人IL-37b在大腸埃希菌中的表達、純化及活性鑒定

李夢媛，韋榮飛，徐大模，楊星九，高 苒

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100121)

研究報告

人IL-37b在大腸埃希菌中的表達、純化及活性鑒定

李夢媛，韋榮飛，徐大模，楊星九，高 苒*

(中國醫學科學院醫學實驗動物研究所，北京 100121)

目的 表達重組IL-37b蛋白并去除內毒素，鑒定其活性。方法 構建原核表達載體pET28/IL-37b，轉化大腸桿菌感受態細胞；經IPTG誘導表達的重組蛋白由Ni2+-NTA凝膠進行變性條件下的親和層析純化；用SDS-PAGE分析、考馬斯亮藍染色鑒定重組蛋白是否為目的蛋白；去除蛋白中原核表達所產生的內毒素；將蛋白作用于受LPS刺激的RAW 264.7細胞，收集培養上清，通過ELISA方法檢測IL-6的表達水平，鑒定蛋白的生物學活性。結果 表達了純度較好的重組IL-37b蛋白，降低了其中原核表達所產生的內毒素，經鑒定其具備良好的生物學活性。結論 成功表達了具備良好生物學活性的IL-37b蛋白。

IL-37b；表達；純化；生物學活性

IL-37是IL-1家族細胞因子，最初被發現時被命名為IL-1F7[1]，目前是IL-1家族中唯一一個沒有在小鼠體內發現有同類分子的細胞因子[2]。IL-37的基因包含6個外顯子，其編碼產物有a、b、c、d、e共5種亞型，其中，外顯子1～3編碼IL-37前體蛋白的N末端，外顯子4～6編碼C末端IL-1樣細胞因子結構[3]。IL-37b是五種亞型中序列最長的一個，共有218個氨基酸，含有外顯子1、2、4、5、6；其序列在N端有一段前導序列，其中存在一個caspase-1切割位點，IL-37b前體分子經caspase-1切割修飾后成為成熟分子移入細胞核[4,5]。近年來，大量研究已證實IL-37b具有生物學活性，其能夠作為炎癥抑制因子抑制多種免疫細胞的炎癥反應，進而調節固有免疫應答，IL-37b對外源性刺激誘導的結腸炎、關節炎、胰腺炎等多種炎癥性疾病中都能夠發揮抗炎作用[6-11]。

目前，國外已有商品化的IL-37b蛋白，但價格比較昂貴，商品包裝量較少。本實驗通過成本較低廉、操作較便捷的技術手段大量表達IL-37b蛋白，并對其生物學活性進行了鑒定，為進一步研究IL-37b在相關炎癥性疾病中的機制提供了條件。

1 材料和方法

1.1 材料

含有全長IL-37b編碼區基因的質粒pGEM-T-IL-37b以及表達載體由本實驗室保存，大腸桿菌DH5α購自天根生物公司，Taq聚合酶、限制性內切酶、pET28a(+)質粒等購自Takara公司，質粒提取試劑盒購自Qiagen公司。Ni2+-NTA凝膠購自Novagen公司，透析袋購北京自亮藍生物公司，尿素、Tris-Cl、NaH2PO4、考馬斯亮藍等化學試劑購自Amresco公司。內毒素去除和檢測試劑盒購自金斯瑞生物公司，IL-37抗體購自Abcam公司，HRP標記的山羊抗兔IgG購自中杉金橋生物公司。RAW 264.7細胞購自中國醫學科學院基礎醫學研究所，LPS(Lipopolysaccharide)購自Sigma公司，ELISA試劑盒購自R&D公司，96孔酶標板購自COSTAR公司，預染蛋白分子量marker與BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自Thermo公司。引物合成服務由英濰捷基(上海)公司提供，DNA序列測定服務由北京美吉生物提供。

