66份青海審定小麥及86份人工合成小麥抗稈銹病小種Ug99的基因組成分析

劉 韜，尚 玥，張 波，劉寶龍，陳文杰，張連全，劉登才,，張懷剛

(1.中國科學院 西北高原生物研究所,西寧 810008; 2.四川農業大學 小麥研究所,成都 611130;3.中國科學院大學,北京 100049)

66份青海審定小麥及86份人工合成小麥抗稈銹病小種Ug99的基因組成分析

劉 韜1,3，尚 玥1，張 波1，劉寶龍1，陳文杰1，張連全2，劉登才1,2，張懷剛1

(1.中國科學院 西北高原生物研究所,西寧 810008; 2.四川農業大學 小麥研究所,成都 611130;3.中國科學院大學,北京 100049)

為了分析抗稈銹病小種Ug99的基因在青海審定小麥和新合成的人工小麥中的分布狀況，采用6個抗Ug99基因( Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43)的分子標記對青海省審定的66個小麥品種及86份人工合成小麥材料進行檢測。結果表明：在青海審定的66個小麥品種中，有4個品種含 Sr33，占檢測品種數的6.06%；1個品種含 Sr39，占檢測品種數的1.52%；5個品種含 Sr40，占檢測品種數的7.58%；4個品種含 Sr42，占檢測品種數的6.06%；3個品種含 Sr43，占檢測品種數的4.55%；同時含有2個抗性基因的品種僅有2個，占檢測品種數的3.03%。在86份合成小麥材料中，有38份材料含 Sr33，占檢測材料的44.19%； 31份材料含 Sr39，占檢測材料的36.05%；9份材料含 Sr40，占檢測材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占檢測材料的3.49%；6份材料含 Sr43，占檢測材料的6.98%；同時含有2種抗性基因的材料有17份，占檢測材料的19.77%。在66個小麥品種和86份人工合成小麥材料均未檢測出 Sr36。人工合成小麥提供Ug99抗病基因資源，對改良普通小麥Ug99抗病性具有潛在價值。

普通小麥；人工合成小麥；Ug99 抗性基因

小麥稈銹病(Pucciniagraminisf.sp.tritici)是全球范圍的小麥病害，對小麥破壞性極大,曾在大多數種植小麥的國家和地區出現過毀滅性的災難[1]。稈銹病可使小麥減產高達75%，一些地區甚至絕收。而中國恰好處于小麥稈銹病流行的特定區域內[2]。20世紀30至60年代曾在中國爆發過的幾次稈銹病，造成幾乎毀滅性的減產。抗稈銹病基因 Sr31在育種中的廣泛應用使得稈銹病在過去的40多年沒有大面積爆發[2]。

但是 Sr31基因對1999年在烏干達出現的新致病小種Ug99不具抗性，稈銹病再次對小麥的生產產生巨大的威脅。按北美稈銹菌小種命名法則Ug99被命名為TTKS[3]，按照現在新的鑒別寄主的體系該命名為TTKSK[4]。同時隨著孢子的不斷傳播，變種也在不斷產生，2006年和2007年人們又發現了對抗性基因 Sr24和 Sr36具有高毒力的新變異株[5,12]。Ug99被發現的隨后幾年，其夏孢子借助盛行西風的高空氣流，于2001年傳到東非的肯尼亞，2003年突破東非的防線傳入北非的埃塞俄比亞、蘇丹等國，2007年越過紅海傳到也門，目前已傳播至伊朗的部分地區[6]。如今，Ug99及其小種的傳播速度比條銹病菌傳播更快。專家們預計，由于Ug99及其小種突破了紅海這道屏障，其在未來幾年或幾十年中，傳播到世界各地將更加容易，甚至速度將更加迅速。當今世界90%以上的小麥對Ug99不具抗性[7]，2006年對中國118個小麥主栽品種在肯尼亞進行Ug99抗性鑒定，結果表明高感病品種占98.3%[8]。中國作為全世界的人口及糧食大國，所面臨的潛在威脅將遠超其他地區國家。而青海地處中國的西部，如果Ug99突破中國的邊界，將是首當其沖的幾個省份之一。

本研究利用與Ug99抗病基因緊密連鎖的分子標記，對66份青海省審定的小麥品種和86份人工合成小麥材料進行抗性基因的組成鑒定，了解普通小麥品種及人工合成小麥的抗性基因分布現狀，希望從人工合成小麥中發現Ug99抗性資源，為Ug99抗性基因分子聚合育種提供理論依據及材料信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

