基層使用酶聯免疫法檢測儀器的注意事項

邊臘紅 徐華超 四川省涼山彝族自治州農產品質量安全檢測中心 615000

基層使用酶聯免疫法檢測儀器的注意事項

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基層檢測單位由于經費有限、技術力量薄弱，在開展獸藥殘留檢測時需要考慮檢測技術和成本等因素。酶聯免疫法具有操作簡便、樣品處理量大、靈敏度高、儀器化程度低和分析成本低等優點，目前成為了各級基層檢測單位檢測獸藥殘留最理想的檢測技術之一。本文主要闡述基層檢測獸藥殘留使用酶聯免疫法所需的主要儀器及注意事項。

基層檢測；獸藥殘留；酶聯免疫法；儀器

獸藥殘留是指動物產品的任何可食部分所含獸藥的母體化合物及（或）其代謝物，以及與獸藥有關的雜質。對人體健康影響很大。主要有毒性反應、誘導產生耐藥菌株和三致作用(致畸、致癌、致突變)[1]。因此，對獸藥殘留進行廣泛、快速、準確的檢測很有必要。

目前檢測獸藥殘留的方法很多，但是大多數需要昂貴的儀器設備，操作繁瑣，成本很高。基層檢測單位由于經費、人員有限，技術力量薄弱，在開展獸藥殘留檢測時就需要考慮檢測成本及技術水平等。酶聯免疫吸法具有操作簡便、樣品處理量大、靈敏度高、重現性好、儀器化程度低和分析成本低等優點，目前成為各級基層檢測單位檢測獸藥殘留最理想的檢測技術之一，展示了良好的應用前景[2]。

1 離心機

ELISA前處理操作中離心機要能進行50mL離心管離心，非冷凍也可以。離心機要能夠提供實驗所需的離心力（Fr）： Fr=11.19×(rpm/1000)2×r×g。 Fr越大，越有利于分離。一般實驗操作要求的3000g即為離心力。使用離心機前，先看使用注意事項；在操作時，要保證離心管對稱放置。

2 移液器

移液器一般使用 50～1000μL、50～300μL 八通道排槍。 ELISA 加樣量小（20～200μL），其準確性直接影響實驗結果，利用稱重法校準：低、中、高三個刻度分別吸取指示量的水，用萬分之一的天平稱重后計算是否準確，一般誤差在±5%以內。實際操作過程中，移液器提倡用“吸二打一”。其優勢在于，在加樣過程中在板孔內不出現或者很少出現氣泡，能夠提高加樣速度，縮短前后樣本反應的時間差。

3 氮吹儀

它是利用氮氣的快速流動打破液體上方的氣液平衡，從而使液體揮發速度加快；并通過升高溫度，進而達到濃縮的目的。

注意事項：針頭懸于液面上方，不可接觸液面；氣流調試平穩后，再放入樣本；加熱系統溫度設置在規定范圍內。

4 酶聯免疫試劑盒[3-6]

酶聯免疫試劑盒是獸藥殘留檢測的核心儀器，它的優劣在很大程度上影響著檢測的準確性，因此在實驗前對試劑盒的下列指標注意考查，與提供的參數進行比對，做出評判。

（1）標準曲線。標準曲線的好壞，將會影響到最后的實驗結果，因此通過標準曲線可以考察試劑盒的相關系數和抑制率。

試劑盒中含有不同濃度的標準溶液，標準曲線至少由5個濃度組成，測定次數不少于5次，以確定工作濃度范圍和IC50范圍，藥物最大殘留限量（MRL）必須在曲線范圍內。其中IC50是標準曲線50%的抑制濃度,是反映試劑盒靈敏度的指標，IC50的數值越小，靈敏度越高。標準曲線的線性相關系數≧0.98。

工作濃度范圍通過陰性、臨界值濃度和陽性的樣品測定來確定，每個濃度重復不少于5次。

（2）檢出限和定量限。檢測限為20份空白樣品測定均值加3倍標準差。定量限應大于標準曲線中最低濃度點。應對該濃度樣品至少測定6次以進行驗證，而不能通過外延法推斷。

（3）精密度和準確度。對于有最高殘留限量的藥物，添加濃度為MRL及MRL上下各一個濃度；對于禁用藥物，添加濃度為定量限和2倍定量限，每個添加濃度至少測定5個平行樣，并至少進行3批實驗（不同檢測日期，不同標準曲線，不同批次的試劑盒）。

