細胞表面展示有機磷水解酶的研究概況

摘 要 近年來，有機磷水解酶越來越多地被展示到不同的細胞表面。對有機磷水解酶的細胞表面展示技術的原理，大腸桿菌、假單胞菌、酵母菌等幾種細胞表面展示有機磷水解酶系統(tǒng)的研究概況進行綜述。

關鍵詞 有機磷廢水；有機磷水解酶；細胞表面展示

中圖分類號：Q556 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.1.005

知網出版網址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170123.1746.007.html 網絡出版時間：2017-1-23 17：46：00

有機磷水解酶（EC 3.1.8.1）最早是從黃桿菌屬（Flavobacterium sp.）和缺陷假單胞菌屬（Pseudomonas diminuta）中分離出來的，能特異性水解一系列有機磷酯類物質。同時有機磷水解酶具有廣譜的底物特異性，能夠斷裂P-0、P-S、P-F和P-CN鍵，能夠催化甲基對硫磷、對硫磷、磷胺類等物質水解成對硝基苯酚和磷酯類物質，從而實現(xiàn)對有機磷農藥的降解，因此被廣泛地應用于有機磷廢水的處理[1]。目前，有機磷水解酶大量地用于有機磷廢水處理，但同時也存在一個問題，即有機磷水解酶是一個膜蛋白，在實際應用時需要用復雜的方法將其提取與純化出來，成本較高，并且在提取與純化的過程中酶易失活。盡管有報道稱可以通過基因工程技術對有機磷水解酶進行重組改造，使其能在胞內實現(xiàn)可溶性表達，但同樣也存在純化過程復雜、成本代價高、酶易失活等問題。近年來，細胞表面展示技術的發(fā)展克服了上述問題，即將有機磷水解酶展示到細胞表面，直接作為全細胞催化劑應用于有機磷農藥廢水的處理。為此，筆者對有機磷水解酶表面展示技術以及幾種常見的表面展示系統(tǒng)進行介紹，為更好地利用全細胞催化劑降解有機磷廢水提供一定的參考。

1有機磷水解酶的表面展示研究

1.1有機磷水解酶表面展示技術

細胞表面展示系統(tǒng)包含3個基本的元件：宿主菌、乘客蛋白、運載蛋白，其中宿主菌主要作為乘客蛋白和運載蛋白結合的載體，乘客蛋白是要展示到細胞表面的目的蛋白，運載蛋白主要是與乘客蛋白相結合，并將目的蛋白運送到細胞表面實現(xiàn)固定。細胞表面展示的過程實質是蛋白質跨膜轉運的過程，其中涉及到不同蛋白質分泌轉運。據(jù)報道，有機磷水解酶已經成功地展示到大腸桿菌、假單胞菌、酵母菌以及某些藻類中，并且展示到細胞表面的有機磷水解酶有較高的生物活性[2]。

1.2大腸桿菌表面展示有機磷水解酶

大腸桿菌因細胞結構較簡單，遺傳背景被研究得較為透徹。因此，常作為工程菌在研究中使用，大腸桿菌不僅可以高效地表達外源蛋白質，而且也成為最常用的細胞表面展示系統(tǒng)。

黎小軍等從黃桿菌ATCC27551中克隆出有機磷水解酶基因opd，并將其直接與XcmⅠ酶切去除Ampr抗性基因片段的pZXL-T載體相連，這樣opd基因被成功克隆于錨定單元Lpp-OmpA編碼序列下游，最后轉化至大腸桿菌BL21（DE3），經檢測發(fā)現(xiàn)，重組的大腸桿菌能表達產生51 kDa的融合蛋白，而且還具有全細胞生物活性。在以對氧磷為底物的酶活檢測實驗中，其酶活（酶活力單位定義為：每分鐘水解1 μmol對氧磷所需酶量）達到0.018 U/OD600，而作為對照的空宿主菌沒有檢測出有機磷水解酶活性[3]。

1.3酵母菌表面展示有機磷水解酶

在眾多的微生物表面展示系統(tǒng)中，釀酒酵母表面展示系統(tǒng)對蛋白的裝配有嚴格的調控，并且可以對展示的蛋白質進行一些修飾，這樣展示的蛋白質就具有更多的生物活性。同其他展示系統(tǒng)相比，其表面展示蛋白質分子量更大。因此，酵母表面展示系統(tǒng)也越來越廣泛地被應用。

