫的方式，Caf和EC分離，但EGC， C， ECG的峰形不佳，有拖尾現(xiàn)象，待進(jìn)一步調(diào)試。

2.2.4 流速

選用X-select-T3設(shè)置不同的流速，0.8 mL·min-1，1 mL·min-1，1.2 mL·min-1對(duì)9種物質(zhì)進(jìn)行分離。色譜條件：梯度洗脫0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，柱溫30℃。圖5結(jié)果表明，對(duì)X-select-T3采用梯度洗脫的方式，流速在0.8 mL·min-1時(shí)，Caf和EC未完全分離；流速在1.0 mL·min-1和1.2 mL·min-1時(shí)，Caf和EC均達(dá)到基線分離。在1.2 mL·min-1時(shí)，3.7～12.5 min 9種物質(zhì)都得到分離，流速越高，出峰越快。但隨著流速的增加，色譜柱柱壓升高，影響柱效，綜合考慮最終選擇1.0 mL·min-1。

2.2.5 pH值

根據(jù)X-select-T3色譜柱對(duì)pH值的使用范圍（2～8）設(shè)置pH值為2.2， 2.3， 2.5；色譜條件：梯度洗脫0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波275 nm，柱溫30℃，流速1 mL·min-1。圖6結(jié)果表明，pH值對(duì)“C和TP”“Caf和EC”的分離有影響。pH=2.2時(shí)，C和TP分離效果好，Caf和EC分離效果不好；pH=2.5時(shí)，C和TP分離效果不好，Caf和EC分離效果好。同時(shí)，在酸性條件下，測(cè)定兒茶素組分更加穩(wěn)定，而且可以改善峰形。綜合考慮選擇pH=2.3。

2.3方法學(xué)研究

2.3.1 系統(tǒng)適用性

在優(yōu)化條件下，以X-select-T3（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)waters）為色譜柱，流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫方式：0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30℃。樣品色譜圖中9種物質(zhì)基本上得到分離，可進(jìn)行定性定量分析。

2.3.2 線性范圍考察

在優(yōu)化條件下，將不同濃度的兒茶素與生物堿標(biāo)準(zhǔn)液分別以10 μL進(jìn)樣，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，由回歸分析結(jié)果可知：線性良好。適度稀釋對(duì)照品，信噪比（S/N）≥3∶1時(shí)，記錄檢出限，信噪比（S/N）≥10∶1時(shí)，記錄定量限，結(jié)果列于表1。

2.3.3 精密度試驗(yàn)

按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照優(yōu)化下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算得各個(gè)物質(zhì)峰面積及其保留時(shí)間的RSD分別在0.12%～1.42%、0.18%～4.50%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，于-4℃冰箱中放置，分別于0， 2， 8， 12 h進(jìn)樣，據(jù)測(cè)定結(jié)果計(jì)算得各個(gè)物質(zhì)峰面積及其保留時(shí)間的RSD分別在0.25%～0.47%、0.16%～6.47%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

按“1.3.2”項(xiàng)下方法平行制備5份溶液，按優(yōu)化下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。利用外標(biāo)法算出其含量，其RSD值在1.88%～9.96%，均低于10%，表明該方法的重現(xiàn)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)

按“1.3.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，然后按優(yōu)化下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。取已知含量的樣品，各精密加入3份不同濃度對(duì)照品混合溶液。結(jié)果表明，9種物質(zhì)的平均回收率為103.68%～82.94%，RSD為0.23%～3.31%（n=3），說明方法穩(wěn)定可靠（見表2）。

2.4 樣品測(cè)定

取綠茶、白茶、紅茶、烏龍茶、黑茶、黃茶，按照“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，按照外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見表3。可見，這種檢測(cè)方法同樣適用于其他茶類茶湯的檢測(cè)。

3 小結(jié)與討論

本研究表明，以X-select-T3（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國(guó)waters）為色譜柱，流動(dòng)相A：2%甲酸；流動(dòng)相B：甲醇；洗脫方式：0 min（83%A， 17%B）-9 min（73%A， 27%B）-15 min（58%A， 42%B）-18 min（83%A， 17%B），檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm，流速1 mL·min-1，柱溫30℃。利用保留時(shí)間和光譜圖定性，外標(biāo)法定量，分析茶湯浸出物兒茶素和生物堿，兒茶素組分和生物堿回歸方程相關(guān)性系數(shù)都在0.999 0以上，有良好的線性關(guān)系，各組分加樣回收率為103.68%～82.94%，RSD為0.23%～3.31%。本方法操作簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，可用于茶湯滋味物質(zhì)兒茶素組分及生物堿的含量測(cè)定。茶葉是一種飲料，以品飲方式消費(fèi)，對(duì)茶湯中物質(zhì)含量的測(cè)定，可以為更好地真實(shí)反映物質(zhì)對(duì)口感的影響，為研究茶湯浸出滋味的研究提供基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：丁志祥）