E-cad在低位直腸癌淋巴結轉移裸鼠模型血清及移植瘤中的表達及其意義

艾斯克爾·吐拉洪，陳 凱，鄧大偉*

(1. 新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心，烏魯木齊 830000；2. 新疆醫科大學第五附屬醫院普外科，烏魯木齊 830000)

研究報告

E-cad在低位直腸癌淋巴結轉移裸鼠模型血清及移植瘤中的表達及其意義

艾斯克爾·吐拉洪1，陳 凱2，鄧大偉2*

(1. 新疆醫科大學第一附屬醫院腫瘤中心，烏魯木齊 830000；2. 新疆醫科大學第五附屬醫院普外科，烏魯木齊 830000)

目的 探討裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型血清及移植瘤組織中E-鈣黏蛋白(E-cad)的表達情況，分析其在直腸癌淋巴結轉移過程中的作用。方法 取對數生長期的人大腸癌細胞株SW480接種于裸鼠直腸黏膜下,建立裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型。120只裸鼠隨機分為3組，每組40只，A組(直腸癌模型組)采用二甲基肼注射+SW480種植，B組(二甲基肼對照組)采用二甲基肼注射，C組(空白對照組)不作任何處理。采用ELISA檢測血清E-cad的含量，采用Western blot法、RT-PCR法檢測種植瘤組織中E-cad蛋白及mRNA表達水平。結果 A組裸鼠的血清E-Cad含量為(19.48±1.25)mg/L,明顯高于B組裸鼠和C組裸鼠的血清E-Cad含量(2.36±0.18 mg/L和2.15±0.12 mg/L)(t=8.28，9.01，P< 0.05)。發現側方淋巴結轉移的裸鼠血清E-Cad含量，明顯高于未發現側方淋巴結轉移的裸鼠，差異有顯著性(t=10.28，P< 0.05)。A組裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白的表達強度弱于B組和C組(t=9.81，7.69，P< 0.05)。A組中,有側方淋巴結轉移發生的裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白表達強度較未有側方淋巴結轉移發生的裸鼠移植瘤組織中表達明顯減弱，差異有顯著性(t=9.36，P< 0.05)。A組裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA 表達明顯下調，與B組和C組比較，有明顯的差異(P< 0.05)。A組中發現側方淋巴結轉移的裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA表達強度明顯下調，與未發現側方淋巴結轉移的裸鼠比較，差異有顯著性(t=7.85，P< 0.05)。結論 血清E-cad的表達水平可能與直腸癌淋巴轉移密切相關，同時直腸癌組織中E-Cad蛋白和mRNA表達減弱或缺失，導致癌細胞間粘附性降低，促進癌細胞獲得侵襲和轉移的能力。

直腸癌；淋巴結轉移；E-鈣黏蛋白；裸鼠

直腸癌的轉移侵襲是影響患者術后復發及生存率的關鍵因素，其是一個復雜演進的過程，與多種蛋白分子及基因相關。細胞黏附是癌細胞轉移侵襲的一個重要步驟，E-鈣黏蛋白(E-cad)作為其中重要執行分子，主要介導正常和腫瘤組織中細胞與細胞間的黏附過程[1]。目前研究資料表明，E-cad 表達在腫瘤組織中的表達與其發生浸潤轉移的幾率存在負相關性，即腫瘤組織中E-cad表達降低時，其介導的黏附作用相應隨之減弱，致使腫瘤細胞能更容易脫離原發灶，同時相對血清中E-cad含量會相應增高，與腫瘤轉移浸潤能力呈現正相關[2，3]。本研究選用人大腸癌細胞株SW480建立低位直腸癌淋巴結轉移模型，檢測E-cad在裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型血清及移植瘤組織中的表達情況，探討其在直腸癌淋巴結轉移過程中的可能作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/C-nu/nu雄性裸鼠120只，SPF級，購自新疆醫科大學動物實驗研究中心【SCXK(新)2011-0001】，鼠齡6～8周，體重18～22 g，分籠飼養于屏障系統的潔凈層流架內【SYXK(新)2015-0002】。隨機分為3組，每組40只裸鼠，A組(直腸癌模型組)采用二甲基肼注射+人大腸癌細胞株SW480種植，B組(二甲基肼對照組)僅采用二甲基肼注射，C組(空白對照組)不作任何處理。

