羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉的研究

佟維娜 蔡 丹 鄭明珠 修 琳張 浩 陳方奇 劉景圣

（吉林農業大學食品科學與工程學院1，長春 130118）

（小麥和玉米深加工國家工程實驗室2，長春 130118）

羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉的研究

佟維娜1，2蔡 丹1，2鄭明珠1，2修 琳1，2張 浩1，2陳方奇1，2劉景圣1，2

（吉林農業大學食品科學與工程學院1，長春 130118）

（小麥和玉米深加工國家工程實驗室2，長春 130118）

以玉米蛋白粉為主要原料，采用羊肚菌對其進行固態發酵培養，確定羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉的培養基配方以及培養條件。結果表明：羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉最適培養基配方為玉米蛋白粉30 g、葡萄糖2.5%、MgSO4·7H2O 0.15%、KH2PO40.25%、含水量65%；最佳培養條件為接種量14%、培養溫度25℃、初始pH 6、發酵時間20 d。此條件下，得蛋白轉化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。對發酵前后玉米蛋白粉進行氨基酸分析，結果表明：發酵后親水性氨基酸含量比發酵前提高12.75%。對玉米蛋白粉原料和發酵后玉米蛋白粉進行掃描電鏡觀察，發酵后的玉米蛋白緊密的結構被打開，表面積增加，表面凹凸加劇，孔洞更為明顯。

玉米蛋白粉 羊肚菌 固態發酵 菌絲體生物量 蛋白轉化率

玉米蛋白粉是玉米淀粉加工過程中的主要副產物。玉米醇溶蛋白是玉米的主要貯藏蛋白，占玉米蛋白總量的50%～60%。基于溶解性和序列同源性，可以分為4類：α-玉米醇溶蛋白、β-玉米醇溶蛋白、γ玉米醇溶蛋白和δ-玉米醇溶蛋白。玉米醇溶蛋白含有豐富的谷氨酸、亮氨酸、脯氨酸和丙氨酸，從而具有良好的抗氧化性、成膜性和保水性，以及可塑性和穩定性。但由于玉米醇溶蛋白中含有高比例的疏水性氨基酸，其獨特的氨基酸組成導致玉米蛋白的水溶性差，利用價值低和營養品質較低，不能直接用于人類消費［1-2］。為了提高其利用率，國內外很多學者在尋找玉米醇溶蛋白改性方法方面作了大量工作，包括物理改性［3-5］、化學改性［6-8］、生物改性［9-10］。在化學改性的生產中比較容易造成二次污染，需消耗大量的化學試劑，并且會破壞蛋白質的結構。而物理改性存在生物轉化率低等弊端。

本試驗應用微生物固態發酵玉米蛋白粉，由于微生物發酵過程中分泌的復合酶對蛋白質發生不同程度的降解，使大分子蛋白部分降解為小分子蛋白或多肽以及氨基酸等。并且固態發酵投資少、能耗較少，不易產生廢氣，對環境污染少。我國羊肚菌資源豐富，其具有營養、藥用價值高等特點［11-12］，且羊肚菌具有豐富的纖維素酶和木質素酶，在發酵過程中能夠產生豐富的酶系，能夠更好的作用于玉米蛋白粉，降解玉米蛋白粉中的多糖、蛋白質等，在進行固態發酵玉米蛋白粉的同時不會產生真菌毒素。目前羊肚菌固態發酵主要用于廚房垃圾制備飼料、豆渣等［13-14］。

本試驗以玉米蛋白粉為主要原料，采用羊肚菌對其進行固態發酵培養，篩選最適的培養基配方，并探索最適培養條件，研究了在發酵過程中，菌絲體生物量、蛋白轉化率以及發酵前后玉米蛋白粉氨基酸模式以及微觀結構的變化。為改善玉米醇溶蛋白功能特性，提高玉米蛋白粉的應用領域提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

羊肚菌菌種Me-01（Morchella esculenta）：吉林農業大學小麥和玉米深加工國家工程實驗室。

1.1.2 菌種保存斜面培養基

固體麥芽汁培養基：吉林農業大學小麥和玉米深加工國家工程實驗室。

1.1.3 試劑

玉米蛋白粉：吉林中糧生化能源銷售有限公司；玉米粉、馬鈴薯：市售；可溶性淀粉：天津市光復精細化工研究所；麥芽糖、酵母浸粉、蛋白胨：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