1.2 方法

1.2.1 IL-37b基因的克隆與表達載體的構建

IL-37b基因模板來自本實驗室制備的含IL-37b全長編碼區基因的質粒pGEM-T-IL-37b。以質粒pGEM-T-IL-37b為模板，通過PCR技術對IL-37b編碼區基因進行擴增。上游引物F1：5’-GGAATTCCA TATGTCCTTTGTGGGGGAGAAC-3’(下劃線為NdeI酶切位點)；下游引物F2：5’-CGGAATTCCTA ATCGCTGACCTCACTGGGGCTC-3’(下劃線為EcoRI酶切位點)。PCR反應條件為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s；擴增30個循環后，72℃延伸5 min。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，并進行膠回收，收集擴增的目的基因片段，用于連接構建表達載體。用限制性內切酶EcoRI和NdeI分別對目的基因的PCR產物與表達載體pET28a(+)進行雙酶切，再次進行瓊脂糖凝膠電泳，通過膠回收純化收集酶切產物，于室溫過夜連接，構建表達載體。將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，取100 μL轉化液均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板，于37℃培養箱中倒置培養。次日，挑選菌落進行PCR，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果后，將陽性克隆進行DNA測序鑒定，檢測IL-37b基因片段是否正確插入，陽性克隆質粒命名為pET28/IL37b。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化

轉化重組質粒pET28/IL-37b進入大腸桿菌感受態細胞后，將其均勻涂布于具有卡那霉素抗性的LB平板上，于37℃培養箱中倒置培養過夜。次日，挑取單個菌落接種至3～4 mL LB液體液體培養基中，進行少量培養。將培養的菌液按1∶500的體積比接種到更多LB液體培養基中，進行37℃，200 r/min振搖培養，每隔一段時間檢測菌液OD600值。培養至菌液OD600值達到0.5～0.6時，加入終濃度1 mmol/L的IPTG誘導菌體表達蛋白，繼續37℃振搖培養。培養16～18 h后，以4℃，4000 r/min條件離心30 min，收集菌體沉淀。用PBS重懸沉淀，經超聲破碎，12000 r/min再次離心20 min，分別取細菌裂解產物的上清與沉淀進行SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白的表達形式[12]。電泳結果顯示細菌裂解產物的上清和沉淀中都有外源性重組蛋白表達的條帶，表明重組IL-37b具有可溶性和包涵體兩種表達形式。由于沉淀中的目的重組蛋白較多，故再次實驗時誘導表達1 L菌液，離心并超聲破碎菌體后，收集其沉淀進行純化。重組IL-37b蛋白帶有6個His標簽，采用Ni2+-NTA凝膠進行變性條件下的親和層析純化，變性結合緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 8.0；變性漂洗緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 6.3；變性洗脫緩沖液為8 mol/L尿素，0.1 mol/L NaH2PO4，0.01 mol/L Tris-Cl，pH 4.5；具體步驟按Merck的His Tag蛋白純化操作手冊進行。純化完成后，通過PBS對重組蛋白進行透析復性，除去其中的尿素，于4℃環境透析24 h，每2～3 h更換一次透析液。

1.2.3 SDS-PAGE電泳與Western blot

配制12～15%的分離膠，將純化蛋白過程中收集的各組溶液進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，用考馬斯亮藍對電泳膠染色，至能明顯觀察到marker與蛋白條帶后，用乙酸脫色液洗滌至條帶清晰，于紫外顯影儀下觀察蛋白條帶。另外對一塊膠進行轉膜，將蛋白條帶電轉至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉，按1∶1000的比例用IL-37抗體4 ℃孵育過夜。次日，用0.1%的PBST洗膜去除非特異性結合，加入1∶5000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG，洗膜后加顯影液，觀測蛋白條帶。

1.2.4 去除重組蛋白內毒素并鑒定內毒素殘留量

使用金斯瑞生物的內毒素去除試劑盒與內毒素檢測試劑盒，通過凝膠吸附法除去重組蛋白溶液中的內毒素，并檢測去除內毒素后蛋白中內毒素殘留量。

去除內毒素前調節蛋白溶液pH至6.0～9.0之間，以達到更好的去除效果。首先使用3～4倍柱體積的再生緩沖液活化柱中的內毒素吸附樹脂，控制流速在0.25 mL/min，確保體系內無熱原；隨后用3～4倍柱體積的平衡緩沖液平衡樹脂，流速控制在0.5 mL/min；開始去除內毒素，加入樣品，流速控制在0.25 mL/min，用無熱原接收管收集流出液；柱子經再生后可重復使用或4 ℃保存。