1.1.2 細胞來源

人大腸癌細胞株SW480(取自中科院上海細胞生物研究所)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中進行培養，培養環境是37℃、5%CO2的培養箱。

1.1.3 主要試劑

胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司，胰蛋白酶購自Sigma公司，RPMI-I64O培養基購自Gibco公司；小鼠E-cad酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒分別購自Bender Medsystems公司；小鼠 E-Cad一抗及酶標試劑盒(96孔)購自美國Santa Cruz公司。BCA法蛋白定量測定試劑盒購自武漢博士德生物工程技術有限公司。PCR 試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 人大腸癌細胞株SW480的培養

光線從背后照過來，葉曉曉半躺在一張貴妃榻上，右手支著頭，左手順著身體輕輕撫在髖骨上，頭微揚。光線打在臉上，鍍上了一層柔和的小麥色光芒，身體的調子半明半暗，立體感很強，光潔如玉的身體因為青春和飽滿微微發出潤澤的光芒。

采用的培養基為含10%胎牛血清的RPMI-1640，培養箱的環境要求為：37℃、5%CO2，首先用0.25%胰酶對SW480細胞進行消化，收集并配置細胞懸液的濃度達1×106個/mL，備用。

1.2.2 裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型的建立

A組和B組裸鼠均采用二甲基肼注射液(生理鹽水配制，濃度為1%，pH值為6.5 ～ 7.0)進行頸部皮下注射，注射劑量和時間：30 mg/kg，1次/周，至第8周末。B組裸鼠完成8周的注射后分籠飼養。A組裸鼠繼續進行接種實驗：裸鼠在進行實驗前禁食12 h，10%水合氯醛(0.3 mL∶100 g)腹腔內注射進行麻醉裸鼠，消毒會陰、肛門以及直腸腔，將直腸黏膜外翻，以顯露于擴張的肛門口外，取配置好備用的大腸癌細胞株SW480懸液0.2 mL，在裸鼠背側肛門緣上2 mm處，緩慢注射細胞懸液于直腸黏膜組織下。實驗后A組裸鼠分籠飼養,繼續禁食禁水6 h后給予高能量飲食。C組裸鼠不作任何處理。對三組裸鼠分別于制模實驗完成后第6周時，各取10只裸鼠采用頸部脫曰法處死，處死前取裸鼠心臟血6 mL，處死后切開腹腔，切取A組裸鼠的移植瘤組織及周圍組織(包括側方淋巴結組織，對于側方淋巴結清掃范圍為自直腸筋膜臟層進行分離、膀胱下筋膜內側骨盆神經叢和髂血管之間以及髂內血管和盆壁及閉孔筋膜之間)，而對B組和C組的裸鼠，則切取相對應位置的直腸及周圍組織(包括側方淋巴結組織)。

1.2.3 血清E-Cad含量檢測

各組裸鼠血清E-Cad含量檢測采用ELISA雙抗夾心法進行檢測，方法嚴格按操作說明書進行，設標準孔8 孔，稀釋血清標本，配置底物及標準液，每孔中加入第一抗體工作液50 μL，將反應板充分混勻后置37℃ 60 min，洗板后每孔加酶標抗體工作液100 μL，將反應板置37℃ 30 min，洗板后每孔加入底物工作液100 μL，置37℃暗處反應5 ～ 15 min。于492 nm處測吸光值并繪制標準曲線，根據曲線圖得出E-Cad含量。

1.3 Western blot法檢測移植瘤組織中E-鈣黏蛋白的表達

將各組裸鼠的部分移植瘤組織浸入生理鹽水中，經研磨成為細胞懸液，收集細胞，將400 μL含PMSF的裂解液加入細胞培養板上，培養板置于冰上作用30 min，使細胞完全裂解，提取細胞株的總蛋白，用Bradford法測定蛋白濃度并計算出標準曲線方程，然后進行Western印跡檢測，圖片掃描后用Quatity One 軟件分析條帶灰度值。