LD5-2B離心機：北京雷勃爾離心機有限公司；K1100全自動凱氏定氮儀：濟南海能儀器股份有限公司；日立L-8900高速氨基酸分析儀：日立高新技術公司；NL-642HT PHENOM臺式掃描電鏡：復納科學儀器（上海）有限公司；FLUO Omega多功能微孔板測讀儀：德國BMG公司。

1.3 方法

1.3.1 羊肚菌的活化

將4℃保藏的羊肚菌菌種轉接至新鮮的PDA斜面培養基，于培養箱27℃培養至第12天時采用。

1.3.2 發酵種子液的制備

葡萄糖2%，酵母浸粉1%，MgSO4·7H2O 0.075%，KH2PO40.12%，FeSO4·7H2O 0.001%，pH

值自然，121℃滅菌20 min，在無菌環境中，從活化好的斜面培養基中取3塊菌體接入到裝有30 mL液體種子培養基的100 mL三角瓶中，于27℃恒溫進行搖床振蕩培養，160 r／min培養6 d得制得發酵種子液。

1.3.3 固態發酵培養基配方優化

分別以玉米蛋白粉（15、20、25、30、35、40 g），葡萄糖（1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%），KH2PO4（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），MgSO4·7H2O（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%），含水量（50%、55%、60%、65%、70%、75%）為單因素，固定值分別為玉米蛋白粉20 g、葡萄糖2%、KH2PO40.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、含水量65%。考察這5個因素對蛋白轉化率、菌絲體生物量的影響，并選用L16（45）正交表（表1）確定最優固態發酵培養基配方。

表1 培養基配方正交試驗因素和水平

1.3.4 固態發酵培養條件優化

在固態發酵培養基配方正交試驗的基礎上，分別以培養溫度（19、22、25、28、31℃），接種量（10%、12%、14%、16%、18%），初始pH（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0），發酵時間（16、18、20、22、24 d）為單因素，固定值分別為培養溫度25℃、接種量12%、pH 6、培養時間20 d，考察這4個因素對蛋白轉化率、菌絲體生物量的影響，并選用正交表L9（34）（表2），確定最優固態發酵培養條件。

表2 培養基條件正交試驗因素和水平

1.3.5 發酵產物菌絲體生物量的測定

1.3.5.1 純菌絲體的獲得

液體擴大培養結束后，培養液用6層尼龍布過濾，將尼龍布上的濾出物用蒸餾水充分洗滌，收集濾出物，烘箱60℃烘至恒重，將烘干后的菌絲體用研缽研碎，置于干燥器中備用。

1.3.5.2 核酸的提取以及測定方法

純菌體中核酸的提取和測定：參照魏培蓮等［15］在3種固態發酵生物量測定方法的比較中的方法進行測定。稱取0.1 g純菌體，加入25 mL 5%的三氯乙酸溶液，在80℃水浴中提取25 min，并不斷攪拌，取出后冰浴，在8 000 r／min 4℃條件下離心15 min，取上清液稀釋5倍，以5%三氯乙酸作空白對照，于260 nm處測OD值。

羊肚菌固態發酵產物中核酸的提取和測定：取0.25 g干燥培養物，研磨后按純菌體中核酸的提取方法進行提取，未經發酵的固態基質采用同樣的方法處理作為空白對照，在260 nm處測OD值，所測OD值對照純菌體與核酸紫外吸收曲線關系（如圖1）換算成菌體量。

發酵產物的菌絲體生物量＝被利用的發酵產物菌絲體生物量-未經發酵的固態基質中菌絲體生物量

1.3.5.3 純菌體中核酸含量與菌體量的線性關系

羊肚菌菌體與核酸紫外吸收曲線關系，如圖1所示，純菌體與核酸紫外吸收曲線關系回歸方程為：y＝3.777 7x+0.013 6，相關系數R2＝0.999 2；式中：y為260 nm波長處的吸光值；x為每克干基質中菌絲體的生物量。

