一株枯草芽孢桿菌的鑒定及液體發酵工藝優化

胡紅偉， 段明房， 閆凌鵬， 邢俊德， 麻嘯濤， 李自茹， 陳茹茹， 楊京娥

（1.山西大禹生物工程股份有限公司，山西芮城 044600；2.太原理工大學化學工程學院，山西太原 030024）

一株枯草芽孢桿菌的鑒定及液體發酵工藝優化

胡紅偉1*， 段明房1， 閆凌鵬1， 邢俊德2， 麻嘯濤1， 李自茹1， 陳茹茹1， 楊京娥1

（1.山西大禹生物工程股份有限公司，山西芮城 044600；2.太原理工大學化學工程學院，山西太原 030024）

從雞腸道篩選出一株菌，命名為DY032，經16S rDNA分子鑒定和系統發育分析，該菌種為枯草芽孢桿菌。在搖瓶發酵條件下，采用單因素試驗，對菌株DY032的培養基配方進行優化，確定了影響發酵液菌體數和芽孢數的5個因素，分別為淀粉、魚粉、豆餅粉、MnSO4·H2O和CaCO3，其適宜濃度分別為20、10、10、0.05、0.05 g/L，進一步通過L16（45）正交試驗確定以上5因素的最佳配比。為放大培養，在最優培養基基礎上，利用10 L發酵罐，采用L9（34）正交試驗設計，以芽孢數為指標，對菌株DY032的培養溫度、pH值、攪拌轉速、通氣量4個條件進行優化。結果表明：菌株DY032培養基最優配方為：淀粉16 g/L，魚粉10 g/L，豆餅粉10 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO30.03 g/L。最優發酵罐培養條件為：培養溫度37℃，pH值6.5，轉速200 r/min，通氣量5 L/min，最終芽孢數可達51.95×108cfu/mL。

菌株DY032；16S rDNA；優化

枯草芽孢桿菌是我國農業部允許作為飼料添加劑的益生菌之一，相對其他益生菌，是較早應用到飼料中的微生態制劑，其可有效調節動物腸道微生態平衡。枯草芽孢桿菌為需氧菌，其產酶能力較強，能產生蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶等，同時可降解飼料中的抗營養因子，提高動物的消化吸收率，從而促進動物生長。

芽孢是一種休眠體，是其產生菌在生長過程中對不良環境的一種自我保護，并非細菌生長周期的一個必要階段，芽孢的形成受營養與環境的雙重調控 （Prabhat等，2015；Eugénie等，2012；Barak等，2005）。微生態制劑中芽孢體的產率是影響微生態應用效果的關鍵因素。因此，系統研究微生態制劑菌種的生理生化特性，找出其生長的最佳條件，同時優化其培養基成分，能夠實現高密度的培養，可以有效地降低生產成本，為微生態制劑的推廣利用奠定基礎。

本研究以本實驗室篩選的DY032為出發菌株，對其進行16S rDNA分子鑒定，然后進行培養基優化，最后利用10 L全自動發酵罐從培養溫度、pH、轉速和通氣量4個因素進行優化，為該菌株工業化生產提供了條件。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株 本實驗室從雞腸道篩選并保藏的菌株DY032。

1.2 培養基 種子培養基（MRS培養基）：蛋白胨10 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏5 g/L，葡萄糖20 g/L，吐溫80 1 mL/L，碳酸鈣3 g，磷酸氫二鉀2 g/L，無水乙酸鈉 2 g/L，檸檬酸二銨2 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，一水硫酸錳0.05 g/L，pH 6.8。

牛奶強化培養基：脫脂奶粉12 g/L。

基礎發酵培養基：葡萄糖 20 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 6.8。

1.3 菌株的分子鑒定與系統發育分析

1.3.1 基因組總DNA的提取 菌株DY032總DNA提取，采用上海生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒進行提取。

1.3.2 PCR擴增及序列分析 以DY032基因組DNA作為模板進行PCR擴增，用于菌株16S rDNA擴增的PCR反應的引物為一對細菌通用引物（7F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，1540R：5-CTACGGCTACCTTGTTACGA，由上海生工合成）。

25 μL PCR反應體系：Template（基因組DNA 20～50 ng/μL）0.5 μL；10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL；dNTP（各2.5 mM）1μL；Taq DNA聚合酶0.2 μL；16S（7F）（10 μM）0.5 μL；16S（1540 R）（10 μM）0.5 μL；加ddH2O至25 μL。

