數(shù)字PCR平臺與單細(xì)胞單分子檢測

任文宇

（杭州博日科技有限公司，浙江杭州，310052）

數(shù)字PCR平臺與單細(xì)胞單分子檢測

任文宇

（杭州博日科技有限公司，浙江杭州，310052）

數(shù)字PCR作為第三代PCR技術(shù)，主要是在擴(kuò)增單分子的基礎(chǔ)上對核酸拷貝數(shù)進(jìn)行絕對性定量的樣品檢測技術(shù)，具有非常高的靈敏度。近年來，隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和醫(yī)療衛(wèi)生技術(shù)水平的改善提高，微流控技術(shù)作為一種先進(jìn)的技術(shù)，促使著數(shù)字PCR平臺的產(chǎn)生。但是現(xiàn)有的數(shù)字PCR平臺類型主要是芯片型和液滴型，不僅操作費(fèi)用昂貴，且需要進(jìn)行外接的相關(guān)配套控制系統(tǒng)以及管路眾多，這便在很大程度上嚴(yán)重制約了我國生命科學(xué)領(lǐng)域中對于數(shù)字PCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

數(shù)字PCR平臺；單細(xì)胞；單分子；檢測

1 數(shù)字PCR技術(shù)在單細(xì)胞單分子檢測中的注意事項

1.1 對關(guān)鍵因素進(jìn)行充分的考慮

現(xiàn)階段，應(yīng)用于擴(kuò)增數(shù)字核段裝置芯片的類型主要有滑動式、離心轉(zhuǎn)盤式、液滴微流控式和大規(guī)模集成流路式。但是，在實(shí)際操作過程中這些裝置效能的發(fā)揮需要借助外部氣壓源和注射泵等控制系統(tǒng)的力量，唯有這樣才可以對眾多樣品進(jìn)行注入和分配操作等。尤其是在注入樣品過程中，如果使用一定的注射器來完成該項操作則往往花費(fèi)的時間非常多，并且極易影響敏感樣品的降解，使得丟失樣品的現(xiàn)象層出不窮，檢測的準(zhǔn)確性和靈敏性在一定程度上有所降低，相應(yīng)的在現(xiàn)場完成對樣品的即時檢測非常困難。因此，為確保在擴(kuò)增數(shù)字核酸過程中集成全部的功能，則需要分配隔離單分子，需要充分考慮以下三個關(guān)鍵因素：其一，在芯片內(nèi)部集成一個足以將液體流動驅(qū)動的內(nèi)置動力源；其二，有效的將每一個反應(yīng)室，保證彼此之間的獨(dú)立性；其三 ，PCR技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)對單分子的有效擴(kuò)增。

1.2 數(shù)字PCR反應(yīng)需要對熱循環(huán)的溫度進(jìn)行準(zhǔn)確且有效的控制

據(jù)不完全報道，數(shù)字PCR滾環(huán)反應(yīng)所需要的溫度大約在30攝氏度左右，假陽性的擴(kuò)增極易產(chǎn)生，數(shù)字重組聚合酶的擴(kuò)增反應(yīng)對于溫度更為敏感，LAMP技術(shù)的核酸鏈在等溫環(huán)境中進(jìn)行一定的循環(huán)置換，有助于放大靶序列的擴(kuò)增，其本身的特異性非常高、所耗的時間較短、檢測起來比較方面，且等溫效果非常高效，無需借助PCR儀器便可以完成循環(huán)置換操作。

2 數(shù)字LAMP芯片技術(shù)的重要性

LAMP技術(shù)可以不借助熱循環(huán)作用，便可以在60攝氏度左右的條件下進(jìn)行等溫擴(kuò)增，并且可以有效降低對環(huán)境的依賴程度，檢測所達(dá)到的極限非常低，具有很高的擴(kuò)增效率，與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比其靈敏度要高2到3個數(shù)量，與其他形式的等溫反應(yīng)相比較，LAMP在數(shù)字LAMP反應(yīng)中具有很大額度優(yōu)勢，在此基礎(chǔ)上已經(jīng)在診斷臨床疾病、定性定量對細(xì)菌和病毒的檢測過程中以及防治動植物的微生物檢測等發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