1.4 RT-PCR法檢測移植瘤組織中E-鈣黏蛋白的表達

按TRIzol總RNA提取試劑說明書進行操作，采用Trizol一步法提取各組裸鼠腫瘤組織的總RNA，并經紫外分光光度計測定，計算提取物RNA濃度，按照逆轉錄試劑盒合成cDNA，設計DJ-1和PTEN mRNA引物，各引物均由上海生工合成。RT-PCR反應條件為40℃ 30 min，94℃ 1 min，94℃ 15 s，50℃ 1 min，72℃ 1 min，取cDNA 1 μg，10× buffer 2 μL，MgCl24 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，引物100 ng，TagDNA多聚酶 1 U，總體系20 μL，將PCR擴增之后的產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳，應用Gel-pro凝膠分析軟件對電泳譜帶mRNA進行基因表達差異分析。

1.5 統計學方法

采用SPSS 11.0統計分析軟件進行數據處理。計量資料數據比較采用方差檢驗，組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 各組裸鼠血清E-Cad含量檢測結果

A組裸鼠的血清E-Cad含量為(19.48±1.25)mg/L，明顯高于B組裸鼠和C組裸鼠的血清E-Cad含量(2.36±0.18 mg/L和2.15±0.12 mg/L)(t=8.28，9.01，P< 0.05)，而B組和C組之間比較，差異無顯著性(t=0.69，P> 0.05)。A組中發現6例出現側方淋巴結轉移，發現側方淋巴結轉移的裸鼠血清E-Cad含量(24.07±1.65 mg/L)，明顯高于未發現側方淋巴結轉移的裸鼠血清E-Cad含量(12.64±1.35 mg/L)，差異有顯著性(t=10.28，P< 0.05)。

2.2 Western blot法檢測各組裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白的表達

A組裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白的表達強度(0.42±0.09)弱于B組(1.56±0.18)和C組(1.25±0.32)(t=9.81，7.69，P< 0.05)，而B組和C組之間比較，E-Cad表達強度則差異無顯著性(t=1.29，P> 0.05)，見圖1。A組中，有側方淋巴結轉移發生的裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白表達強度(0.14±0.05)較未有側方淋巴結轉移發生的裸鼠移植瘤組織中表達強度(0.62±0.15)明顯減弱，差異有顯著性(t=9.36，P< 0.05)，見圖2。

注：A：直腸癌模型組(A組)；B：二甲基肼對照組(B組)；C：空白對照組(C組)。圖1 各組裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白表達Note. A: Rectal cancer model group (group A); B: Dimethylhydrazine control group (group B); C: Blank control group (group C).Fig.1 The protein expression of E-cad in the tumor tissues of nude mice

注：1：發生側方淋巴結轉移；2：未發生側方淋巴結轉移。圖2 A組伴有側方淋巴結轉移發生和未伴有轉移發生的裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白表達比較Note. 1: Lateral lymph node metastasis; 2: Without lateral lymph node metastasis.Fig.2 Comparison of the protein expression of E-cad in the mice of group A with or without lateral lymph node metastasis

2.3 RT-PCR法檢測各組裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA的表達

A組裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA 表達明顯下調，與B組和C組比較，差異有顯著性(P< 0.05)，而B組和C組之間比較差異無顯著性(P> 0.05)，見圖3。A組中發現側方淋巴結轉移的裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA表達強度明顯下調，與未發現側方淋巴結轉移的裸鼠比較，差異有顯著性(t=7.85,P< 0.05)，見圖4。

注：M：Maker；A：直腸癌模型組(A組)；B：二甲基肼對照組(B組)；C：空白對照組(C組)。圖3 各組裸鼠移植瘤組織中E-Cad mRNA的表達Note. M: Marker; A: Rectal cancer model group (group A); B: Dimethylhydrazine control group (group B); C: Blank control group (group C).Fig.3 mRNA expression of E-cad in the tumor tissues of nude mice

注：M: Maker；1：發生側方淋巴結轉移；2：未發生側方淋巴結轉移。圖4 A組發生側方淋巴結轉移和未發生的裸鼠種植瘤組織中E-Cad mRNA表達比較Note. M: Marker; 1: With lateral lymph node metastasis; 2: Without lateral lymph node metastasis.Fig.4 The mRNA expression of E-cad in the mice of the group A with or without lateral lymph node metastasis