用試劑盒中的無熱源水溶解鱟變形細胞溶解物(limulus amebocyte lysate，LAL)檢測蛋白溶液中的內毒素含量。按1∶50～1∶3200梯度稀釋重組蛋白樣品；分別將0.1 mL的LAL溶液與同體積的蛋白樣品混勻，37℃孵育1 h，觀察LAL與蛋白樣品是否凝固成膠狀物質。按樣品的稀釋倍數計算內毒素含量，若其含量達不到預期要求，可對柱中樹脂進行再生，再次去除內毒素。

1.2.5 重組蛋白生物學活性的鑒定

采用0.05～200 ng/mL不同濃度梯度的重組蛋白與終濃度1 μg/mL LPS共同作用于RAW 264.7細胞，37℃培養細胞24 h后，收集培養上清，通過ELISA方法檢測上清中IL-6的表達量。步驟如下，提前1 d在96孔板上包被捕獲抗體，室溫過夜。次日棄去舊液，用0.05%的PBST洗滌3次，用1% BSA室溫封閉1 h。棄去舊液，洗滌后加入收集的細胞培養上清樣品與稀釋好的標準品，室溫封閉2 h。棄去舊液，洗滌后加入檢測抗體，室溫封閉2 h。棄去舊液，洗滌后加入HRP，避光室溫孵育20 min。棄去舊液，洗滌3次，加入按體積比1∶1混合的顯色液A液與B液，避光孵育10～20 min，隨后加入終止液終止顯色反應。通過酶標儀檢測450 nm波長處的OD值，按照OD值繪制標準曲線，并通過其方程計算樣品中IL-6表達量。

2 結果

2.1 表達載體的構建與鑒定

PCR擴增產物在500 bp左右有一條符合預期結果的目的基因條帶，如圖1所示；質粒經EcoRI、NdeI雙酶切后，在500 bp左右處也有一條與目的基因大小相符的條帶。DNA測序結果與BLAST分析顯示PCR擴增出的片段無堿基突變；構建的表達質粒pET28/IL-37b，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，擴增出的基因片段同樣在500 bp處，也與預期結果相符。對陽性克隆進行DNA測序，結果顯示IL-37b基因片段正確插入表達載體pET28a(+)質粒中，堿基無突變，可進一步用于目的蛋白的誘導表達。

注：1：IL-37b基因的PCR產物；2：pET28a/IL-37b質粒經Nde I/EcoR I雙酶切的結果。圖1 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR與酶切產物Note. 1: PCR Results of IL-37b gene; 2: Result of pET28/IL-37b by Nde I/EcoR I digestion.Fig.1 Identification of PCR and dual-enzyme digestion products by agarose gel electrophoresis

2.2 重組蛋白的表達與鑒定

SDS-PAGE電泳結果如圖2所示，經IPTG誘導后，菌液在25 kDa左右處有一條與預期相符合的高表達外源性蛋白條帶，與預期蛋白的相對分子量相符合；純化后的蛋白中除一條目的條帶外未見其他條帶；Western Blot結果顯示誘導表達的重組IL-37b能夠與相應的IL-37抗體產生特異性結合，其條位置正確，大小相符[6,13]，而未經IPTG誘導的菌液裂解產物的Western Blot結果則沒有相應的條帶。經檢測從1 L大腸桿菌培養液的菌體沉淀中共純化得到約40 mg左右的重組IL-37b蛋白。

注：1：未經IPTG誘導的菌體裂解液；2：經IPTG誘導的菌體裂解液；3：經IPTG誘導的菌體裂解液沉淀；4：純化后的IL-37b；5：未經IPTG誘導的菌體蛋白的Western blot結果；6：重組IL-37b的Western blot結果。圖2 IL-37b純化的SDS-PAGE分析以及Western blot鑒定Note. 1: Total cell lysates before IPTG induction; 2: Total cell lysates after IPTG induction; 3: IPTG-induced cell lysate precipitation; 4: Purified IL-37b protein; 5: Western blot analysis of bacterial proteins before IPTG induction; 6: Western blot for recombinant IL-37b protein. Fig.2 SDS-PAGE and Western blot analysis of the purified IL-37b