PCR反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min；循環30次；72℃總延伸10 min。

PCR產物進行2%的瓊脂糖凝膠電泳，采用上海生工SK8131膠回收試劑盒回收16S rDNA序列，序列由上海生工進行測序。將測定的序列用blast軟件與Genbank中已有序列進行同源性比較，采用Mega 4.0軟件菌株進行系統發育分析，利用Neighbor-Joining法構建系統發育樹。

1.4 菌種培養

1.4.1 菌種活化 將冷凍干燥保存的菌種接入液體種子試管，37℃、160 r/min培養24 h，然后挑取菌液，MRS固體平板劃線，37℃靜置培養48 h，待單菌落長出后，挑選菌落小，透明圈較大菌落。

1.4.2 菌種強化 將挑選到的菌落接種到牛奶試管強化液體培養基中，37℃、160 r/min培養24～ 48 h，待牛奶凝固后測定牛奶酸度，待牛奶酸度大于2.0時，挑取菌液劃線培養，否則繼續強化。

1.4.3 斜面種子制備 取MRS固體斜面數支，挑取強化好的菌種劃斜面，37℃靜置培養24 h，作為種子。

1.4.4 種子液的制備 從斜面上挑取一環接種到100 mL三角瓶中，裝液量40 mL，37℃、160 r/min，振蕩培養24 h備用。

1.4.5 三角瓶培養 將上述種子液，按照1%的接種量接種到碳氮源基礎培養基中，250 mL三角瓶裝液量100 mL，于37℃、160 r/min條件下搖瓶培養48 h。

1.4.6 菌數及芽孢數檢測方法 菌體數：活菌計數采用平板計數法。芽孢數：培養后菌液于80℃水浴15 min后稀釋涂平板。

芽孢率/%=（芽孢數/活菌數）×100。

1.4.7 發酵罐培養方法 使用火焰接種法，接種量1%，將搖瓶培養24 h的種子接入發酵罐。

1.5 菌種培養基優化單因素試驗 配制不同的培養基，分別探討碳源、氮源和無機鹽3個單因素對發酵的影響。

1.5.1 碳源優化試驗 在基礎發酵培養基的基礎上，分別選擇葡萄糖、糖蜜、麩皮、淀粉、玉米粉為碳源（替代基礎發酵培養基中的葡萄糖），每種原料濃度設置低、中、高3個水平，濃度梯度水平見表1，每個水平設2個重復，細菌及芽孢數量取平均值，根據結果篩選出最優的碳源及其適宜濃度。

表1 不同碳源及其濃度 g/L

1.5.2 氮源優化試驗 在基礎發酵培養基的基礎上，分別選擇蛋白胨 、酵母粉、魚粉、魚粉+豆餅粉、豆餅粉、硫酸銨為氮源，每種原料設置低、中、高3個水平，濃度梯度水平見表2，每個水平設2個重復，細菌及芽孢數量取平均值，根據結果篩選出最優氮源及其適宜濃度。

1.5.3 無機鹽優化試驗 在基礎發酵培養基的基礎上，分別選擇無機鹽MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O、CuSO4·5H2O、CaCl2、FeSO4·7H2O、NaCl，每種原料設置低、中、高3個水平，濃度梯度水平見表3，每個水平設2個重復，細菌及芽孢數量取平均值，根據結果篩選出最優無機鹽及其適宜濃度。

表2 不同氮源及其濃度 g/L

表3 不同無機鹽及其濃度 g/L

1.6 正交試驗 將篩選出的最佳碳源、氮源和無機鹽進行正交試驗，進一步確定各培養基成分的最適添加量。

1.7 菌株DY032發酵罐培養條件優化 在選出的最優培養基基礎上，對菌株DY032進行發酵罐小試培養條件的探索，選取培養溫度、轉速、通氣量、pH值4個因素，根據前期搖瓶培養的研究結果，分別設定3個水平進行L9（34）正交試驗，發酵罐裝液系數60%，培養時間48 h，以芽孢數為指標確定最佳培養條件組合，并進行驗證試驗，因素水平見表4。

表4 正交試驗因素與水平

1.8 數據統計與分析 采用Microsoft Excel軟件對數據進行整理，采用SAS 9.0軟件中的anova進行方差分析，并用鄧肯新復極差法進行顯著性多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌種鑒定結果 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1所示。擴增的片段為單一的譜帶，無明顯特異擴增現象，大小約為1.5 kb。