青海審定小麥品種66份(表1)及人工合成小麥86份(表2)，Ug99抗性基因的材料：RL5405(Sr33)、Lang(Sr36)、RL5711(Sr39)、RL6087(Sr40)、Ac-Cadillac(Sr42)、Sr43(Sr43)共6份材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 采集66份青海審定小麥、86份人工合成麥以及抗病親本適量的新鮮葉片，在液氮中冷凍研磨后，用CTAB法[10]提取基因組DNA，用微量紫外檢測儀NANODROP2000C(Thermo)測量DNA質量濃度。將DNA均稀釋到200 mg/L，用10 g/L的瓊脂糖膠在110 V電壓下電泳30 min，檢測DNA的質量。

1.2.2 特異性引物的選擇 Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43是目前發現能有效抵抗Ug99及其絕大部分毒力變種的稈銹菌抗性基因[9，11-14]。上述基因已分別在小麥染色體上定位： Sr33定位到1DL[11]， Sr36定位到2BS[15]， Sr39定位到2B[12]， Sr40定位到2BS[15]， Sr42定位到6DS[13]， Sr43定位到7D[15]。根據查閱相關NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)、參考文獻以及GrainGenes 2.0(http://wheat.pw.usda.gov)得到相應的引物序列，通過試驗對比選取穩定性較高的6對引物(表3)，引物均由奧科鼎盛生物公司合成。

表1 66份青海省審定小麥品種Table 1 66 wheat cultivars released in Qinghai province

表2 86份人工合成小麥Table 2 86 synthetic hexaploid wheat lines

表3 微衛星引物Table 3 SSR markers

1.2.3 PCR擴增及電泳檢測 用6對引物對66份青海審定小麥品種以及86份人工合成麥的基因組進行PCR擴增分析。PCR擴增體系(20 μL)為：10×Taqbuffer(200 mmol/L Tris-HCl;200 mmol/L KCl;15 mmol/L MgCl2)2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，2.5U/μLTaqDNA polymerase 0.4 μL，各引物(除FSD-RSA為FSD 12 pmol，RSA 3.5 pmol)正反序列均為5 pmol，DNA 200 ng。PCR程序為：95 ℃變性 4 min，然后35個循環的95 ℃變性 30 s，47～62 ℃復性(各引物根據試驗前期摸索的最適退火溫度確定)30 s，72 ℃ 延伸20 s，最后72 ℃延伸 10 min。不同的PCR產物根據 Sr33、Sr36、Sr39、Sr40、Sr42、Sr43的目的條帶大小，制作各自的瓊脂糖分離膠濃度；然后在TAE緩沖液中，110 V電壓下，電泳30 min；取出后在凝膠成像儀中拍照保存。

1.3 遺傳組成分析

對66份青海審定的小麥品種和86份人工合成小麥的6個抗病基因進行統計分析，并對比抗病基因在2個群體中的存在頻率。

2 結果與分析

2.1 SSR引物的篩選及最適退火溫度的確定

由于參考文獻和數據庫中給出的引物有多對，最終篩選到最適合的6對引物和其最適退火溫度(表3)： Sr33的引物Xcfd15，62 ℃； Sr36的引物STM773-2，61 ℃； Sr39的引物Sr39#2r，56 ℃； Sr40的引物WMC-661，56 ℃； Sr42的引物FSD-RSA，47 ℃； Sr43的引物Cfa2040，58 ℃。

2.2 各抗性基因在普通小麥及人工合成小麥中的分布

用確定的6對引物和最適退火溫度對66份青海審定的小麥品種和86份人工合成小麥共152份材料分別進行PCR擴增檢測，部分電泳結果見圖1。結果發現(表4)，在青海審定的66小麥品種中，有4個品種含抗性基因 Sr33，所占比例為6.06%；1個品種含 Sr39，所占比例為1.52%；5份品種含 Sr40，占檢測品種數的7.58%；4份材料含 Sr42，所占比例為6.06%；3份含 Sr43，占檢測品種數的4.55%。

M.1 kb plus DNA ladder；1.陽性對照 RL5711 Positive control RL5711；2.陰性對照Ps4-1 Negetive control Ps4-1；3.空白對照 Blank；4～24.部分檢測樣品 Some detected samples

圖1 引物Sr39#2r對部分合成麥的檢測
Fig.1 Molecular identification of some synthetic hexaploid wheats with marker Sr39#2r

86份人工合成小麥的檢測結果(表5)發現，有38份含抗性基因 Sr33，比例高達44.19%；31份材料含 Sr39，占36.05%；9份含 Sr40，占檢測材料的10.47%；3份材料含 Sr42，占3.49%；6份材料含 Sr43，占檢測材料的6.98%。

在66個小麥品種和86份合成麥材料均未檢測出 Sr36抗性基因。結果還發現，在檢測的小麥品種中同時含有2個抗性基因的品種僅有2個(表4)，占檢測品種數的3.03%；而在檢測的合成麥中同時含有2種抗性基因的材料有17份(表5)，占檢測材料的19.77%；在普通小麥品種和人工合成麥中均未檢測到同時含有3個及以上抗性基因的材料(表4、5)。

