蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的工藝研究

王 華， 王 瑩，詹長娟，王 翼， 徐 偉

（1.南京理工大學泰州科技學院 環境與制藥工程學院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農牧科技職業學院 動物藥學院，江蘇泰州225300）

蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的工藝研究

王 華1*， 王 瑩2，詹長娟1，王 翼1， 徐 偉1

（1.南京理工大學泰州科技學院 環境與制藥工程學院，江蘇泰州 225300；2.江蘇農牧科技職業學院 動物藥學院，江蘇泰州225300）

本試驗以馬勃多糖得率為評價指標，通過研究提取溫度、時間、酶用量、pH對多糖提取率的影響，以單因素試驗和正交試驗設計優選最佳提取工藝條件。結果表明：蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的最佳提取工藝條件為提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0。在此條件下，馬勃多糖得率為0.908%。與傳統水提法相比，多糖得率提高了158.01%。由此可見，蝸牛酶輔助提取具有得率高、提取時間短、條件溫和等優點。

馬勃；多糖；蝸牛酶；提取

馬勃，俗稱馬蹄包、馬糞包、藥包子等，是一種擔子菌門真菌類中草藥（郭晶，2013）。據中國藥典（2015年版）記載，馬勃具有清肺利咽、止血等功能。近年來，國內外大量科技工作者對馬勃的化學成分進行了深入研究，發現馬勃成分具有抑菌（郭晶，2013）、抗炎 （蘇方華等，2010；左文英等，2004）、抗腫瘤細胞（崔磊等，2006）等藥理作用，并從馬勃中分離鑒定出了氨基酸鹽類、三萜類、甾醇類化合物以及蛋白質、多肽、多糖、微量元素等成分（郭晶，2013；王晨英等，2002）。姜明華等（2014）和趙友生等 （2012）在馬勃多糖抗腫瘤試驗中發現，多糖組分對宮頸癌細胞、乳腺癌細胞及小鼠艾氏腹水瘤等具有較好的抑制作用。

本研究在傳統水提法的基礎上 （黃凱等，2008），通過蝸牛酶輔助提取馬勃多糖 （馬麗雅，2010），以馬勃多糖得率為評價指標，比較溫度、時間、酶用量、pH四個因素對提取情況的影響，再經正交試驗優化提取條件，以確定最佳的提取工藝參數。

1 試驗材料與方法

1.1 原料處理 將產自河北的馬勃，經除雜，粉碎，烘干后，密封貯藏，備用。

1.2 試驗儀器與試劑 HK-02A多功能粉碎機，上海燁昌食品機械有限公司；AL104電子天平，梅特勒-托利多；SHA-B雙功能水浴恒溫振蕩器，金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV754N紫外-可見分光光度計，上海精科儀器有限公司。

D-無水葡萄糖對照品 （110833-201506），中國食品藥品檢定研究院；蝸牛酶及生化試劑，上海金穗生物科技有限公司；其余試劑為市售分析純。

1.3 試驗方法與步驟

1.3.1 馬勃多糖的提取 稱取5.0 g馬勃粉及一定量的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液加入到錐形瓶中，將錐形瓶置于水浴恒溫振蕩器中，待體系溫度穩定后，加入蝸牛酶溶液，經酶處理一段時間后，加入2 mL 30%三氯乙酸終止反應 （莫祺暉等，2015），抽濾，收集濾液，蒸發濃縮，冷卻。將量為濃縮液的1.5倍，無水乙醇慢慢加入到濃縮液中并不斷攪拌，靜置40 min，抽濾，所得濾餅即為馬勃粗多糖。將馬勃粗多糖用蒸餾水溶解并定容至250 mL，得馬勃粗多糖溶液。

1.3.2 馬勃多糖的測定 本文采用苯酚硫酸法測定多糖的含量。根據池源等（2014）的方法，以吸光度（A486）為縱坐標，葡萄糖的濃度（C）為橫坐標，繪制曲線。標準曲線方程：A=0.0055C+0.0045，R2=0.9996。結果表明，以該法測定葡萄糖的濃度，在60～140 μg/mL范圍內具有良好的線性關系（見圖1）。

圖1 苯酚-硫酸法葡萄糖標準曲線

取馬勃多糖樣品溶液1 mL于10 mL的具塞比色管中，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，加入硫酸5 mL，加蒸餾水至10 mL，搖勻，放置10 min，置40℃水浴鍋中保溫18 min，取出后冷卻至室溫，以相應的試劑為空白，在486 nm波長處測定其吸光度。

式中：C為根據標準曲線計算得到的多糖的濃度，μg/mL；V為馬勃多糖溶液的體積，mL；n為稀釋倍數；m為馬勃粉質量，g。

2 試驗結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 提取溫度對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH 5.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液及1.5%酶液（共80 mL），分別在30、35、40、45、50℃下水浴提取60 min，結果見圖2。

