秈粳交水稻花藥培養條件的優化

張選明,魏芳勤,張 星,沙志鴻,趙勝利,張秀英,王艷龍

(漢中市農業科學研究所,陜西漢中 723000)

秈粳交水稻花藥培養條件的優化

張選明,魏芳勤,張 星,沙志鴻,趙勝利,張秀英,王艷龍

(漢中市農業科學研究所,陜西漢中 723000)

旨在篩選最適出愈培養基，以水稻秈粳交品種的花藥為植體，以預處理時間、2,4-D質量濃度、播期、接種密度、葉枕間距為因素的正交試驗，通過方差分析研究影響秈粳交后代花藥出愈率的主要因素，并對其最適值進行優化。成苗階段研究MS培養基中加入4種不同植物激素、在不同的愈傷培養時間以及培養溫度處理條件下對秈粳交材料愈傷組織成苗率的影響。結果表明，不同秈粳交材料后代均在3號M8培養基的出愈率最高；預處理時間、葉枕間距的差異達到極顯著水平。在分化成苗階段，蔗糖是影響成苗階段的主要因素，其次為6-BA，且分別在30 g/L、4 mg/L時分化率最高。愈傷培養30 d轉接分化率最高；培養溫度為29 ℃時綠苗率最高。表明，M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂為最優出愈培養基；預處理時間和葉枕間距是影響出愈率的主效因子，最適宜分化培養基配比為MS+6-BA 4 mg/L +蔗糖30 g/L+瓊脂6 g/L；最佳愈傷轉接時間為30 d；最佳培養溫度為29 ℃。

水稻；秈粳交；花藥；愈傷組織；再生體系

秈粳亞種間的雜交水稻利用秈粳間遠緣雜種優勢，具有高產優質的特點，是中國重要的雜交高產水稻類型之一。秈粳交水稻的單位面積產量在全國水稻主產區一直居于前列，在糧食生產中占有重要地位[1-2]。水稻秈粳交或遠源雜交，是創制和改良水稻種質資源的重要手段，但雜交后代瘋狂分離，子代自交系穩定需要8～10代以上，選育周期長，難以利用。而利用花藥培養獲得單倍體愈傷組織分化成苗獲得的植株不存在顯隱性問題，加倍后即可獲得純合植株，縮短育種年限，加快育種進程，是一項較為實用的生物育種輔助技術[3-6]，也是建立DH群體的重要方法[7]。但育種目標的實現要求以高頻出愈率和綠苗再生率為基礎，才能保證足量的基礎群體，而在實際操作中，有很多因素影響培養效果。雖然水稻花藥培養研究相關報道較多[8-15]，但對陜南秈粳交花藥培養特性較系統的研究鮮見報道。本研究通過對秈粳交水稻花藥離體培養過程中不同培養基、激素、溫度等的研究，旨在建立穩定、高效的秈粳交水稻花藥培養再生體系，為陜西省秈粳交水稻育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試秈梗交水稻品種包括‘[(輪回422/lement)F5/華恢25]’F1(V1)、‘(臺粳56/華恢60)’ F1(V2)和‘(沈農256/中413)’F1(V3)，均由漢中市農業科學研究所水稻研究中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 花藥培養 采用2步成苗法，取花粉母細胞中處于單核靠邊期的幼穗，8～10 ℃冷柜中預處理10 d后，在超凈工作臺經φ=0.1%升汞溶液浸泡10 min，無菌水漂洗4～5次，用剪穎抖藥法接種至誘導培養基[16]，于25 ℃暗培養條件下誘導愈傷組織，誘導出的愈傷組織立即轉入分化培養基，于(29±3)℃光照條件下培養，3 000 lx光照度下誘導分化。

1.2.2 出愈傷階段培養基優化 以‘[(輪回422/lement)F5/華恢25]’F1、‘(臺粳56/華恢60)’F1和‘(沈農256/中413)’F13個秈粳交材料F1代水稻花藥為植體，接種花藥數分別為840、280、400。誘導秈粳交花藥愈傷組織基本培養基設3個配方、對應編號為1號、2號、3號(表1)，培養40 d后統計愈傷組織數，計算不同培養基的出愈率，以此篩選優化培養基。