3 討論

惡性腫瘤的轉移浸潤過程中涉及多分子參與、多因素影響，包含了粘附能力下降、降解、新生血管生成、免疫逃逸等多個方面，其中腫瘤細胞與內皮細胞之間粘附能力下降是發生轉移浸潤的第一步，而粘附分子則是這個過程中起重要作用的分子基礎，其表達是決定細胞間粘附行為的重要因素。E-Cad屬于粘附分子家族，是一種鈣依賴跨膜糖蛋白，在靜息狀態下，E-Cad在大多數上皮組織的細胞表面都有表達,其主要功能是通過鈣離子形成同源二聚體介導同型細胞黏附，從而參與胚胎發育以及正常組織中上皮細胞層的形成和維持。研究表明，E-Cad通過與連環蛋白之間的交聯性改變，細胞生長、分化的粘附信號隨之發生改變，細胞粘附力被降低，從而為腫瘤浸潤、轉移的發生提供了更好的機會[4]。血清可溶性sE-cad是細胞內E-cad的降解物，最早是1983年Damsky等在人乳腺癌細胞MCF-7的無血清培養液中檢測到sE-cad[5]，之后在臨床的血清檢測結果中發現腫瘤患者的sE-cad含量要明顯高于正常人水平，推測血清E-cad含量的增高可能與腫瘤細胞內E-cad釋放入血有關，提示sE-cad的血清指標可以用于監測腫瘤患者的預后。國內外研究也發現前列腺癌、肺癌、胃癌患者血清中能監測到較高水平的E-cad含量，腫瘤切除后患者血清E-cad水平迅速下降[6, 7]。

二甲基肼是目前公認致大腸癌的較為特異致癌劑，主要在肝臟被氧化成甲基偶氮甲醇，與β-葡萄糖醛酸結合，在腸道細菌和腸黏膜上皮的β-葡萄糖苷酸酶作用下，氧化甲基偶氮甲醇又重新游離出來，代謝成終致癌物，導致大腸黏膜上皮癌變。本課題組采用二甲基肼預處理裸鼠，再經肛門種植大腸癌細胞株SW480于直腸粘膜下，能夠縮短實驗建模時間，保證造模成功。本實驗成功建立了裸鼠低位直腸癌淋巴結轉移模型，在此基礎上通過ELISA法檢測了裸鼠血清E-cad的表達水平，研究結果發現A組裸鼠的血清E-Cad含量為(19.48±1.25)mg/L，明顯高于B組裸鼠和C組裸鼠的血清E-Cad含量(2.36±0.18 mg/L和2.15±0.12 mg/L)(t=8.28，9.01，P< 0.05)，而B組和C組之間比較，差異無顯著性(t=0.69，P> 0.05)。證明了成功制模的裸鼠血清中能檢測到較高水平的E-Cad表達，較正常裸鼠明顯增高，證明了血清E-cad含量的增高可能與癌細胞內E-cad釋放入血有關這一推測，也進一步證明了E-cad在直腸癌的發生、生長過程中扮演著重要的角色。同時，本研究的A組中發現6例出現側方淋巴結轉移，發現側方淋巴結轉移的裸鼠血清E-Cad含量，明顯高于未發現側方淋巴結轉移的裸鼠，差異有顯著性(t=10.28，P< 0.05)，提示血清E-cad的表達水平可能與直腸癌淋巴轉移密切相關，可作為一種新的監測直腸癌患者淋巴結轉移的新分子學參考指標。

E-cad是影響直腸癌發生淋巴結轉移的重要因素之一，影響腫瘤生長速度、浸潤深度、大小及癌細胞向遠處的轉移[8]。近年來對多腫瘤細胞和癌組織從分子水平上進行了較深入的研究，發現癌組織黏膜中E-cad表達與腫瘤浸潤之間存在負相關性，而當E-cad 表達降低或缺失時，由介導的細胞黏附功能出現障礙，癌細胞之間的同質性黏附功能減弱，癌細胞更易于脫離原發灶，從而增加癌細胞侵襲和轉移的幾率[9-11]。本研究在建立低位直腸癌淋巴結轉移裸鼠模型的基礎上，檢測E-cad在裸鼠移植瘤組織中的蛋白和mRNA表達情況，結果顯示制模組裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白和mRNA的表達強度均弱于二甲基肼對照組和空白對照組(P< 0.05)，進一步證明了E-Cad作為細胞之間的鈣依賴性跨膜糖蛋白參與了直腸癌的發生過程，可能在直腸癌細胞的分化、增殖的環節中發揮著重要的生物學效應[12]。本研究進一步探討了發生側方淋巴結轉移裸鼠和未發生側方淋巴結轉移裸鼠之間E-Cad蛋白表達情況比較，結果發現制模組中發現側方淋巴結轉移的裸鼠移植瘤組織中E-Cad蛋白和mRNA表達強度均明顯減弱，與未發現側方淋巴結轉移的裸鼠比較，差異有顯著性(P< 0.05)。提示E-Cad基因及其蛋白表達的異常可能參與了直腸癌的淋巴結轉移發生發展過程，由于E-Cad表達的減弱或缺失，致使其介導的粘附系統在癌組織中失去其功效，從而降低癌細胞間粘附性，促進癌細胞遷移、浸潤及轉移，這對癌組織的浸潤及淋巴結轉移的發生過程是具有重要促進作用的[13-15]。

