生物信息學(xué)在幾丁質(zhì)酶研究中的應(yīng)用

摘 要 幾丁質(zhì)酶在防治病原真菌，抵御農(nóng)業(yè)害蟲，參與共生固氮及植物的生長調(diào)控等方面都有重要作用。幾丁質(zhì)酶種類較多，在大小、三維結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)和酶學(xué)性質(zhì)等方面差異較大，因而，采用生物信息學(xué)方法快速有效地分析幾丁質(zhì)酶是十分有必要的。對將生物信息學(xué)應(yīng)用到新型幾丁質(zhì)酶基因的發(fā)現(xiàn)、幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)分析、幾丁質(zhì)酶的后基因組分析以及在幾丁質(zhì)酶分析中出現(xiàn)的問題等幾方面進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞 生物信息學(xué)；幾丁質(zhì)酶；應(yīng)用

中圖分類號：Q811.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.1.024

知網(wǎng)出版網(wǎng)址：http：//www.cnki.net/kcms/detail/50.1186.s.20170123.1758.012.html 網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-1-23 17：55：00

幾丁質(zhì)酶是將幾丁質(zhì)及其他至少含有1個(gè)乙酰氨基葡萄糖殘基底物水解為低分子量的β-1，4-N-乙酰-D-葡聚糖的一類酶，主要作用為：（1）抑制植物病原真菌生長、抵御農(nóng)業(yè)害蟲對作物的傷害，提高植物抗性等。（2）作為生產(chǎn)幾丁寡糖重要的生物酶來源。針對幾丁寡糖在作為植物調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)植物生長和刺激植物幾丁質(zhì)酶活性迅速提高，增強(qiáng)植物的抗病能力等方面的應(yīng)用研究廣泛[1-2]。

生物信息學(xué)是以計(jì)算機(jī)和互聯(lián)網(wǎng)為工具，對采集的生物信息進(jìn)行存儲、檢索、分析和加工的新科學(xué)。它以核苷酸或氨基酸序列為基礎(chǔ)，分析序列中含有的生物信息。本文對生物信息學(xué)在幾丁質(zhì)酶中的應(yīng)用研究做一綜述。

1新型幾丁質(zhì)酶基因的發(fā)現(xiàn)

生物信息學(xué)是幾丁質(zhì)酶基因組研究的基礎(chǔ)，在新型的幾丁質(zhì)酶基因的發(fā)現(xiàn)中至關(guān)重要。

王艷君，楊謙等人[3]以角毛殼菌（Chaetomium cupreum）菌絲體時(shí)期的cDNA文庫中幾丁質(zhì)酶基因的EST序列（expressed sequence tag）為模板，采用inverse-PCR克隆出該基因cDNA序列，命名為chi58；接著進(jìn)行生物學(xué)分析，用多種分析手段預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)、功能和各種理化性質(zhì)。如：用ORF軟件尋找開放讀碼框；用Pfam進(jìn)行蛋白家族預(yù)測，以及用ProtParam軟件計(jì)算蛋白的分子量及等電點(diǎn)；用NCBI BlastP進(jìn)行同源分析，查找相似序列；再用clustalX對所選基因序列進(jìn)行多序列比對，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹等。部分結(jié)果表明：該基因序列含有3個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子，共編碼533個(gè)氨基酸，且氨基酸序列不保守，相似度最高僅為75%，推測該蛋白可能為新的幾丁質(zhì)酶家族。通過預(yù)測chi58蛋白合成后的化學(xué)修飾位點(diǎn)，可確定其體外表達(dá)體系，能有效提高該蛋白產(chǎn)物在體外的活性。因此，采用生物信息學(xué)技術(shù)來分析幾丁質(zhì)酶及其酶學(xué)性質(zhì)，為異源表達(dá)、提取純化及大量制備幾丁質(zhì)酶及研究它的相關(guān)功能提供了理論支持[4]。

2幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)分析

幾丁質(zhì)酶是一種復(fù)合酶，目前只得到少量的18家族幾丁質(zhì)酶或者幾丁質(zhì)酶類似蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，其中生物信息學(xué)在幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)預(yù)測中能起到了重要作用，這為進(jìn)一步了解幾丁質(zhì)酶中各種蛋白的生物學(xué)功能提供了依據(jù)。

蘇亞春等[5]在進(jìn)行甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的克隆和功能研究時(shí)，采用生物信息方法分析了DNA及蛋白序列組成、開放閱讀框的查找和翻譯、編碼蛋白的理化性質(zhì)等，它們分別由 DNA star軟件及ORF Finder、Prot-Param、pL/Mw等在線工具完成；此外，利用在線工具SignalP 3.0 Server、ExPASy -ProtScale、psort、SOPMA和ESyPred3D、Blast和Vector NTI等軟件分別分析了信號肽、親水性/疏水性、蛋白的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)二級及三級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)和DNA序列的同源性比對及多序列比對等[6]。

3幾丁質(zhì)酶的后基因組分析

隨著生物信息學(xué)的發(fā)展，人們對幾丁質(zhì)降解機(jī)制的認(rèn)識不再停留在單個(gè)基因作用的水平上，而已上升到系統(tǒng)作用水平。涂洪濤等[7]采用逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)，從煙夜蛾表皮組織總RNA中擴(kuò)增到幾丁質(zhì)酶基因的cDNA片段，獲得了Has-Chit基因的完整序列，采用ClustalW和Genedoc軟件對煙夜蛾及其它17個(gè)相關(guān)種的昆蟲幾丁質(zhì)酶進(jìn)行多重聯(lián)配，結(jié)果表明：不同屬、種昆蟲間幾丁質(zhì)酶基因有很大差別，其中煙夜蛾與棉鈴蟲序列相似性高達(dá)99%，與其他的16個(gè)種序列相似性僅為65%～76%。通過采用DNAman軟件等構(gòu)建不同來源的幾丁質(zhì)酶氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，表明煙夜蛾與棉鈴蟲親緣關(guān)系最近。這一研究表明，各種類型昆蟲幾丁質(zhì)酶基因有著獨(dú)特的不可替代的作用，這些幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用才使得昆蟲能在生長發(fā)育過程中幾丁質(zhì)的代謝水平保持平衡。

4幾丁質(zhì)酶研究中出現(xiàn)的問題

4.1幾丁質(zhì)酶的分類問題

幾丁質(zhì)酶的分類主要是通過生物信息學(xué)工具對不同種類的幾丁質(zhì)酶進(jìn)行比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析來劃分的，但由于不同生物信息學(xué)軟件標(biāo)準(zhǔn)不同，使得分析結(jié)果存在一定的差異，這對幾丁質(zhì)酶的研究會造成一定的影響。

4.2對幾丁質(zhì)酶的協(xié)同作用機(jī)制研究力度不夠

隨著生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，結(jié)合核磁共振、生物芯片、RNA干擾、蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析等技術(shù)，有助于我們深入認(rèn)識幾丁質(zhì)酶的表達(dá)、調(diào)控、功能及其相互間的作用機(jī)理。但目前實(shí)驗(yàn)研究方法進(jìn)展比較緩慢，有關(guān)幾丁質(zhì)酶蛋白相互作用的數(shù)據(jù)庫不夠完善。（1）如很多細(xì)菌分泌的幾丁質(zhì)酶不止1種，探討不同幾丁質(zhì)酶在細(xì)菌生長的不同階段的作用以及不同幾丁質(zhì)酶之間的協(xié)調(diào)作用很重要，而目前僅在芽孢桿菌（Bacillus ciwulans）中做了較深入的研究[8]。（2）微生物能夠在生長的的不同時(shí)期分泌不同的幾丁質(zhì)酶，這在基因表達(dá)上必定有良好的調(diào)控機(jī)制，而目前還沒有關(guān)于不同幾丁質(zhì)酶表達(dá)調(diào)控差異的研究報(bào)道。今后，對微生物幾丁質(zhì)酶的研究已不能再滿足于單個(gè)基因的克隆表達(dá)，應(yīng)將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向不同幾丁質(zhì)酶間的協(xié)同作用，這就要求生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫更加完善，應(yīng)用也更加廣泛。