圖1 PCR電泳結果

膠回收16S rDNA序列，由上海生工測序結果表明，菌株DY032序列長度為1426 bp，序列比對結果見表5，可見菌株DY032與Bacillus subtilis subsp.inaquosorum 16S rDNA相似度達100%。

表5 菌株DY032 16S核糖體DNA序列比對結果

2.2 菌株DY032系統進化分析 利用NCBI中的blast軟件在線分析菌株DY032 16S rDNA序列，并與Genbank數據庫中不同菌株的16S rDNA序列進行同源性比較，用Maga 4.0軟件繪制N-J系統進化樹。如圖 2所示，DY032與 Bacillus subtilis subsp.Inaquosorum親緣關系最近，說明菌株DY032為枯草芽孢桿菌。

2.3 菌種培養基單因素優化試驗結果

2.3.1 碳源對發酵的影響 不同碳源對菌株DY032發酵水平的影響結果見表6。五種碳源活菌數大小依次為：葡萄糖、淀粉、糖蜜、玉米粉和麩皮，碳源為葡萄糖時，活菌數最高，其中葡萄糖濃度為30 g/L時，活菌數數最高，達到28.22×108cfu/mL，但與20 g/L葡萄糖組差異不顯著（P＞0.05）。淀粉濃度為20 g/L和30 g/L時，芽孢數顯著高于其他各組（P＜0.05），但兩組之間芽孢數差異不顯著（P＞0.05），分別為13.50×108cfu/mL和14.50×108cfu/mL，芽孢率可達55.6%和56.2%；以糖蜜為碳源時菌體數較高，但芽孢率較低，可能與糖蜜中某些成分抑制芽孢的形成有關；麩皮為碳源時，菌體數最低，顯著低于其他各組（P＜0.05），菌體數分別為6.33×108、6.52×108、7.262×108cfu/mL，但芽孢率仍可達到40%以上，可能由于麩皮的營養組成不利于菌體的生長但利于芽孢的產生。綜合考慮菌體數和芽孢數，選擇20 g/L的淀粉為發酵培養基最佳碳源。

圖2 DY032的系統發育樹

表6 不同碳源及其濃度對菌株DY032菌數及芽孢率的影響

2.3.2 氮源對發酵的影響 不同氮源對菌株DY032發酵水平的影響結果見表7。以魚粉、魚粉+豆餅粉、豆餅粉等為氮源時，菌株DY032活菌數和芽孢數均較高，其中魚粉+豆餅粉組中，魚粉與豆餅粉濃度分別為10 g/L時，芽孢數最高（P＜0.05），達到26.61×108cfu/mL，芽孢率達到66.1%。以硫酸銨為氮源時，活菌數最低（P＜0.05），可見，不同氮源對菌株DY032的活菌數和芽孢數有較大影響，考慮到原料活菌數、芽孢數及成本，選取魚粉+豆餅粉為最優氮源。

表7 不同氮源及其濃度對菌株DY032菌數及芽孢率的影響

2.3.3 不同無機鹽對發酵的影響 不同無機鹽對菌株DY032發酵水平的影響結果見表8。以Ca-CO3、MnSO4·H2O、NaCl和MgSO4·7H2O為無機鹽時，隨著濃度的增加對菌株DY032芽孢率有不同程度的促進作用，當MnSO4·H2O濃度為0.05 g/L時，菌體數和芽孢數均顯著高于其他各組 （P＜0.05），菌體數為25.82×108cfu/mL，芽孢數為17.64× 108cfu/mL，芽孢率可達68.3%。以濃度為0.05 g/L CaCO3為無機鹽時，芽孢數達到17.91×108cfu/mL，芽孢率達到75.8%，與0.05 g/L MnSO4·H2O作為無機鹽時，芽孢數差異不顯著 （P＞0.05）。而隨著CuSO4·5H2O濃度的增加，芽孢產率顯著下降。因此，選取芽孢產率較高的CaCO3和MnSO4·H2O作為培養基無機鹽，并且濃度選擇為0.05 g/L。