以上結果說明合成麥中的抗性基因分布明顯要高于現有的小麥品種中的抗性基因分布(圖2)，也表明同時聚合多個抗性基因的品種很少，每個品種的抗性基因過于單一。

表4 66份青海審定小麥品種抗Ug99基因檢測結果統計(陽性 +，陰性 -)Table 4 Molecular detection results of stem rust resistance genes in 66 wheat cultivars released in Qinghai province (presence +,absence -)

表5 86份人工合成小麥抗稈銹基因檢測結果統計(陽性 +，陰性 -)Table 5 The detection results of stem rust resistance genes in 86 synthetic hexaploid wheat lines (presence +,absence -)

(續表5 Continued table 5)

樣品名稱Samplename雜交組合Crosscombinations抗稈銹基因StemrustresistancegeneSr33Sr36Sr39Sr40Sr42Sr43Syn?SAU?46PI191781×AS2399+-----Syn?SAU?48PI221403×AS2399------Syn?SAU?49PI221403×AS2404+-----Syn?SAU?50PI306533×AS2405--+---Syn?SAU?51PI350001×AS2405+-----Syn?SAU?54PI352335×AS2386+-----Syn?SAU?55PI352358×AS65------Syn?SAU?57PI352367×AS2386--+--+Syn?SAU?59PI352369×AS60--+--+Syn?SAU?60PI355465×AS2405+-----Syn?SAU?61PI355476×AS2404+-----Syn?SAU?66PI355527×AS2399+-----Syn?SAU?67PI377655×AS2399+-----Syn?SAU?68PI377655×AS2386+-----Syn?SAU?69PI415152×AS60--++--Syn?SAU?70PI434998×AS2386------Syn?SAU?73PI184543×AS2386+-----Syn?SAU?74PI211691×AS2386------Syn?SAU?77PI532136×AS65-----+Syn?SAU?78AS2240×AS84--+---Syn?SAU?79AS2295×AS76---+--Syn?SAU?80AS2296×AS2388+-----Syn?SAU?81AS2298×AS79--+---Syn?SAU?82AS2299×AS79--+-+-Syn?SAU?83AS2308×AS72--+---Syn?SAU?84AS2308×AS81------Syn?SAU?85AS2310×AS60--+---Syn?SAU?86AS2313×AS2388+----+Syn?SAU?87AS2326×AS2388--+---Syn?SAU?88AS2334×AS2388--+---Syn?SAU?89AS2351×AS67--+--+Syn?SAU?90AS2378×AS82------Syn?SAU?91AS2380×AS77--+---Syn?SAU?92AS2381×AS65------Syn?SAU?93AS2382×AS2388+-----Syn?SAU?95PI154582×AS95--+---Syn?SAU?96PI221403×AS2397+----+Syn?SAU?98PI355507×AS2386+--+--Syn?SAU?99PI377655×AS2407+--+--Syn?SAU?103AS2380×AS95------Syn?SAU?106AS2291×AS2388+-----Syn?SAU?107PI113961×AS2403+-----

圖2 各抗性基因在小麥品種和合成麥中的分布Fig.2 The distribution of each resistance gene in common wheats and SHW lines

3 討 論

自從1B/1R易位系中的抗稈銹基因 Sr31在全球范圍大量引入后，稈銹菌引起的大面積減產或絕收現象得到了有力的控制[5,8]。在過去的40多年里，小麥稈銹病也未在中國出現大流行。因此，除東北及內蒙古北部的春麥區外，其他麥區育種部門均不再重視稈銹病，致使主栽品種的抗稈銹病基因單一，仍以1BL/1RS 為主，總體抗病水平下降[16]。Ug99爆發后，以其迅猛的速度傳播，越過紅海后勢頭更甚，嚴重威脅著世界各地的小麥生產，其傳播路線與國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)的地理信息系統(GIS)所預測的路線基本吻合[17]。據CIMMYT的GIS數據顯示：2008年1月至7月曾有連續72 h的伊朗哈馬達麥區上空的氣流傳入中國藏北、青海及甘肅的天氣現象[18]。本試驗研究青海審定的66份小麥品種，發現僅4份含抗性基因 Sr33，1份含抗性基因 Sr39，5份含抗性基因 Sr40，4份含抗性基因 Sr42，3份含抗性基因 Sr43。據調查和研究結果表明：作為青海省春小麥主栽品種的‘高原448’和‘阿勃’，均不帶有以上6個抗稈銹基因中的任何一個(表4)。或許這將是一個極大的危險信號，一旦稈銹孢子借助夏季盛行的西風傳入青海，極有可能會出現區域性的稈銹病區，以至中國內地省份逐漸爆發稈銹病，造成糧食減產甚至部分地區絕收，引發恐慌。本結論也可能存在不準確性，因為目前抗稈銹的基因還未完全發現，這些小麥品種中可能還含有本試驗未檢測的其他抗稈銹的微效基因。

