產后患子宮內膜炎對奶牛血清和子宮黏液中免疫球蛋白質量濃度的影響

那立冬，張世棟，董書偉，閆寶琪，楊洪早，桑夢琪，賈 寧，王東升，嚴作廷

(1. 甘肅農業大學 動物醫學院，蘭州 730070；2. 中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

產后患子宮內膜炎對奶牛血清和子宮黏液中免疫球蛋白質量濃度的影響

那立冬1,2，張世棟2，董書偉2，閆寶琪2，楊洪早1,2，桑夢琪2，賈 寧1，王東升1,2，嚴作廷1,2

(1. 甘肅農業大學 動物醫學院，蘭州 730070；2. 中國農業科學院 蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

為比較分娩后患子宮內膜炎奶牛和健康奶牛血清及子宮黏液中IgA、IgM和IgG的變化，采用酶聯免疫吸附測定法分別對奶牛血清和子宮黏液中IgA、IgM和IgG的質量濃度進行定量檢測。結果表明，患病奶牛血清中的IgA和健康奶牛子宮黏液中的IgA持續降低，子宮黏液中IgA先降低后升高，健康奶牛血清中IgA變化不大；患病奶牛和健康奶牛子宮黏液和血清中IgG均先降低后升高；健康奶牛血清和子宮黏液中IgM先降低后升高，患病奶牛子宮黏液中IgM先升高后降低，后又升高，患病奶牛血清中IgM逐漸降低；患病奶牛血清中IgG始終高于健康奶牛的，說明IgG在全身體液免疫中發揮主要作用；患病奶牛子宮黏液的IgA和IgM高于健康奶牛，說明IgA和IgM在子宮局部免疫中發揮主要作用。

奶牛；子宮內膜炎；免疫球蛋白；質量濃度

子宮內膜炎是導致奶牛不孕的主要生殖疾病[1-2]，常引起奶牛子宮復舊延遲，卵泡發育和功能異常，繁殖力降低，屢配不孕，產奶量下降，致使治療費用和淘汰率增加，經濟效益降低，給奶牛養殖業造成嚴重的經濟損失[3-5]。子宮內膜炎發生的主要原因是由于分娩時子宮頸開張和子宮內環境的急劇變化，細菌等主要的病原微生物趁機進入子宮，導致奶牛子宮細菌污染，尤其在產后1周內奶牛子宮的污染率達90%～100%，產后7 d左右子宮細菌達到動態平衡，即數量最多，產后10～14 d子宮內持續存在多種條件性致病菌，正常奶牛產后2～4周內大部分細菌被自發性排出，產后6周子宮污染物被徹底清除[6-8]。然而，至少20%的奶牛因為一些強致病性細菌的持續存在，或因子宮的免疫防御體系遭到破壞，機體未能將細菌排出，會導致子宮感染引起子宮內膜炎[9]。分娩后奶牛的免疫機能高低對子宮是否發生感染起著重要作用，特異性免疫球蛋白(immune globulin，Ig)在奶牛子宮復舊過程中發揮的作用極為關鍵[10]。Ig是體液免疫和局部黏膜免疫發揮重要作用的特異性免疫蛋白，普遍存在于動物血液、淋巴液、組織液和外分泌液中，在奶牛產后對抗子宮感染中起著重要作用[11]。因此，比較產后患子宮內膜炎奶牛和健康奶牛Ig質量濃度變化規律可以反映產后子宮的狀態。近年來，國內外學者對分娩前后3周奶牛免疫狀態的研究較多[12-14]，但對分娩3周后子宮復舊過程中奶牛免疫狀態的研究較少。本試驗以分娩后21～42 d奶牛為研究對象，檢測血清和子宮黏液中IgA、IgG和IgM的質量濃度，結合奶牛子宮狀態比較患子宮內膜炎奶牛和健康奶牛Ig質量濃度的變化趨勢，為臨床診斷、治療和預防奶牛子宮內膜炎提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及分組

試驗選用的中國荷斯坦奶牛由甘肅省某奶牛養殖場提供。選擇年齡在3～8歲、分娩時間相近、無其他疾病的產后奶牛，在產后21 d通過直腸檢查和陰道分泌物性狀鑒定，篩選出健康奶牛和臨床型子宮內膜炎奶牛(患病牛)各9頭，試驗用奶牛采用牛場標準飼養管理程序進行飼喂。