本次所研制的數(shù)字LAMP芯片具備一定的自主知識產(chǎn)權(quán)，主要將樣品引入到無動力的進(jìn)樣技術(shù)中，樣品在各小室中的自動分配主要借助的是封隔油箱的方法，這在一定程度上有助于進(jìn)行數(shù)字LAMP反應(yīng)，且有助于精確的克隆基因質(zhì)粒進(jìn)行有效的定量和計數(shù)。同時，該芯片的組成部分主要包括聚合物PDMS與玻璃基底，不需要動力源和微閥的支持，便可以在一定程度上降低或者消除對儀器的依賴程度，以此有助于保持?jǐn)?shù)字核酸擴(kuò)增芯片本身的獨(dú)立性。

3 自吸分液式數(shù)字LAMP芯片的制作

本文在芯片制作過程中主要是在玻璃蓋片基礎(chǔ)上采用多層刻技術(shù)，材料主要以樣品通道流通和高聚物PDMS的微反應(yīng)室，在封接芯片組件的間隔上主要采用的技術(shù)以離子體表面處理技術(shù)為主，如低溫空氣等，以此來數(shù)字LAMP芯片制作出來，其集成流路的結(jié)構(gòu)為三層。同時，制作方法相對比較簡單，自動化水平相對較高，價格低廉，能夠?qū)⒓闪髀沸酒淮涡灾谱魍瓿桑诤艽蟪潭壬峡梢杂行П苊饣蛘叻乐苟挝廴尽?/p>

芯片的尺寸大小與蓋玻片差不多，小室的結(jié)構(gòu)總共劃分為5層，其中最中間的為微陣列層，四個區(qū)域中包含眾多的小室且在流通通道上設(shè)計主要是堆疊的方式，樣品流通通道在其中彼此相連，每個通道具備相同的進(jìn)樣速率。陣列層主要是一層完全空白的PDMS上面粘附著，致使每個小室四周的性質(zhì)完全相同，在此基礎(chǔ)上液相與油相的進(jìn)入都非常方便。

另外，進(jìn)出的樣口層位于陣列層的上方，出樣口的直徑大約控制在2mm左右，其在廢液池和吸力的儲存方面發(fā)揮著非常重要的作用，在此基礎(chǔ)上可以為連續(xù)吸入樣品和油品提供源源不斷的動力支持。蓋玻片的下層固定著芯片的最下層，這便在很大程度上可以起到更好的固定支撐和熱傳導(dǎo)的作用。在實(shí)際使用芯片的過程中，通常會將一塊蓋玻片封蓋在最上層，以此可以起到非常良好的密封作用。

4 結(jié)束語

綜上所述，本文主要從對關(guān)鍵因素進(jìn)行充分的考慮和數(shù)字PCR反應(yīng)需要對熱循環(huán)的溫度進(jìn)行準(zhǔn)確且有效的控制等兩方面對數(shù)字PCR技術(shù)在單細(xì)胞單分子檢測中的注意事項進(jìn)行了簡答的介紹，在闡述數(shù)字LAMP芯片技術(shù)重要性的基礎(chǔ)上，科學(xué)的分析和介紹了制作自吸分液式數(shù)字LAMP芯片的具體流程。

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Digital PCR Platform and Single Cell Single Molecule Detection

Ren Wenyu
（Hangzhou Bioer Technology Co. Ltd.,Hangzhou Zhejiang,310052）

Digital PCR as the third generation of PCR technology, mainly in the amplification of single molecules on the basis of nucleic acid copy number absolute quantitative sample detection technology, with very high sensitivity. In recent years, with the advancement of science and technology and improvement of medical and health technology, microfluidic technology as an advanced technology, promote the generation of digital PCR platform. However, the existing digital PCR platform types are mainly chip type and droplet type, not only expensive to operate, and the need for external control system and the associated pipeline, which in large part severely restricted the field of life sciences For the wide application of digital PCR technology.

digital PCR platform; single cell; single molecule; detection