1.2.3 出愈傷階段培養條件相關因素優化 以‘(沈農256/中413)’F1花藥為植體，設計適用4 水平1因素+ 2 水平4 因素的8 處理正交試驗(表2)。考察低溫預處理時間、浸潤稻穗莖節不同2,4-D質量濃度(ρ)、播期、接種密度、劍葉與倒二葉葉枕間距5 因素對水稻花藥培養出愈率的影響，試驗用剪穎抖藥法接種，30 d 后每隔5 d 統計出愈率。試驗數據用DPS軟件處理，篩選主效影響因子，得到最佳組合。

1.2.4 愈傷分化成苗階段的分化培養基優化 以‘(沈農256/中413)’F1愈傷組織為植體，設計4因素3水平的正交試驗[17-20](表3)，考察轉接于加入蔗糖和6-BA等4種植物激素的MS培養基上分化成苗的數目(培養30 d)，計算成綠苗率。試驗數據用DPS軟件進行方差分析。

表1 不同愈傷培養基配方Table 1 Recipes of different culture mediums

表2 L841+24正交試驗Table 2 Orthogonal table of L841+24

表3 L934正交試驗Table 3 Orthogonal table of L934

1.2.5 不同培養時間對愈傷組織分化成苗的影響 以秈粳交后代材料‘(沈農256/中413)’F1及‘[(輪回422/lement)F5/華恢25]’F1愈傷組織為植體的花藥愈傷組織為植體，分別于愈傷培養26、30、35、40、45 d接種于優化后的分化培養基，統計綠苗率。

1.2.6 愈傷分化成苗階段的培養溫度優化 以秈粳交后代材料‘(沈農256/中413)’F1愈傷組織為植體，轉接于優化后的分化培養基，愈傷組織形成30 d時分別于26、29、31 ℃ 3個培養溫度下培養30 d，統計分化的綠苗數和總苗數，計算不同培養溫度下的綠苗率。

1.2.7 統計方法 出愈率=形成愈傷組織塊數/ 接種花藥數×100%

分化率=(分化綠苗數+分化白苗數)/ 轉移愈傷組織塊數×100%

綠苗率=分化綠苗數/ (分化綠苗數+分化白苗數)×100%

2 結果與分析

2.1 出愈傷階段培養基優化

‘[(輪回422/lement)F5/華恢25]’F1在3號培養基上的出愈率最高為15.0%，2號培養基出愈率最低為9.0%。‘(臺粳56/華恢60)’F1在3號培養基上的出愈率最高為12.9%，2號培養基出愈率最低為5.4%。‘(沈農256/中413)’F1在3號培養基上的出愈率最高為21.0%，2號培養基出愈率最低為11.0%(表4)。3種不同秈粳交材料后代均以3號培養基出愈率最高，為最適宜用于陜南秈粳交材料的培養基。

表4 3個秈粳交材料接種不同培養基的出愈率Table 4 Callus rate of three indica/japonica hybrid materials in different mediums

2.2 出愈傷階段培養條件相關因素優化

以接種第40天的出愈率為數據(表5)，各個因素對出愈率的影響進行DPS 正交試驗方差分析。由表6和表7可以看出，5個因素均能影響水稻花藥培養愈傷組織的產生。預處理時間、葉枕間距的差異均達到極顯著水平(P<0.01)，播期、密度、2,4-D 質量濃度均未達到顯著水平(P>0.05)。說明預處理時間和葉枕間距是本試驗中影響出愈率的主效因子，而播期、密度、2,4-D質量濃度為非主效因子。從表7可以看出，預處理時間的極大值為K4，即預處理10 d為最佳水平，葉枕間距的極大值為K1，即葉枕間距5～8 cm為最優水平，2,4-D質量濃度、播期和接種密度的最優水平分別為K2、K1和K2，即最優組合為：4 mg/L， 60 枚/瓶，4月10日。