1.2 樣品采集和處理

于產后21、28、35和42 d采集每頭奶牛的血液和子宮黏液。通過頸靜脈采集血液約10 mL，分離血清，分裝，低溫保存帶回實驗室，-80 ℃保存，待用；通過子宮頸按摩方法將子宮黏液收集至試管，約50 mL。低溫保存帶回實驗室，-80 ℃保存至少24 h，待黏液凍結后將凍結的黏液組織迅速取出約0.4 g，轉移至組織研磨器中，按照1∶4(質量∶體積)的比例加入生理鹽水，充分研磨后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清液，分裝，-80 ℃保存，待用。

1.3 主要試劑及器材

牛IgA ELISA定量檢測試劑盒(貨號140321)、牛IgG ELISA定量檢測試劑盒(貨號140711)和牛IgM ELISA定量檢測試劑盒(貨號140605)，Bethyl 公司產品；酶標板恒溫振蕩器(Abson；micbio-Ⅱ)；酶標儀(Thermo；MK3)；臺式離心機(Scilogex；DMO412)等。

1.4 免疫球蛋白質量濃度測定

采用酶聯免疫吸附雙抗體夾心法定量檢測奶牛血清和子宮黏液中IgA、IgM和IgG的質量濃度。試驗操作嚴格按照試劑盒操作說明進行。

1.5 數據分析

數據以“平均值±標準差”表示，采用SPSS 19.0和GraphPad prism 5.0軟件進行統計分析。組間數據比較采用t檢驗。

2 結果與分析

2.1 產后奶牛血清和子宮黏液中IgA的質量濃度變化

由圖1和圖2可知，健康奶牛血清中IgA質量濃度從產后21 d(0.183 g/L)開始下降，在28 d(0.116 g/L)后略有升高，42 d降至最低(0.107 g/L)。患病奶牛血清中IgA質量濃度在21 d最高(0.300 g/L)，35 d降至最低(0.124 g/L)(圖1)；健康奶牛子宮黏液中IgA質量濃度在產后21 d 最高(0.419 g/L)，21～42 d逐漸降低，42 d最低(0.096 g/L)。患病奶牛子宮黏液中IgA質量濃度在21 d(0.692 g/L)開始降低，35 d最低(0.297 g/L)，而在42 d迅速升高(1.311 g/L)(圖2)；患病奶牛血清在21 d極顯著高于健康奶牛(P<0.01)，在28 d顯著高于健康奶牛(P<0.05)。奶牛子宮黏液在21 d和28 d患病奶牛顯著高于健康奶牛(P<0.05)，42 d患病奶牛極顯著高于健康奶牛(P<0.01)；患病奶牛血清中IgA質量濃度持續降低，健康奶牛血清中IgA質量濃度變化不大。患病奶牛子宮黏液中IgA質量濃度先降低后升高，健康奶牛子宮黏液中IgA質量濃度持續降低。

產后時間相同的患病奶牛與健康奶牛相比，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下圖同。Compared endometritis cows having same postpartum days with healthy cows,* means significant difference atP<0.05，** means significant difference at theP<0.01.The same as below.

圖1 奶牛血清中IgA質量濃度
Fig.1 Mass concentration of IgA in cows serum

圖2 奶牛子宮黏液中IgA質量濃度Fig.2 Mass concentration of IgA in cows uterus mucus

2.2 產后奶牛血清和子宮黏液中IgG的質量濃度變化

由圖3和圖4可知，健康奶牛血清中IgG質量濃度在產后21 d最高(26.929 g/L)，35 d降至21.786 g/L，到42 d升高至25.280 g/L。患病奶牛血清中IgG質量濃度在21 d最高(37.990 g/L)，35 d降至最低(27.181 g/L)，42 d小幅度升高(27.731 g/L)(圖3)；健康奶牛子宮黏液中IgG在產后21 d為9.793 g/L，28 d(6.919 g/L)小幅度降低，28～42 d先迅速升高后緩慢升至最高(34.309 g/L)。患病奶牛子宮黏液中IgG質量濃度在21～28 d緩慢升至19.249 g/L，在35 d降至最低(9.960 g/L)，42 d快速升至最高(31.074 g/L)(圖4)；患病奶牛血清IgG質量濃度在21 d顯著高于健康奶牛(P<0.05)，28 d極顯著高于健康奶牛(P<0.01)。患病奶牛子宮黏液IgG質量濃度21 d顯著高于健康奶牛(P<0.05)，28 d患病奶牛極顯著高于健康奶牛(P<0.01)，在35 d健康奶牛極顯著高于患病奶牛(P<0.01)。健康和患病奶牛血清中IgG質量濃度先降低后升高，且患病奶牛血清中IgG質量濃度始終高于健康奶牛。健康和患病奶牛子宮黏液中IgG質量濃度在21～42 d先降低后升高。