表8 不同無機鹽及其濃度對菌株DY032菌數及芽孢率的影響

表9 正交試驗因素與水平 g/L

表10 培養基正交試驗結果與分析

表11 正交試驗方差分析結果

2.4 菌株DY032培養基正交優化試驗 基于上述單因素試驗的結果，培養基配方碳源選取淀粉，氮源選取魚粉+豆餅粉，無機鹽選取MnSO4·H2O和CaCO3，由于培養基各組分之間相互影響，設計出5因素4水平L16（45）正交試驗表，以芽孢數為指標通過正交試驗來尋求培養基各組分之間的最佳配比。表9為正交試驗因素水平表，表10為芽孢數的優化結果，芽孢數的極差分析結果表明，RA＞RC＞RE＞RD＞RB，可見，對芽孢數影響因素順序依次是淀粉、豆餅粉、CaCO3、MnSO4·H2O和魚粉，由正交試驗方差分析結果（表11）可知，淀粉、豆餅粉、CaCO3和MnSO4·H2O各水平間差異極顯著（P＜0.01），魚粉各水平間差異顯著（P＜0.05），通過Duncan’s多重比較（表12），進一步確定各因素各水平間的差異顯著性，得出最佳水平組合為A2B3C3D3E2，所對應的培養基配方為：淀粉16 g/L，魚粉10 g/L，豆餅粉10 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO30.03 g/L，以這一組最優培養基組合為配方進行培養48 h后，芽孢數可達45.43×108cfu/mL。

2.5 菌株DY032發酵罐小試培養條件優化試驗菌株DY032培養條件極差分析結果 （表13）表明，RA＞RD＞RC＞RB，可見對菌種芽孢數影響最大的因素是溫度，其次是通氣量，然后是轉速和pH值，正交試驗方差分析結果（表14）顯示，除pH值外，其余各因素各水平差異極顯著（P＜0.01），通過Duncan’s多重比較進一步對各因素各水平間進行差異顯著性分析（表15），得出最優培養條件組合為A2B2C2D2，即培養溫度為37℃，pH值為7.0，轉速為200 r/min，通氣量為4 L/min。由于培養條件最優組合不對應正交試驗表格中設計的試驗，將分析后的這一最優組合進行驗證，得到芽孢數為49.23×108cfu/mL，結果小于芽孢數最高的試驗組合4，所以將菌株DY032的最優培養條件定為試驗組合4，即培養溫度為37℃，pH值為6.5，轉速為200 r/min，通氣量為5 L/min。

表12 菌株DY032培養基各水平Duncan’s多重比較結果

表13 菌株DY032培養條件正交試驗結果與分析

表14 菌株DY032培養條件正交試驗方差分析結果

3 討論

本研究結果表明，影響芽孢產生的因素包括兩方面：一是培養基各成分及其濃度；二是菌種培養條件。

從單因素試驗結果上看，不同碳源對菌體數和芽孢數的影響差異較大，以葡萄糖為碳源時，菌體數最高 （P＜0.05），但芽孢率最高只有42.0%，葡萄糖濃度為30g/L時，芽孢率只有30%，可能是因為葡萄糖為速效碳源，在菌體生長過程中能夠被快速利用，但前期產生了分解代謝阻遏物（葡萄糖效應），菌種不能進一步利用葡萄糖，導致后期培養液濃度過高而抑制了芽孢的產生。這與楊立華等（2010）與郭夏麗等（2012）的研究結果一致。

以麩皮與玉米粉為碳源時，菌體數較低，但芽孢率較高，可能是麩皮與玉米粉的營養較匱乏，不利于菌體的生長，但有利于芽孢的生成。淀粉作為碳源時，芽孢率與菌體數均較高（活菌數最 高 為 25.81×108cfu/mL， 芽 孢 率 最 高 為56.2%），可能是菌株DY032在以淀粉為碳源時產生的淀粉酶，緩慢將淀粉水解為葡萄糖，菌體能利用緩慢產生的葡萄糖進行增殖，而芽孢在生長后期大量產生。

在氮源單因素優化的試驗中，以蛋白胨、酵母膏、魚粉、魚粉+豆餅粉和豆餅粉為氮源時活菌數較高，而以硫酸銨為氮源時活菌數較低，可能與該菌對有機氮源的利用較好，不能產生能利用無機氮源的酶系有關。在有機氮源組合中，以魚粉+豆餅粉組，活菌數和芽孢率最高，因為魚粉為動物蛋白，豆餅粉為植物蛋白，兩種蛋白相結合，氨基酸配比更加均衡，更利于菌株DY032的生長需要。