表5 影響出愈率的正交試驗Table 5 Orthogonal test affecting callus rate

2.3 成苗階段分化培養基優化

以接種培養第30天的分化率為數據(表8)，將各因素對分化率的影響進行DPS 正交試驗方差分析(表9，表10)。以KT為空閑列的方差分析結果可知：蔗糖質量濃度的差異達到極顯著水平(P<0.01)，6-BA、NAA的差異未達到顯著水平(P>0.05)，說明蔗糖質量濃度在本試驗中是影響分化率的主效因子，而其他3個因素是次要影響因子。

表6 正交試驗的方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal test

表7 影響出愈率的各因素極差值Table 7 Range of different factors affecting callus rate

表8 正交試驗愈傷分化率Table 8 Differentiation rate of callus in orthogonal test

表9 水稻花藥愈傷分化率的方差分析Table 9 Variance analysis of callus differentiation rate in rice anther

從表10可知，蔗糖質量濃度R值最大為162.350 0，其次為6-BA(45.150 0)，因此，第1影響因子為蔗糖質量濃度，第2影響因子為6-BA質量濃度。從各因素的極大值可知，蔗糖質量濃度極大值為K1，即 30 g/L，6-BA質量濃度極大值為K3，即4 mg/L。NAA、KT的影響極小，極大值都為K2即0.5 mg/L。因此， MS+6-BA (4 mg/L)+蔗糖(30 g/L) +瓊脂(6 g/L)可作為秈粳交材料愈傷組織的最適宜分化培養基。

2.4 不同培養時間對愈傷組織分化成苗的影響

不同培養時間分化綠苗率統計數據見表11，2個秈粳交材料分化成綠苗率隨愈傷培養時間的變化趨勢見圖1。不同品種的秈粳交愈傷組織材料在相同培養條件下綠苗分化率范圍有顯著差異，其中‘(沈農256/中413)’F1不同培養時間轉接愈傷成苗分化率為93.8%～134.4%，‘[(輪回422/lement)F5/華恢25]’F1的分化率為57.6%～97.2%。但由圖1可知，2個秈粳交材料分化率隨愈傷培養時間的變化趨勢一致。從愈傷培養26 d開始，隨著培養時間的延長，轉接分化率有上升的趨勢，于第30天達到峰值，隨著愈傷培養時間的延長，轉接后分化率逐漸降低，在第45天降至最低。

由以上結果可知：愈傷組織在第30天時進行接種分化易分化成苗，可認為愈傷組織培養30 d為水稻秈粳交后代花藥培養愈傷組織轉接分化成苗的最佳時間。

表11 愈傷組織不同培養時間的分化率Table 11 Differentiation rate of callus in different culture time

圖1 培養26～45 d愈傷組織的分化率Fig.1 Differentiation rate of callus culture in 26-45 days

2.5 愈傷分化成苗階段培養溫度優化

由表12可知，隨著分化溫度的提高，分化率相應由45.67%提高至66.31%，而綠苗率則在培養溫度為29 ℃時達到最高(44.22%)，為3個溫度中的最大值。由以上結果可知：培養溫度為29 ℃ 時，花藥愈傷的分化綠苗率最高。

3 結論與討論

郭書巧等[21]研究表明，秈粳雜交F1代激素配比為2,4-D 2 mg/L、NAA 1 mg/L、KT 0.2 mg/L時培養效果最好。李大林[22]認為2,4-D 4 mg/L 浸稻穗莖節，能提高花藥成苗率，但本研究結果表明2,4-D 處理對出愈率影響不大，可能2,4-D對水稻花藥培養力的影響在成苗期而非出愈期，也可能其最佳培養質量濃度因基因型不同而不同。

表12 不同培養溫度下的成苗情況Table 12 Seedling status under different culture temperatures

水稻花藥培養一般要求稻穗在8～10 ℃低溫預處理8～10 d，本研究結果表明處理10 d效果最佳。花藥培養接種最佳葉枕間距為5～8 cm，但穎殼經消毒沖洗后完全變軟，剪殼后花藥粘貼在花藥壁，很難抖落，接種速度慢。因此小葉枕間距不利于試驗操作，但出愈率高。該結果確定取樣標準，對接種技術提出更高要求。同樣，花藥接種第30～35天的愈傷組織轉分化的成苗率顯著優于培養40 d后的愈傷組織，但由于此時期的愈傷組織還太小，有些還粘在花藥壁上，轉接分化培養基時操作較為困難。因此，應綜合考慮各培養因素，從而達到提高水稻花藥培養水平的目的。