從圖2中可看出，30～40℃，隨著提取溫度的不斷升高，馬勃多糖得率逐漸增大，35℃后尤為明顯，當溫度達到40℃時，多糖得率達到最大值，40℃之后，多糖得率明顯降低，45℃后趨于平緩。溫度升高，有助于蝸牛酶酶解效率的提高，使得馬勃細胞壁的破壞速度加快，利于馬勃細胞內多糖分子等擴散，但是溫度過高，會使得大部分蝸牛酶結構，發生不可逆變性（肖冬光，2004）；此外，較高的溫度亦會加快多糖糖苷鍵的裂解，從而降低馬勃多糖的得率。

圖2 提取溫度對馬勃多糖得率的影響

2.1.2 提取時間對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值為5.5緩沖液及1.5%酶液（共80 mL），在40℃下分別水浴提取60、75、90、105、120 min，結果見圖3。

圖3 提取時間對馬勃多糖得率的影響

從圖3中可看出，隨著提取時間的增加，多糖得率不斷提高，當提取時間超過90 min后，多糖得率趨于穩定。這是因為提取時間延長，馬勃細胞的破壞程度加劇，胞內多糖能更多的擴散至提取液中。

2.1.3 酶用量對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中加入pH值為5.5緩沖液及分別加入 1.5%、3%、3.5%、4.0%、4.5%、5.0%、5.5%、6.0%酶液（共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，結果見圖4。

從圖4中可看出，隨著酶用量的不斷增加，多糖得率也逐漸增大，當酶用量為1.5%～4.5%時，多糖得率增大的速度較快；再增加酶用量多糖提取率趨于平緩。蝸牛酶是纖維素酶、甘露糖酶、半乳聚糖酶、蛋白水解酶、氨基酸轉移酶等混合酶（袁久剛，2014），可分解真菌細胞壁中的葡聚糖、甘露聚糖和蛋白質等物質。酶量增加，可迅速破壞細胞壁結構，有助于多糖的提取。

圖4 酶用量對馬勃多糖得率的影響

2.1.4 提取pH值對馬勃多糖得率的影響 稱取馬勃粉5.0 g，共5份，每份中分別加入pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的緩沖液以及1.5%酶液 （共80 mL），在40℃下水浴提取60 min，結果見圖5。

圖5 提取pH值對馬勃多糖得率的影響

從圖5中可看出，緩沖液pH值為5.5時，多糖得率較高，pH過高或過低，多糖得率都會下降，可能與蝸牛酶生物活性受到一定程度的影響有關。此外，pH過低會破壞多糖分子中的糖苷鍵（宋曉凱，2010），將多糖分子裂解為小分子寡糖甚至單糖，進一步降低多糖的得率。

2.2 正交試驗優化馬勃多糖的提取工藝 根據單因素試驗結果選定因素水平，以提取溫度（A）、時間（B）、酶用量（C）以及提取pH（D）作為研究對象，采用L9（34）表，設計正交提取試驗，通過對正交試驗結果進行分析，優化最佳提取工藝。

2.2.1 因素與水平 根據單因素試驗的結果，設計正交試驗，四因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平

2.2.2 試驗結果的分析與討論 正交試驗結果與分析見表2。

表2 正交試驗設計及結果

由表2中各因素極差可知，四個因素對于試驗結果的影響強弱依次為：D＞B＞A＞C（pH＞時間＞溫度＞酶用量）；最佳提取工藝條件為：提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0（A2B3C1D3）。

2.2.3 最佳提取工藝條件的驗證 由表3可知，在優化工藝條件下，馬勃多糖的平均得率達到0.908%，試驗結果進一步說明該提取工藝條件能夠達到預期目的。

2.3 最佳工藝不加酶對照試驗 按最佳工藝條件，即提取溫度35℃、提取時間120 min、pH 6.0，在此條件下，直接進行馬勃多糖的提取（蝸牛酶添加量為0），馬勃多糖得率為0.352%。

表3 驗證試驗結果

3 結論

本文研究了蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的最佳提取工藝。在單因素試驗的基礎上，應用正交試驗優化了蝸牛酶輔助提取馬勃多糖的提取條件，最終確定最佳的提取工藝條件為：提取溫度35℃、提取時間120 min、酶用量5.0%、pH 6.0，在此條件下馬勃多糖的得率為0.908%；最佳工藝不加酶的對照試驗中多糖得率僅為0.352%，多糖得率提高了158.01%。試驗結果表明，蝸牛酶破壁能力很強，能夠有效地提高馬勃真菌類多糖的提取效率，縮短提取時間，并且提取條件溫和，能耗低，故此法可為馬勃的綜合利用提供參考。

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To optimize the snailase-assisted extraction process of polysaccharides from puffball，the optimum extraction conditions were established by single-factor experiment and orthogonal analysis with polysaccharides yield as an index.The optimum extraction conditions were as follows，snailase addition was 5.0%，and pH 5.0 for 120 min extraction at 35℃，the average yield of polysaccharides was 0.908%.The yeild of polysaccharides was 158.01%higher than water extraction method.The snailase-assisted extraction method has the advantages of high yield，short extraction time and mild condition.

puffball；polysaccharide；snailase；extraction

S816.11

A

1004-3314（2017）05-0024-03

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170505

*通訊作者