圖3 奶牛血清中IgG質量濃度Fig.3 Mass concentration of IgG in cows serum

圖4 奶牛子宮黏液中IgG質量濃度Fig.4 Mass concentration of IgG in cows uterus mucus

2.3 產后奶牛血清和子宮黏液中IgM的質量濃度變化

由圖5和圖6可知，健康奶牛血清中IgM質量濃度在產后21 d最高(3.543 g/L)，35 d降至最低(2.540 g/L)，42 d升高至2.817 g/L。患病奶牛血清中IgM質量濃度在21 d最高(3.374 g/L)，在42 d降至最低(2.591 g/L)(圖5)；健康奶牛子宮黏液中IgM質量濃度在產后21 d為0.442 g/L，28 d降至最低(0.044 g/L)，在35 d升高至0.201 g/L，在42 d降低至0.043 g/L。患病奶牛子宮黏液中 IgM 質量濃度在21 d為1.164g/L，28d升至最高(1.650g/L)，35d降低至1.294 g/L，42 d質量濃度升高至1.363 g/L(圖6)；21～42 d患病奶牛子宮黏液中IgM質量濃度極顯著高于健康奶牛(P<0.01)；患病奶牛血清中IgM質量濃度逐漸降低，健康奶牛血清中IgM質量濃度先降低后升高。患病奶牛子宮黏液中IgM質量濃度先升高后降低，后又升高，健康奶牛子宮黏液中IgM質量濃度先降低后升高。

圖5 奶牛血清中IgM質量濃度Fig.5 Mass concentration of IgM in cows serum

圖6 奶牛子宮黏液中IgM質量濃度Fig.6 Mass concentration of IgM in cows uterus mucus

3 討 論

產后奶牛子宮感染導致子宮內膜炎發生與機體免疫狀態有著密切聯系，Ig作為體液免疫的重要成分，在子宮局部黏膜中發揮重要作用，由病原微生物感染引起子宮炎癥時，機體產生一系列的免疫答應，引起血液中Ig質量濃度迅速升高，部分Ig會被轉移至子宮，同時子宮局部黏膜也會產生Ig，這些Ig一方面會直接作用于病原微生物，并在激活的補體系統的協助下使其溶解，同時也會通過對中性粒細胞調控使其發揮吞噬作用，所以Ig質量濃度變化可有效反映子宮的免疫狀態[15-16]。本試驗測定產后21～42 d健康奶牛與患子宮內膜炎奶牛血清和子宮黏液中IgA、IgG和IgM的質量濃度，并對健康奶牛和患子宮內膜炎奶牛的這些指標進行比較，分析產后患子宮內膜炎對奶牛血清和子宮黏液中Ig質量濃度的影響。

通過酶聯免疫吸附試驗方法檢測Ig質量濃度，具有操作簡單、靈敏度高的特點，且能定量反映Ig質量濃度變化。Ig變化的時間早于臨床表現、病理變化，是判定子宮內膜炎發生的重要指標。可以運用此方法對奶牛子宮內膜炎癥的變化進行動態監測，Ig變化幅度較大時，意味著可能發生子宮感染，應引起高度重視。但此檢測方法應用也存在問題，血清中的Ig是全身性抗原感染的綜合表現，不能定位局部。

有研究表明，產后健康奶牛血清中Ig以IgG和IgM為主，IgA質量濃度很低[17-19]，與本研究結果一致。奶牛子宮黏液中Ig以IgG和IgA為主，IgM質量濃度則很低[20]。但本研究對患病奶牛Ig質量濃度檢測發現，患病奶牛子宮黏液中IgM的質量濃度高于IgA，且極顯著高于健康奶牛，可能是由于子宮復舊過程健康奶牛子宮中主要以IgG和IgA免疫為主，但發生子宮感染則會誘導IgM大量產生并參與抗感染作用。本研究還發現，患病奶牛血清中IgM質量濃度與健康奶牛并無差異，可能原因是子宮感染后血液中增加的IgM轉移至子宮，引起子宮黏液IgM的升高，增強子宮的抗感染作用。