無機鹽具有調節細胞膜的通透性，維持正常滲透壓和酸堿平衡，參與構成酶、激素和維生素等多種生理功能。研究表明，一些金屬離子對某些菌株芽孢的形成具有顯著的影響，適宜濃度的金屬離子能有效提高芽孢的產率（Oomes等，2004；Kong等，1998）。CaCO3和MnSO4·H2O對菌株DY032芽孢的形成具有顯著促進作用 （Stefan等，2000；Hara等，1990；Busta等，1964）。Raeymaekers等（2002）指出，枯草芽孢桿菌在形成芽孢時需要一種P型Ca2+-transport ATPase的參與，這種酶作用的動力需要細胞基質內高濃度的Ca2+。Richard（1972）等通過試驗證實，Ca2+是巨大芽孢桿菌芽孢形成過程中的重要離子之一，在一定濃度范圍內，隨著Ca2+濃度的升高，菌種所產芽孢數量越多。本試驗中添加了CaCO3，還能夠中和菌株DY032培養過程中產生的乳酸，起到穩定芽孢的作用。Mn2+是微生物代謝過程中產生超氧化物歧化酶、L-阿拉伯糖異構酶等多種酶的輔助因子，能促進芽孢的產生（陳秋紅等，2009；郭小華等，2006；王天云等，2001）。姚露燕等（2008）研究了金屬離子濃度對枯草芽孢桿菌芽孢率的影響，結果發現，隨著Mn2+濃度的升高，芽孢桿菌的活菌數、芽孢數和芽孢率均逐漸升高。在本研究中，隨CuSO4·5H2O濃度的增加，菌株DY032的活菌數及芽孢數明顯下降，可能是Cu2+對菌株DY032菌體生長與芽孢產生中某些酶有抑制作用，Rodriguez等（2010）研究Cu2+對Clostridium tyrobutyricum芽孢的形成、萌發以及生長進行了系統研究，發現該菌芽孢形成與萌發對Cu2+高度敏感，培養基中的Cu2+濃度為15 ppm時能完全抑制菌體及芽孢的生長。

表15 菌株DY032培養條件Duncan’s多重比較結果

極差分析結果顯示，除pH值外，溫度、通氣量和轉速對芽孢數的影響差異極顯著 （P＜0.01）并且溫度對菌株DY032芽孢數的影響最大，溫度通過改變酶促反應的速率來影響菌體的生長，酶高效性的發揮需要適宜的溫度，在一定溫度范圍內，酶促反應隨著溫度的升高而升高，溫度過高或過低，酶的效率下降，芽孢桿菌生長代謝緩慢，菌體衰老加快，芽孢產率降低。

通氣量和轉速為影響菌株DY032芽孢數的第二和第三大因素，通氣量和轉速影響發酵液中的溶氧，菌株DY032為好氧菌，其芽孢的產生需要氧氣的參與，Mohamed等（1993）通過對球形芽孢桿菌的產芽孢率與發酵液中溶氧進行研究，證實芽孢桿菌芽孢的產生與溶氧有正相關關系，培養基中氧氣濃度越高，芽孢產量越高。

4 結論

通過16S rDNA序列測定和系統發育分析，菌株DY032鑒定為枯草芽孢桿菌，該菌株的最佳培養基配方為：淀粉16 g/L，魚粉10 g/L，豆餅粉10 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO30.03 g/L；最優發酵罐培養條件為：培養溫度37℃，pH值6.5，轉速200 r/min，通氣量5 L/min，按照最優培養條件及培養基對枯草芽孢桿菌DY032進行培養，最終芽孢數達到51.95×108cfu/mL。

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A bacterium named DY032 screened from gut of chicken，designated strain DY032，throngh the 16S rDNA sequence molecular identificaton and phylogenetic analysis，which was indicated Bacillus subtillis.Single factor test was used to optimize the fermentated medium of strain DY032.Based on the results of single factor test，five important factors that influence the viable count and spore were determined.Appropriate concentration of starch，fishmeal，soybean cake powder，MnSO4·H2O and CaCO3were 20，10，10，0.05，0.05 g/L，respectively.To determine the best proportion of the above 5 factors，L16（45）orthogonal test were used.Based on the the optimum medium，the culture temperature，pH，stirring speed and air flow rate during fermentation were optimized by the L9（34）orthogonal test in 10 L bioreactor，spores were considered as index.The results showed that the optimum medium was as follows：starch 16 g/L，fishmeal 10 g/L，soybean cake powder 10 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO30.03 g/L.The optimal culture conditions were culture temperature of 37℃，pH of 6.5，stirring speed of 200 r/min，and air flow rate of 5 L/min.Under these optimization conditions，the number of spore was up to 51.95×108cfu/mL。

strain DY032；16S rDNA；optimization

S816.3

A

1004-3314（2017）05-0013-07

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170503

山西省重點研發計劃（201603D221026-3）

*通訊作者