1.3.6 蛋白轉化率的測定

總蛋白的測定：參照GB 5009.5—2010凱氏定氮法測定。可溶性蛋白的測定：稱取樣品0.5 g，加8 mL水研磨，4 000 r／min離心10 min，上清液定容至10 mL，再應用GB 5009.5—2010凱氏定氮法測定蛋白含量。

圖1 純菌體中核酸量與菌絲體質量的關系

蛋白轉化率按照公式進行計算［16-17］：

蛋白轉化率／%＝（可溶性蛋白的含量÷原發酵培養基中的總蛋白含量）×100%

1.3.7 發酵前后氨基酸成分以及含量對比

利用L-8900高速氨基酸分析儀對玉米蛋白粉及最優條件下發酵產物的組分進行氨基酸組成以及含量的測定。

1.3.8 掃描電鏡樣品處理

將發酵前后的玉米蛋白粉進行烘干，分別均勻固定在電鏡進樣臺上，真空條件下進行噴金，然后固定在載物臺上，在1 000倍和4 000倍下尋找有代表性的圖片進行拍照。

2 結果與分析

2.1培養基配方的單因素試驗

2.1.1 最適氮源和碳源添加量的確定

如圖2所示，當玉米蛋白粉添加量為20 g時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為17.32%，

0.093 4 g／g；當葡萄糖添加量為2.0%時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為17.32%、0.093 4 g／g。

圖2 最適氮源和碳源添加量的確定

2.1.2 最適MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定

如圖3所示，當MgSO4·7H2O為0.2%時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為17.43%、0.093 4 g／g；當KH2PO4為0.15%時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為17.52%、0.102 3 g／g。

圖3 MgSO4·7H2O和KH2PO4添加量的確定

2.1.3 最適含水量的確定

如圖4所示，當含水量為65%時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為17.43%、0.093 4 g／g。

圖4 最適含水量的確定

2.2 培養基配方的正交優化試驗

正交試驗設計結果見表3。從正交試驗結果得出，當以菌絲體生物量為指標時，影響菌絲體生物量的主次順序為A＞B＞C＞E＞D，最優培養基配方A3B2C3D1E4不在這16組中，所以進行驗證試驗，通過驗證試驗得蛋白轉化率為21.12%，菌絲體生物量為0.131 2 g／g。當以蛋白轉化率為指標時，影響蛋白轉化率的主次順序為A＞B＞C＞D＞E，最優培養基配方A3B3C3D2E4不在這16組中，所以進行驗證試驗，通過驗證試驗得蛋白轉化率為21.92%，菌絲體生物量為0.132 3 g／g。

表3 培養基配方正交試驗結果

由于以菌絲體生物量為指標和以蛋白轉化率為指標得出的最終結果不一致，通過數據分析得知以蛋白轉化率為指標得到的蛋白轉化率、菌絲體生物量比以菌絲體生物量為指標得出的高0.8%、0.001 1 g／g。故選取以蛋白轉化率為指標所確定的培養基配方A3B3C3D2E4，即含水量65%，玉米蛋白粉30 g，葡萄糖2.5%，MgSO4·7H2O 0.15%，KH2PO40.25%。

2.3 固態發酵培養條件單因素試驗

2.3.1 培養溫度和接種量的確定

如圖5所示，當溫度為25℃時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g；當接種量為14%時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為22.36%、0.136 9 g／g。

2.3.2 培養基初始pH和培養時間的確定

如圖6所示，當初始pH為6時，蛋白轉化率、菌絲體生物量最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g；當發酵時間為20 d時，蛋白轉化率、菌絲體生物最高，分別為21.92%、0.132 3 g／g。

2.4 固態發酵培養條件的正交優化試驗

正交試驗設計結果見表4。由正交試驗結果得，以菌絲體生物量為指標，影響菌絲體生物量的主次順序為A＞D＞C＞B，最佳培養條件A2B2C2D2，蛋白轉化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。當以蛋白轉化率為指標時，影響菌絲體生物量的主次順序為A＞D＞C＞B，最佳培養條件A2B3C1D2，蛋白轉化率為18.92%，菌絲體生物量為0.125 7 g／g。