準確度為回收率范圍大于40%或符合相應檢測標準的要求；精密以變異系數表示；批內變異系數，每批平行樣之間的變異系數≦25%，禁用藥物≦30%。

批間變異系數：所有樣品之間的變異系數≦30%，禁用藥物≦40%。定性方法為陰性和陽性樣品各測定不少于50份，確定假陽性率和假陰性率。假陽性率=假陽性÷（假陽性+真陰性），假陰性率=假陰性÷（假陰性+真陰性），一般要求假陽性率≦5%，假陰性率為0。

（4）特異性。在試劑盒中，特異性常用交叉反應率表示。與待測藥物相似結構的物質可能和酶標板上的抗原結合，產生交叉反應，使測定結果升高，還可能成為假陽性。對于檢測單一藥物的試劑盒，其他相似藥物的交叉反應率越低，表明試劑盒特異性越強。

（5）產品外觀。觀察試劑盒外包裝是否有產品名稱、生產廠家、型號、批號和生產日期等標識，以及盒內是否有說明書、質控檢驗單等，若其中多項空白則需注意，可能該試劑盒為不合格產品。盒內封裝試劑在正常情況下應該是澄清、透明的液體，不應出現結晶、絮狀物或沉淀。取出試劑盒在常溫下回溫30分鐘，觀察試劑瓶里的試劑是否有標簽脫落、漏液現象。

需特別注意的是試劑盒應保存于2～8℃條件下，不要冷凍，將不用的微孔板放回鋁箔袋重新密封。標準物質和無色底物液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。試劑盒使用前應先從冰柜里取出，室溫下放置30分鐘以上，以減少邊緣效應對結果的影響。試劑盒最佳反應溫度為25℃，溫度過高或過低將導致吸光度值和靈敏度發生變化，會直接影響檢測結果。反應終止液為高濃度硫酸，避免接觸皮膚。

5 恒溫培養箱

它主要是為實驗中的酶聯免疫反應提供恒溫的環境。要經常檢查恒溫箱溫度計所示溫度和溫箱內實測溫度是否一致，允許有±1℃的誤差。

6 酶標儀

酶標儀是對酶聯免疫檢測實驗結果進行讀取和分析的專業儀器。在檢測前將酶標儀預熱30分鐘。在酶標儀測定每孔的值時，應在5分鐘內讀完。經常維護其光學部分，防止濾光片霉變，定期檢測校正，使其保持良好的工作性能。

7 結語

儀器是實驗室檢驗、檢測活動最直接的工具和重要的基礎設施及關鍵資源，是檢測機構開展檢測工作所必需的物質基礎,也是國家有關部門對檢測機構進行驗收、審查認可、計量認證等行政管理時必須考核的硬件內容。有了這些儀器，基層檢測單位就能夠開展獸藥殘留的定性和定量工作，能夠為當地政府部門了解當地畜禽產品現狀提供數據支撐。

[1]賀家亮，李開雄，等.動物性食品獸藥殘留現狀及對策[J].中國動物檢疫，2006，23(7)：22-24.

[2]邢應壽，祁克宗.ELISA技術在畜產品安全檢測中的應用[J].動物醫學發展，2004，25（3）：19-22.

[3]農業部文件農醫發[2005]17號.關于發布獸藥殘留ELISA試劑（盒）備案審查技術資料要求和“獸藥殘留ELISA試劑（盒）備案參與評判標準”的通知[Z].

[4]伏慧明，郭展旗,等.獸藥殘留檢測中試劑盒的驗證評判方法研究[J].中國農業科技導報，2008，10（S2）：109-111.

[5]王麗娜，郝利忠,等.獸藥殘留檢測中酶聯免疫試劑盒的選擇原則與使用注意事項[J].現代畜牧獸醫，2013（7）：41-44.

[6]劉冬梅，蒲明.選擇獸藥殘留酶聯免疫試劑盒的關鍵因素[J].現代農業科技，2015（20）：258，260.