4.3幾丁質(zhì)酶未知區(qū)域功能的不完備性

涂洪濤[7]等人構(gòu)建了Has-Chit的原核表達(dá)載體pGEX/Has-Chit，并探索了各種表達(dá)條件如誘導(dǎo)菌體濃度、誘導(dǎo)溫度、IPTG的用量等，但在大腸桿菌中均未檢測到目的蛋白表達(dá)。經(jīng)過對表達(dá)載體的研究，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒可以在B121（DE3）中正常轉(zhuǎn)錄，因此，可以推測該基因在大腸桿菌體內(nèi)不能正常表達(dá)，是由于該基因與原核基因密碼子偏好性不同，導(dǎo)致無法正常翻譯。另外，序列分析發(fā)現(xiàn)推測的氨基酸中只有3個(gè)半胱氨酸，由此推導(dǎo)出蛋白形成的二硫鍵較少，蛋白不夠穩(wěn)定，易受蛋白酶的消化，這也可能導(dǎo)致檢測不到目的蛋白。該實(shí)驗(yàn)說明了生物信息學(xué)在研究幾丁質(zhì)酶未知區(qū)域功能的不完備性，這就需要我們盡快完善幾丁質(zhì)酶蛋白功能預(yù)測數(shù)據(jù)庫，為幾丁質(zhì)酶的功能及結(jié)構(gòu)研究提供理論依據(jù)。

5結(jié)語

生物信息學(xué)工具的利用，極大地促進(jìn)了幾丁質(zhì)酶的研究進(jìn)展和研究水平，利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件及一些數(shù)據(jù)庫，可以在基因組上對幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行定位和分析，在分子水平上對幾丁質(zhì)酶特性進(jìn)行分析。這些都使人們能夠進(jìn)一步了解幾丁質(zhì)酶和幾丁質(zhì)酶類似蛋白的生物學(xué)特性，為幾丁質(zhì)酶在各方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳少波，吳根福.幾丁質(zhì)酶研究進(jìn)展[J].科技通報(bào)，2004，20（3）：258-262.

[2]B.B. Aam， E.B. Heggset， A.L. Norberg， et al. Eijsink production of chitooligosaccharides and their potential applications in medicine[J]. Mar. Drugs，2010，20（8）：1498-1517.

[3]王艷君，楊謙.來源于Chaetomium cupreum的幾丁質(zhì)酶chi58基因克隆及特性分析[J].東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，36（6）：43-47.

[4]馮浩勇，苗向陽，羅緒剛，等.生物信息學(xué)在發(fā)現(xiàn)新基因方面的應(yīng)用[J].生物技術(shù)通報(bào)，2007，22（5）：1-5.

[5]蘇亞春，李國印，闕友雄，等.甘蔗幾丁質(zhì)酶基因的電子克隆與生物信息學(xué)分析[J].生物信息學(xué)，2011，9（4）：322-330.

[6]于志堅(jiān)，王芳平，方玉田，等.大腸桿菌密碼對使用的規(guī)律[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（5）：976-981.

[7]涂洪濤，付曉偉，郭線茹，等.煙夜蛾幾丁質(zhì)酶基因的克隆與表達(dá)[J].昆蟲知識，2009，46（2）：223-229.

[8]沙莉，蘇爭先，黃小紅，等.微生物幾丁質(zhì)酶的分子生物學(xué)研究及其應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2003，11（6）：642-647.

（責(zé)任編輯：丁志祥）