圖5 培養溫度和接種量的確定

圖6 最適pH和培養時間的確定

表4 培養條件正交試驗結果

由于以菌絲體生物量為指標和以蛋白轉化率為指標得出的最終結果不一致，數據分析得知以菌絲體生物量為指標得到的菌絲體生物量、蛋白轉化率比以蛋白轉化率為指標得出的高0.011 2 g／g、3.34%。故選取以菌絲體生物量為指標所確定的培養條件A2B2C2D2，即接種量14%，培養溫度25℃，初始pH 6，發酵時間20 d。

2.5 玉米蛋白粉與發酵產物的氨基酸分析

將玉米蛋白粉與最優培養條件下發酵產物的氨基酸進行對比，如表5所示。

表5 發酵前后玉米蛋白粉的氨基酸分析對比

從圖7可以看出，發酵前后玉米蛋白粉氨基酸構成基本上保持一致，但發酵后親水性氨基酸所占百分比發酵前提高了12.75%，該現象表明，羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉不但在一定程度上保留了玉米蛋白的原有氨基酸的模式，而且使得親水性氨基酸含量增高，更有利于應用。

圖7 發酵前后親水性氨基酸和疏水性氨基酸對比

2.6 掃描電鏡結果分析

由圖8可見，玉米蛋白粉在發酵前后的微觀結構產生了變化。玉米蛋白粉微觀結構的大小及形狀無規則性，表面凹凸不平，呈現極為緊密的狀態。與玉米蛋白粉相比可看出，發酵后的玉米蛋白粉表面積增加且表面凹凸加劇，孔洞的結構更為明顯。此現象表明，在發酵過程中，羊肚菌代謝產生蛋白酶，玉米蛋白粉底物與酶的充分接觸，在酶解情況下，打開了玉米蛋白粉緊密的結構，促使水溶性增加。

圖8 發酵前后玉米蛋白粉掃描電鏡圖片（×4 000）

3 結論

綜合羊肚菌固態發酵玉米蛋白粉培養基配方優化和培養條件優化結果，可以得出，玉米蛋白粉30 g、含水量65%、葡萄糖2.5%、MgSO4·7H2O 0.15%、KH2PO40.25%、接種量14%、培養溫度25℃、初始pH 6、發酵時間20 d。在此條件下蛋白轉化率為22.36%，菌絲體生物量為0.136 9 g／g。測得發酵后親水性氨基酸所占百分含量比發酵前提高了12.75%，同時通過掃描電鏡觀察得出，發酵后的玉米蛋白緊密的結構被打開，表面凹凸加劇，表面積增加，孔洞更為明顯。

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Solid Fermentation for Zein by Morchella Esculenta

Tong Weina1，2Cai Dan1，2Zheng Mingzhu1，2Xiu Lin1，2Zhang Hao1，2Chen Fangqi1，2Liu Jingsheng1，2

（College of food science and Engineering，Jilin Agricultural University1，Changchun 130118）
（National Engineering Laboratory for Wheat&Corn Further Processing2，Changchun 130118）

This experiment determined the medium formulation and cultural condition of solid-state fermentation of zein using morchella esculenta with corn protein powders as the main materials，in which morchella esculenta was implemented with solid fermental cultivation.The results showed that the optimum medium formulation was：30 g corn protein powders，21%glucose，0.15%MgSO4·7H2O，0.15%KH2PO4，65%H2O；the optimum cultural condition was：14%Morchella inoculum size，cultural temperature 25℃，initial pH 6，fermentation for 20 d.The ratio of protein transformation and mycelium biomass were 22.36%，0.136 9 g／g under the above conditions，respectively.The amino acid analysis of corn protein powders before and after fermentation showed that the content of hydrophilic amino acids was increased by 12.75%compared to corn protein powders before fermentation.The scanning election microscope analysis of corn protein powders before and after fermentation showed that the tight structure of proteins was opened，surface areas were increased，convexo-concave degree was grown on，and holes were more apparent after fermentation.

zein，Morchella esculenta，solid fermentation，mycelium biomass，protein conversion rate

TS210

A

1003-0174（2017）01-0113-06

吉林省科技發展計劃（20140204011NY），國家現代農業產業技術體系（CARS02-29）

2015-06-15

佟維娜，女，1987年出生，碩士，發酵微生物的選育與代謝調控

劉景圣，男，1964年出生，教授，糧食深加工與功能性食品