2.3 去除重組蛋白內毒素并鑒定內毒素殘留量內毒素檢測試劑

盒中LAL的靈敏度為0.25 EU/mL，計算公式：內毒素含量=0.25 × 樣品稀釋倍數/樣品濃度。經公式計算去除內毒素后重組IL-37b的內毒素殘留量范圍大約在0.04～0.07 EU/μg范圍內。(見表1)

表1 重組IL-37b中的內毒素殘留量

注：“+”：樣品凝固；“-”：樣品未凝固。

Note. “+”：The sample solidified；“-”：The sample was not solidified.

2.4 重組蛋白生物學活性的鑒定

用RAW 264.7細胞檢測重組IL-37b對LPS刺激的抑制作用。如圖3所示，重組IL-37b在0.05～200 ng/mL時均能夠抑制LPS刺激引起的IL-6的表達；且蛋白濃度在10～200 ng/mL時與LPS對照組相比差異顯著，表明以此種方式誘導表達的IL-37b具有良好的生物學活性。

注：與LPS對照組比較，*P < 0.05；**P < 0.01。圖3 IL-37b對LPS刺激RAW264.7細胞IL-6表達量的影響Note. Compared with the LPS control group，*P < 0.05；**P < 0.01.Fig.3 Effect of IL-37b on IL-6 production on LPS stimulated RAW 264.7 cells

3 討論

本實驗通過原核表達的方式大量生產包涵體形式的IL-37b蛋白，隨后復性使其恢復生物學活性。SDS-PAGE電泳結果顯示經變性純化的IL-37b中基本無其他雜蛋白條帶；Western blot結果顯示重組IL-37b能夠與相應的IL-37抗體產生特異性結合，其條帶清晰，大小正確，與文獻報導相符[6,13]。證明通過本實驗的純化方式能夠快捷、大量地得到純度較好的IL-37b。

LPS系革蘭陰性菌細胞壁外表層的內毒素脂多糖，在細菌死亡細胞受到破壞后釋放。LPS性質穩定，耐高溫，能夠引起發熱、微循環障礙、內毒素休克等癥狀[14]。實驗中，通過凝膠吸附法去除了重組IL-37b樣品中的大部分內毒素，降低了IL-37b在發揮治療與免疫功能的過程中對細胞、機體產生的毒副作用，也減小了將其應用于其他實驗研究時產生的誤差。

細菌、病毒感染以及IL-1、TNF-α等細胞因子均可誘導正常細胞產生IL-6，IL-6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能，如誘導Th17細胞分化、B細胞抗體表達等，是機體炎癥反應的標志性細胞因子之一[15]。本實驗中，通過ELISA方法檢測RAW 264.7細胞中IL-6的表達量，以此檢測重組蛋白對促炎性細胞因子的抑制作用。RAW 264.7細胞系小鼠來源的單核巨噬細胞，自身不表達IL-37，避免了對實驗的背景干擾[2]；重組IL-37b在0.05～200 ng/mL時均能在不同程度上抑制LPS刺激引起的IL-6的表達；且蛋白濃度低至10 ng/mL時，其IL-6的表達量與LPS對照組相比仍存在顯著差異，證明表達的IL-37b經純化后具備良好的生物學活性。

目前，商品化IL-37蛋白包裝量較少，價格昂貴，有些不具備生物學活性，只能在某些實驗中作為對照品使用。本實驗成功制備了純度較好、內毒素含量低并具備良好生物學活性的IL-37b，為今后進一步研究IL-37b在人類各種疾病中發揮的機制提供條件。

[1] Dinarello C, Arend W, Sims J, et al. IL-1 family nomenclature [J]. Nat Immunol, 2010, 11: 973.