秈粳交水稻花藥培養在分化成苗階段存在綠苗分化率偏低的現象。孫宗修等[23]發現：秈粳交水稻花藥培養的綠苗率為0.52%～3.16%。在花藥培養過程中影響綠苗分化的因素較多，關世武[24]研究發現：轉接愈傷的狀態和時期對愈傷分化為綠苗的影響較大。本研究通過愈傷轉接時期試驗和不同培養溫度試驗,確定陜西秈粳交水稻花藥培養愈傷轉接時間為30 d、培養溫度為29 ℃時，可達到較高的綠苗分化率。

通過本試驗研究，基本了解陜西秈粳交花藥離體培養的培養效果，初步建立穩定的離體再生體系，為加快陜西秈粳交材料的基因純合、遺傳分析、分子標記等研究奠定基礎，其他影響因素的研究在此基礎上有待進一步優化。

Reference：

[1] 吳建梅,林荔輝,吳為人,等.水稻秈粳交親秈型不育系的雜種優勢利用[J].福建農林大學學報(自然科學版),2012,41(1):1-6.

WU J M,LI L H,WU W R,etal.Heterosis’s application of indica-compatibility CMS lines of hybrids between indica and japonica in rice [J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition),2012,41(1):1-6(in Chinese with English abstract).

[2] 韋新宇,許旭明,張受剛,等.水稻秈粳交衍生系產量相關性狀的遺傳效應與雜種優勢[J].亞熱帶農業研究,2010,6(3):145-152.

WEI X Y,XU X M,ZHANG S G,etal.Genetic effects and heterosis for yield-related traits in the derivative lines from Indica-Japonica crosses of rice[J].SubtropicalAgricultureResearch,2010,6(3):145-152(in Chinese with English abstract).

[3] 關世武.花藥培養技術在寒地水稻育種中的應用研究[J].中國農學通報,2005,21(5):94-96.

GUAN SH W.The application of anther culture technique in cold region rice breeding[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2005,21(5):94-96(in Chinese with English abstract).

[4] 程式華.雜交水稻育種材料和方法研究現狀及發展趨勢[J].中國水稻科學,2000,14(3):165-169.

CHENG SH H.Current status and prospect in the development of breeding materials and breeding methodology of hybrid rice[J].ChineseJournalofRiceScience,2000,14(3):165-169(in Chinese with English abstract).

[5] 季芝娟,葉勝海,馬良勇,等.水稻秈梗DH群體的構建及其基因型偏太分離分析[J].農業生物技術學報,2008,16(1):315-319.

JI ZH J,YE SH H,MA L Y,etal.Construction and distorted-segregation analysis in genotype of DH population from indica-japonica cross[J].JournalofAgriculturalBiotechnology,2008,16(1):315-319(in Chinese with English abstract).

[6] 李衛東,葛會波,周春江,等.草莓花藥愈傷組織類型與狀態調控研究[J].河北農業大學學報,2004,27(2):59-63.

LI W D,GE H B,ZHOU CH J,etal.Study on anther callus types and state regulation in strawberry[J].JournalofAgriculturalUniversityofHebei,2004,27(2):59-63(in Chinese with English abstract).

[7] 趙維娜.水旱稻雜交F1代花藥培養技術的研究及其DH系的構建[D].北京:中國農業大學,2004.

ZHAO W N.Study on technique of anther culture F1between upland rice and lowland rice and the establishment of doubled-haploid lines[D].Beijing:China Agricultural University,2004(in Chinese with English abstract).

[8] 季彪俊,陳啟鋒,黃群策,等.水稻花藥培養技術的總結與探討[J].福建農業大學學報,2001,30(1):22-28.

JI B J,CHEN Q F,HUANG Q C,etal.A summary and discussion on rice anther culture techniques [J].JournalofFujianAgriculturalUniversity,2001,30(1):22-28(in Chinese with English abstract).

[9] 張 林,傅雪琳,陳雄輝,等.水稻花藥培養特性的品種間變異觀察[J].福建農業學報,2003,18(2):69-73.