產后奶牛子宮遭受到病原微生物污染時，大部分奶牛在分娩后2～4周通過自身的免疫調節和子宮復舊能清除病原微生物，從而恢復子宮的正常功能[8,18]。本研究發現，患病奶牛血清和子宮黏液中IgA和IgG質量濃度在21～28 d均高于健康奶牛，并在28～35 d逐漸降低，在35 d除子宮黏液中IgG遠低于健康奶牛外，其他均與健康奶牛無顯著差異。患子宮內膜炎奶牛Ig質量濃度普遍高于健康奶牛這種變化規律與其他學者報道一致[6,12]。但在35 d健康子宮黏液中IgG的質量濃度突然升至相對較高水平，在42 d患病奶牛子宮黏液中IgA和IgG的質量濃度也突然的升至較高水平，這種急速的變化可能與產后子宮復舊程度有關。

試驗結果表明，患病奶牛血清中IgG質量濃度始終高于健康奶牛，說明IgG在全身體液免疫中發揮主要作用；患病奶牛子宮黏液中IgA和IgM高于健康奶牛，說明IgA和IgM在子宮局部免疫中發揮主要作用。

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(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Effects of Dairy Cows with Endometritis on Immunoglobulin Mass Concentration in Serum and Uterus Mucus of Postpartum

NA Lidong1,2,ZHANG Shidong2,DONG Shuwei2,YAN Baoqi2,YANG Hongzao1,2,SANG Mengqi2,JIA Ning1,WANG Dongsheng1,2and YAN Zuoting1,2

(1. College of Veterinary Medicine,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China； 2.Lanzhou Institute of Animal Husbandry and Pharmaceutical Sciences,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Lanzhou 730050,China )

In order to compare healthy cows with the mass concentration variation of IgA,IgM and IgG in serum and uterus mucus in postpartum dairy cows sufering from endometritis.The mass concentration of IgA,IgM and IgG in uterus mucus and serum were detected by the method of enzyme-linked immunosorbent assay. The results showed that the mass concentration of IgA reduced continuously both serum of endometritis cows and uterus mucus of healthy cows. The IgA mass concentration in uterus mucus decreased initially and then increased in cows suffering from endometritis,There was no great change in the mass concentration of IgA in the serum of healthy cows ; IgG levels of the uterus mucus and serum in endometritis cows and healthy cows decreased firstly and then increased; IgM mass concentration in serum and uterus mucus of healthy cows decreased firstly and then increased,IgM mass concentration in uterus mucus of cows with endometritis increased firstly and then decreased,the IgM levels in serum of endometritis cows gradually reduced. These indicated that IgG in serum of cows suffering from endometritis was always higher than that of healthy cows,so it is appoved that IgG played a major role in systemic humoral immunity. The mass concentration of IgA and IgM in uterus mucus of postpartum dairy cows with endometritis was higher than that of healthy cows,this results indicated that IgA and IgM played the key role in local immunity of the uterus.

Dairy cows；Endometritis；Immuneglobulin；Mass concentration

NA Lidong,male,master student.Research area:diagnosis and prevention of cow disease. E-mail:17709317797@189.cn

YAN Zuoting,male,research fellow.Research area:R&D of new traditional Chinese veterinary medicine,diagnosis and prevention of cow disease. E-mail:yanzuoting@caas.cn

日期：2017-03-30

2016-07-19

2016-09-30

中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(1610322015003)；“十二五”國家科技支撐計劃(2012BAD12B03)；中國農業科學院農業科技創新工程(CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03)。

那立冬，男，碩士研究生，研究方向為奶牛疾病診斷與防治。E-mail:17709317797@189.cn

嚴作廷，男，研究員，研究方向為中獸藥研發、奶牛疾病診斷與防治。E-mail:yanzuoting@caas.cn 王東升，男，副研究員，研究方向為中藥藥理與奶牛繁殖疾病。E-mail:lzmyswds@126.com

S857.23；S858.23

A

1004-1389(2017)04-0503-06

WANG Dongsheng,male,associate research fellow.Research area:pharmacology of Chinese medicine and dairy cow reproduction disease. E-mail:lzmyswds@126.com

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.006.html

Received 2016-07-19 Returned 2016-09-30

Foundation item Basal Scientific Research Funds for Central Public-Interest Scientific Institutions(No.1610322015003); National Science and Technology Support Program in “12th Five-year” Plan(No.2012BAD12B03);Agricultural Science and Technology Innovation Program (No.CAAS-ASTIP-2014-LIHPS-03).