本研究還表明，各個品種中含有的抗性基因極其單一。66份青海審定的小麥品種中僅2份含2個抗性基因。Ug99的爆發表現出稈銹病菌對 Sr31的抗性，單基因的存在也許能防一時之危，一旦病菌出現抗性變異，危害將令人措手不及。所以發掘、引進和合理利用優良的種質資源，在一個品種中聚合多個抗性基因，使得小麥抗性多樣化，才是長久防治稈銹危害的重要手段。本試驗同時也對86份人工合成小麥進行相應的抗性基因分布檢測。結果顯示，人工合成麥的抗性基因分布頻率明顯高于現有小麥品種。

人工合成小麥是利用小麥近緣物種遠緣雜交創制而成。人工合成小麥的創制將近緣物種中的優良基因帶入小麥的六倍體水平上，使得優良基因直接導入普通小麥中成為可能，極大地豐富小麥的基因庫，從而為小麥引入更多可能的抗性基因。Ug99跨越紅海進入伊朗后，對于中國西北地區小麥生產的潛在危害正與日俱增，因此，作為中國內陸小麥作物區域大門的青海，研究當地小麥品種的抗性基因分布，將人工合成麥的抗性基因導入普通小麥，通過基因聚合培育出含有多個抗性基因的優質抗病品種，防范于未然，是防止Ug99在中國爆發區域性流行和出現糧食安全問題的有效措施。

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(責任編輯：成 敏 Responsible editor:CHENG Min)

Distribution of Stem Rust Race Ug99 Resistance Gene in 66 Bread Wheat Cultivars Released in Qinghai Province and 86 Synthetic Hexaploid Wheat Lines

LIU Tao1,3,SHANG Yue1,ZHANG Bo1,LIU Baolong1,CHEN Wenjie1,ZHANG Lianquan2,LIU Dengcai1,2and ZHANG Huaigang1

(1.Northwest Institute of Plateau Biology,Chinese Academy of Sciences,Xining 810008,China;2.Triticeae Research Institute,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China;3.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China)

To analyze the distribution of stem rust race Ug99 resistance genes in spring wheat cultivars which were released in Qinghai province and the new synthetic hexaploid wheat lines,six molecular markers of Ug99 resistant genes ( Sr33, Sr36, Sr39, Sr40, Sr42, Sr43) were applied to test sixty-six wheat cultivars which were released in Qinghai province and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. Of the sixty-six Qinghai released cultivars,four cultivars carry Sr33,one cultivars carry Sr39,five cultivars carry Sr40,four cultivars carry Sr42,and three cultivars carry Sr43,accounting for 6.06%,1.52%,7.58%,6.06%,and 4.55% of the detected samples,respectively. Only two cultivars contain two resistance genes,accounting for 3.03% of the number of detected cultivars. In eighty-six synthetic hexaploid wheats,thirty-eight lines contain Sr33,accounting for 44.19%. Thirty-one lines contain Sr39,accounting for 36.05%.Nine lines contain Sr40,accounting for 10.47%.Three lines contain Sr42,accounting for 3.49%. Six lines contain Sr43,accounting for 6.98%. Meanwhile,seventeen of eighty-six synthetic hexaploid wheat lines contain two resistance genes,accounting for 19.77%. Sr36 was not detected in both sixty-six bread wheat cultivars and eighty-six synthetic hexaploid wheat lines. The results indicated that synthetic hexaploid wheat could be a potential germplasm for wheat Ug99 resistance improvement.

Bread wheat； Synthetic hexaploid wheat；Ug99 resistance genes

LIU Tao,male,master student.Research area:wheat disease resistance genetics and breeding.E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

ZHANG Huaigang,male,researcher,doctoral supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn

日期：2017-03-30

2016-05-11

2016-06-28

中國科學院戰略性A類先導科技專項子課題(XDA08030106)；青海省重點研發與轉化計劃項目(2016-HZ-808)。

劉 韜，男，碩士研究生，從事小麥抗病遺傳育種研究。E-mail:liutao415@mails.ucas.ac.cn

張懷剛，男，研究員，博士生導師，主要從事小麥遺傳育種研究。E-mail:hgzhang@nwipb.cas.cn 張 波，男，副研究員，碩士生導師，主要從事麥類作物遺傳育種研究。E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

S512.1；S326

A

1004-1389(2017)04-0523-10

ZHANG Bo,male,associate researcher,master supervisor.Research area:wheat genetics and breeding.E-mail:zhangbo@nwipb.cas.cn

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.012.html

Received 2016-05-11 Returned 2016-06-28

Foundation item The Strategic Priority Research Program of Chinese Academy of Sciences (No.XDA08030106)；the Key Research Program of Qinghai Province(No.2016-HZ-808).