[2] Diana B, Davide L, Stefan H, et al．IL-37: a new anti-inflammatory cytokine of the IL-1 family [J]．Eur Cytokine Netw, 2011, 22: 127-147．

[3] Kumar S, McDonnell PC, Lehr R, et al. Identification and initial characterization of four novel members of the interleukin-1 family [J]. J Biol Chem, 2000, 275(14): 10308-10314.

[4] Sharma S, Kulk N, Nold MF, et al. The IL-1 family member 7b translocates to the nucleus and down-regulates proinflammatory cytokines [J]. J Immunol, 2008, 180(8): 5477-5482.

[5] Bulau AM, Nold MF, Li SZ, et al. Role of caspase-1 in nuclear translocation of IL-37, release of the cytokine, and IL-37 inhibition of innate immune responses [J]. PNAS, 2014, 111(7): 2650-2655.

[6] Nold MF, Nold-Petry CA, Zepp JA, et al. IL-37 is a fundamental inhibitor of innate- immunity [J]. Nat Immunol, 2010, 11(11): 1014-1022.

[7] McNamee EN, Masterson JC, Jedlicka P, et al. Interleukin 37 expression protects mice from colitis [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(40): 16711-16716.

[8] Zhao PW, Jiang WG, Wang L, et al. Plasma levels of IL-37 and correlation with TNF-a, IL-17A, and disease activity during DMARD treatment of rheumatoid arthritis[J]. PLoS One, 2014, 9(5): e95346.

[9] 姚洪鋒, 郭瑜佳, 駱方軍, 等. 重癥急性胰腺炎小鼠IL-37的動態變化及其意義研究[J]. 浙江中醫藥大學學報, 2014, 38(6): 764-769.

[10] Bulau AM, Fink M, Maucksch C, et al. In vivo expression of interleukin-37 reduces local and systemic inflammation in concanavalin A-induced hepatitis [J]. Sci World J, 2011, 11: 2480-2490.

[11] Lunding L, Webering S, Vock C, et al. IL-37 requires IL-18Ra and SIGIRR/IL-1R8 to diminish allergic airway inflammation in mice [J]. Allergy, 2015, 70(4): 366-373.

[12] Gu JJ, Gao XM, Pan XH, et al. High-level expression and one-step purication of a soluble recombinant human interleukin-37b in Escherichia coli [J]. Protein Expr Purif, 2015, 4(108): 18-22.

[13] Smith DE, Renshaw BR, Ketchem RR, et al. Four new members expand the interleukin-1 superfamily [J]. Biol Chem, 2000, 275(2): 1169-1175.

[14] 郭萌, 李冠民, 黃清泉. 細菌內毒素研究進展[J]. 中國實驗動物學報, 2009, 17(5): 397-401.

[15] 林麗艷, 張慧云, 何韶衡. IL-6及其受體與炎癥性疾病關系的新進展[J]. 中國熱帶醫學, 2008, 8(4): 680-682.

Expression, purification and activity assay of human IL-37b inE.coli

LI Meng-yuan，WEI Rong-fei，XU Da-mo，YANG Xing-jiu，GAO Ran*

(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medicine Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China)

Objective To investigate the expression of recombinant IL-37b protein and removal of the endotoxin, and identify its biological activity. Methods The prokaryotic expression vector pET28/IL-37b was constructed and to transformEscherichiacoli(E.coli) Rosetta. After induction with IPTG, the recombinant protein was purified through Ni2+-NTA gel column and identified by SDS-PAGE and Coomassie brilliant blue staining. Then, the endotoxin protein was removed and was treated with LPS-stimulated RAW 264.7 cells. The culture supernatant was collected. The expression of IL-6 was detected by ELISA and the biological activity of the protein was identified.Results The recombinant IL-37b with high purity was expressed and the endotoxin produced by prokaryotic expression was reduced, and it was identified to have good biological activity. Conclusions In this study a recombinant IL-37b protein with high biological activity is successfully obtained.

IL-37b; Expression; Purification; Biological activity

中央級公益性科研院所基本科研業務費。

李夢媛(1988-)，女，研究方向：免疫學。E-mail：limengyuan767@126.com

高苒(1980-)，女，研究方向：腫瘤學、免疫學。E-mail：gaoran26@hotmail.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0020-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.004

2016-08-26