Takeshi Fukuda等利用Flo1p錨定單元，構建了Flo1p-OPH重組質粒，成功地將有機磷水解酶展示到酵母表面。以對氧磷為底物，重組菌的酶活（酶活力單位定義為：每毫克細胞干重每分鐘生成1 nmol對硝基苯酚所需的酶量）達到2000 U/（mg細胞干重），這比之前報道的用GPI錨定單元，展示有機磷水解酶的全細胞生物酶催化活性高8倍[4]。因此，F(xiàn)lo1p錨定單元可以很好地用于有機磷水解酶表面展示。Xing-Xing Wang等以冰核蛋白N端序列作為錨定位點，將甲基對硫磷水解酶（MPH）展示到解脂耶氏酵母表面，經檢測發(fā)現(xiàn)，其全細胞甲基對硫磷水解酶的活力（酶活力單位定義為：在35℃時，每分鐘產生1 μmol對硝基苯酚所需要的展示酶量）為450.6 U/mL培養(yǎng)基，重組菌的最適溫度為40℃、最適pH為9.5，當重組菌的OD600為2.6、甲基對硫磷的濃度為100 mg/L時，在30 min以內大約有90.8%的甲基對硫磷被水解[5]。這表明重組菌全細胞生物催化活性很高。

1.4假單胞菌表面展示有機磷水解酶

惡臭假單胞菌是一種革蘭氏陰性菌，其自身結構較簡單，遺傳背景比較清楚，全基因組測序已經完成。由于惡臭假單胞菌具有較強的抗逆性能，能在極端環(huán)境條件下生長繁殖，若在其表面展示有機磷水解酶，那么重組菌就能更穩(wěn)定、更長時間地處理有機磷農藥廢水[6]。

Yulan Yuan等構建了具有綠色熒光蛋白、有機磷水解酶、冰核蛋白的融合載體（INPNC-OPH-GFP），并將其展示到具有降解對硝基苯酚（PNP）能力的惡臭假單胞菌（P. putida JS444）細胞表面，經檢測發(fā)現(xiàn)，展示到細胞表面的重組蛋白既沒有抑制細胞的生長，其本身的生物活性也幾乎沒有損失。在含有100 mg/kg對硫磷的培養(yǎng)基中培養(yǎng)重組工程菌，不到15 d的時間，對硫磷就被完全降解[7]。

2展望

有機磷水解酶表面展示技術發(fā)展越來越迅速，目前，有報道稱有機磷水解酶已經成功地展示到藍藻細胞表面，這種新的展示系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)，為有機磷水解酶的應用提供了新的方向。由于將有機磷水解酶展示到細胞表面，不僅克服了有機磷廢水不能透過細胞膜等問題，而且重組工程菌和廢水的接觸面積增大，這樣更有利于催化水解反應的進行，大大提高降解的效率。現(xiàn)在，因為重組菌具有全細胞生物催化活性，而被廣泛用于生物傳感器，用來檢測廢水中有機磷的濃度。但目前，有機磷水解酶表面展示技術還存在著不足，一些展示系統(tǒng)的遺傳背景較復雜、性能不穩(wěn)定，因此，展示的效率可能不高；另外，由于展示的過程復雜，成本高，限制了有機磷水解酶表面展示的大規(guī)模應用。今后，表面展示系統(tǒng)的開發(fā)將會是表面展示技術研究的重點。

參考文獻：

[1]全爽，李曄，金麗華，等.有機磷水解酶及其在傳感器應用中的研究進展[J].生態(tài)學，2015，34（1）：198?204.

[2]Sang Yup Lee， Jong Hyun Choi1， Zhaohui Xu. Microbial cell-surface display[J]. TRENDS in Biotechnology， 2003， 21（1）： 45-52.

[3]廖上鐵，黎小軍.有機磷水解酶及其細胞表面展示研究進展[J].安徽農業(yè)科學，2010，38（4）：2165-2167.

[4]Takeshi Fukuda， Kouta Tsuchiyama， Hirokazu Makishima， et al. Improvement in organophosphorus hydrolase activity of cell surface-engineered yeast strain using Flo1p anchor system[J]. Biotechnol Lett， 2010（32）： 655-659.

[5]Xing-Xing Wang， Zhe Chi， Shao-Guo Ru， et al. Genetic surface-display of methyl parathion hydrolase on Yarrowia lipolytica for removal of methyl parathion in water[J]. Biodegradation， 2012（23）： 763-774.

[6]張紅星，李茜茜，葉婷，等.細胞表面展示有機磷水解酶的惡臭假單胞菌的構建及全細胞酶活性分析[J].華中農業(yè)大學學報，2008，27（1）：65-70.

[7]Yulan Yuan， Chao Yang， Cunjiang Song， et al. Anchorage of GFP fusion on the cell surface of Pseudomonas putida[J]. Biodegradation， 2012（22）： 51-61.

（責任編輯：丁志祥）