綜上所述，本研究結果提示，血清E-cad的表達水平可能與直腸癌淋巴轉移密切相關，可作為一種新的監測直腸癌患者淋巴結轉移的新觀察指標；同時直腸癌組織中E-Cad蛋白和mRNA表達減弱或缺失，導致癌細胞間粘附性降低，促進癌細胞獲得侵襲和轉移的能力。但由于本研究樣本數較少，且未對E-Cad介導粘附作用的具體機制進行探討，結果存在一定局限性，有待進一步深入研究。

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Expression and significance of E-cadherin in the serum and transplanted tumor of nude mouse model of low rectal cancer with lymph node metastasis

AISHIKEER·tulahong1, CHEN Kai2, DENG Da-wei2*

(1. Cancer Center, the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000, China；2. Department of General Surgery, the Fifth Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University, Urumqi 830000)

Objective To establish a nude mouse model of low rectal cancer with lymph node metastasis, to detect the expression of E-calcium (E-cad) in the serum and transplanted tumor tissue of the mice, and to analyze the role of E-cad in lymph node metastasis of rectal cancer. Methods Human colorectal adenocarcinoma cells (SW-480) were inoculated into the rectal submucosa of nude mice to establish a model of low rectal cancer with lymph node metastasis. 120 nude mice were randomly divided into three groups (40 mice in each group). Group A (rectal cancer model group) was injected with dimethylhydrazine and implanted with SW480 cells. Group B (dimethylhydrazine control group) was injected with dimethylhydrazine alone. The group C (control group) received no treatment. Serum E-cad was detected by ELISA. The mRNA and protein expression of E-cad in the tumor tissue was detected by RT-PCR and western blot, respectively. Results The serum level of E-cad in group A was 19.48±1.25 mg/L, significantly higher than those in groups B (2.36±0.18 mg/L) and C (2.15±0.12 mg/L) (t=8.28, 9.01,P< 0.05). The serum levels of E-cad were significantly higher in the nude mice with lateral lymph node metastasis than those without lymph node metastasis (t=10.28,P< 0.05). The protein expression of E-cad in the group A was lower than that in the groups B and C (t=9.81, 7.69,P< 0.05). In the group A, the protein expression of E-cad in the nude mice with lateral lymph node metastasis was significantly lower than that without lateral lymph node metastasis (t=9.36,P< 0.05). The mRNA expression of E-cad in the group A was significantly lower than that in the groups B and C (P< 0.05), and the mRNA expression of E-cad in the nude mice with lateral lymph node metastasis was significantly lower than that in the mice without lateral lymph node metastasis (t=7.85,P< 0.05). Conclusions The serum level of E-cad may be closely associated with the lymphatic metastasis of rectal cancer, and the mRNA and protein expressions of E-cad in colorectal cancer tissue were weak or absent, leading to a decrease of adhesion ability between cancer cells, and promote the invasion and metastasis of cancer cells.

Rectal cancer; Lymph node metastasis; E-cadherin; Nude mice

新疆維吾爾自治區自然科學基金(項目編號：2014211C131)。

艾斯克爾·吐拉洪(1980-)，碩士，主治醫師，研究方向：肝膽腫瘤。Email: 277405546@qq.com

鄧大偉，Email: Hexiaoxiao2010@sina.com

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0031-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.006

2016-11-28