ZHAGN L,FU X L,CHEN X H,etal.Observation on variations of anther culture characters among rice cultivars[J].JournalofFujianAgriculturalSciences,2003,18(2):69-73(in Chinese with English abstract).

[10] 馮雙華,趙 森,郭家源,等.不同培養基和激素對超級雜交稻花藥培養力的影響[J].西南農業大學學報(自然科學版),2006,28(4):523-525.

FENG SH H,ZHAO S,GUO J Y,etal.Effects of medium and phytohormone on anther culture of super hybrid rice[J].JournalofSouthwestAgriculturalUniversity(NaturalScienceEdition),2006,28(4):523-525(in Chinese with English abstract).

[11] 何 濤.影響秈稻花藥培養的因素及高培養力材料的篩選[D].成都:四川大學,2006.

HE T.Effects of factors on anther culture of indica rice and selection of materials with high anther culture ability[D].Chengdu:Sichuan University,2006(in Chinese with English abstract).

[12] 張楷正.秈粳交偏秈后代抗紋枯病突變體花藥培養研究[D].四川雅安:四川農業大學,2007.

ZHANG K ZH.A study on anther culture of mutants were resistant to rice sheath blight of rice subspecies cross’ progenies close to indica[D].Ya’an Sichuan:Sichuan Agricultural University,2007(in Chinese with English abstract).

[13] 王茂良,馮 慧.花藥離體培養研究進展[J].北京農學院學報,2010,25(3):70-75.

WANG M L,FENG H.Advances of in vitro anther culture[J].JournalofBeijingUniversityofAgriculture,2010,25(3):70-75(in Chinese with English abstract).

[14] 陳 紅,秦瑞珍.提高水稻同源四倍體花藥培養愈傷誘導率的研究[J].作物學報,2007,33(1):120-125.

CHEN H,QIN R ZH.Improvement of callus induction efficiency in anther culture of autotetraploid rice[J].ActaAgronomicaSinica,2007,33(1):120-125(in Chinese with English abstract).

[15] 黃翠紅,郭 濤,劉永柱,等.培矮64S空間誘變突變株系花藥培養條件的探討[J].華南農業大學學報,2011,32(3):14-17.

HUANG C H,GUO T,LIU Y ZH,etal.Studies on anther culture conditions of space mutation lines from peiai 64S[J].JournalofSouthChinaAgriculturalUniversity,2011,32(3):14-17(in Chinese with English abstract).

[16] 劉振洋,劉延澤,劉改嵐,等.絞股藍總皂苷的閃式提取和純化工藝研究[J].中草藥,2009,40(7):1071-1073.

LIU ZH Y,LIU Y Z,LIU G L,etal.Study on the herbal blitzkrieg extraction and purification process of total saponins in gynostemma pentaphyllum[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2009,40(7):1071-1073(in Chinese).

[17] 董如何,肖必華,方永水,等.正交試驗設計的理論分析方法及應用[J].安徽建筑工業學院學報(自然科學版),2004,12(6):103-106.

DONG R H,XIAO B H,FANG Y SH,etal.The theoretical analysis of orthogonal test design[J].JournalofAnhuiInstituteofArchitecture&Industry(NaturalScienceEdition),2004,12(6):103-106(in Chinese with English abstract).

[18] 王 慧.正交設計的優良性[D].上海:華東師范大學,2010.

WANG H.The superiority of the orthogonal design[D].Shanghai:East China Normal University,2010(in Chinese with English abstract) .

[19] 劉明磊.正交試驗設計中的方差分析[D].哈爾濱:東北林業大學,2011.

LIU M L.Variance analysis of orthogonal experimental[D].Harbin:Northeast Forestry University,2011(in Chinese with English abstract) .

[20] 宋利華,蕭 偉,鹿麗麗,等.正交試驗優選人參多糖的提取工藝[J].中草藥,2012,43(2):283-287.

SONG L H,XIAO W,LU L L,etal.Extracting technology optimization of polysaccharides from panax ginseng by orthogonal test[J].ChineseTraditionalandHerbalDrugs,2012,43(2):283-287(in Chinese) .

[21] 郭書巧,唐海娟,王州飛,等.秈粳雜交F1高效花藥培養技術體系的建立[J].南京農業大學學報,2006,29(2):1-5.

GUO SH Q,TANG H J,WANG ZH F,etal.Establishment of technology system of F1anther culture from japonica/indica hybrid rice[J].JournalofNanjingAgriculturalUniversity,2006,29(2):1-5(in Chinese with English abstract).

[22] 李大林.提高水稻花藥培養效率分析[J].中國農學通報,2004,20(4):128-131.

LI D L.The analysis of the advancement of efficiency of rice anther culture[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2004,20(4):128-131(in Chinese with English abstract).

[23] 孫宗修,斯畢敏,付亞萍,等.中國水稻花藥培養研究進展及其應用[C]//中國農學會.中國青年農業科學學術年報,北京:中國農業出版社,1999:46-52.

SUN Z X,SI B M,FU Y P,etal.Advance and application of rice anther culture in China[C]//Chinese Association of Agricultural Science Societies.Chinese Youth Academic Report of Agricultural Science,Beijing:China Agriculture Press,1999:46-52.

[24] 關世武.提高寒地水稻花藥培養效率的幾個關鍵技術[J].中國農學通報,2005,21(7):38-39.

GUAN SH W.Critical technique problems on improving anther culture efficiency of cold region rice[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2005,21(7):38-39(in Chinese with English abstract).

(責任編輯：顧玉蘭 Responsible editor:GU Yulan)

Optimization of Culture Conditions of Anther Culture in Indica/Japonica Hybrid Rice

ZHANG Xuanming,WEI Fangqin,ZHANG Xing,SHA Zhihong,ZHAO Shengli,ZHANG Xiuying and WANG Yanlong

(Hanzhong Agricultural Science Research Institute,Hanzhong Shaanxi 723000,China)

In order to improve culture efficiency of anther in indica/japonica hybrid rice,cultivars of the indica/japonica hybrid rice were used for screening culture medium,the orthogonal test of five factors was designed,which the five factors were the pretreatment days,the mass concentration of 2,4-D,the sowing date,and the inoculums density and the occipital lobe spacing. Furtherly,at the seedling stage,the test based on the MS culture medium with different plant hormones,different culture time and culture temperature conditions. Seedling rate of cross material callus in indica japonica were investigated in the paper. The results showed that the callus rate of three different indica/japonica hybrid materials were the highest in No.3 M8 medium. The pre-treatment days and the inoculums density reached at very significant level.At the seedling stage,sucrose content was the primary impact factor,followed by the concentration of 6-BA. And differentiation rate of 30 g/L,4 mg/L respectively was highest. The highest differentiation rate of callus culture time was 30 d. When the culture temperature was 29 ℃ it had the highest rate of plantlet differentiation. It was concluded that M8+8 mg/L 2,4-D+8 mg/L NAA+4 mg/L KT+2 mg/L 6-BA+30 g/L sucrose and 6 g/L agar was the optimum medium at the callus stage,while and MS+6-BA 4 mg/L+sugar 30 g/L and agar 6 g/L was the most appropriate media ratio for seedling differentiation at the seedling stage.In conclusion,the best callus transit time was 30 days and the optimum culture temperature was 29 ℃.

Rice；Indica-japonica cross；Anther；Callus；Regeneration system

ZHANG Xuanmin,male,senior agronomist.Research area:hybrid rice breeding.E-mail:1722580530@qq.com

ZHANG Xing,female,agronomist.Research area:hybrid rice breeding.E-mail:825970451@qq.com

日期：2017-03-30

2016-08-26

2016-11-02

陜西省科學技術研究發展計劃農業攻關類(2014k02-03-01)。

張選明，男，高級農藝師，主要從事雜交水稻育種工作。E-mail:1722580530@qq.com

張 星，女，農藝師，主要從事雜交水稻育種工作。E-mail:825970451@qq.com

S188

A

1004-1389(2017)04-0544-08

網絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1220.S.20170330.1508.018.html

Received 2016-08-26 Returned 2016-11-02

Foundation item Shaanxi Science and Technology Research and Development Project in Agriculture(No. 2014k 02-03-01).