黃芪口服液降低大鼠順鉑毒性作用機(jī)制的尿液代謝組學(xué)研究

宋慧婷 李長(zhǎng)印 ??萬瑤瑤 ??丁選勝 ??戴國(guó)梁 ??劉史佳 ??居文政

摘要采用基于液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（LCTOFMS）技術(shù)的代謝組學(xué)方法，分析大鼠尿液內(nèi)源性代謝物的變化，研究黃芪口服液（HO）降低大鼠順鉑（CDDP）毒性的作用機(jī)制。采用低劑量多次腹腔注射CDDP的方法建立CDDP染毒大鼠模型，并連續(xù)給予16天HO。于第18天收集正常對(duì)照（Control）組、順鉑模型（CDDP）組和黃芪口服液（HO）組大鼠的24h尿液，進(jìn)行LCTOFMS分析，以獲取尿液代謝物組數(shù)據(jù)集，對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）等多元統(tǒng)計(jì)分析，以篩選潛在生物標(biāo)志物。于第20天采集大鼠血清測(cè)定肌酐和尿素氮水平。血清指標(biāo)測(cè)定結(jié)果表明，HO可以顯著降低CDDP染毒大鼠的肌酐和尿素氮水平（p<0.05）。PCA得分圖顯示，3組可分別聚類，HO組位于Control組和CDDP組中間，表明HO可部分改善CDDP所致大鼠尿液代謝產(chǎn)物的異常變化。綜合OPLSDA分析、t檢驗(yàn)和倍數(shù)變化分析結(jié)果，最終共篩選并初步鑒定出35個(gè)尿液代謝產(chǎn)物作為HO減毒相關(guān)的潛在生物標(biāo)記物。代謝通路分析結(jié)果表明，HO可通過糾正體內(nèi)氨基酸代謝、能量代謝和核苷酸代謝等通路的紊亂，降低CDDP所致機(jī)體毒性。

關(guān)鍵詞黃芪口服液；順鉑；尿液；代謝組學(xué)；液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用；毒性

1引言

順鉑（Cisdiaminedichloroplatinum，CDDP）對(duì)多種實(shí)體瘤具有良好的抗腫瘤療效，基于CDDP的化療方案目前依然是包括進(jìn)展期非小細(xì)胞肺癌在內(nèi)的多種癌癥臨床治療的標(biāo)準(zhǔn)一線化療方案[1]。雖然療效確切，但CDDP多發(fā)的嚴(yán)重毒副作用，特別是劑量限制性腎毒性，極大地限制了其臨床應(yīng)用。因此，尋找能有效降低CDDP化療毒性，同時(shí)不降低乃至可增加其抗癌活性的化療輔助藥物逐漸成為研究熱點(diǎn)。研究表明，CDDP導(dǎo)致機(jī)體毒性的過程涉及到氧化損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)、線粒體機(jī)能失調(diào)、NO受體、內(nèi)皮縮血管肽受體和腎血流量動(dòng)力學(xué)變化等多條內(nèi)外源通路和多個(gè)環(huán)節(jié)[2～4]。因此，理想的CDDP化療保護(hù)劑也應(yīng)該具有多環(huán)節(jié)多途徑的解毒機(jī)制。

傳統(tǒng)中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)協(xié)同增效的整體作用特點(diǎn)，因此有望在防治CDDP機(jī)體毒性方面發(fā)揮獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。黃芪（Radixastragali）為豆科植物膜莢黃芪Astragalusmebrananceus（Fisch.）Bge.和蒙古黃芪A.mongholicus（Bge.）Hsiao.的干燥根。性溫，味甘，歸肺、脾經(jīng)。黃芪為常用補(bǔ)氣中藥，用藥歷史悠久，《神農(nóng)本草經(jīng)》將其列為上品。目前，黃芪以單味藥或復(fù)方廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療。臨床研究顯示，黃芪可增強(qiáng)腫瘤患者機(jī)體免疫力[5]，增強(qiáng)化療效果[6]，降低化療毒副反應(yīng)[7]，改善患者的生活質(zhì)量[8]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，黃芪可通過升高白細(xì)胞數(shù)和胸腺指數(shù)、脾指數(shù)，提高血清中IL2和TNFα的水平來增強(qiáng)荷瘤小鼠機(jī)體免疫功能[9]；也可通過促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)、抑制Bcl2蛋白表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抑瘤效應(yīng)[10]。因此，黃芪具有潛在的直接抗腫瘤作用，并可對(duì)抗化療毒副作用，有望成為一種良好的CDDP化療輔助用藥。

代謝組學(xué)是通過考察生物體系受刺激或擾動(dòng)后其代謝產(chǎn)物的變化或其隨時(shí)間的變化，研究生物體系的代謝途徑的一種技術(shù)[11]，具有明顯的整體反應(yīng)性特點(diǎn)，與中藥治療疾病的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、協(xié)同起效的整體觀念十分吻合。近年來，越來越多的研究采用代謝組學(xué)方法考察中藥治療復(fù)雜疾病的藥效及作用機(jī)理[12，13]，但目前尚無從整體作用角度研究黃芪降低CDDP所致機(jī)體毒性作用機(jī)制的報(bào)道。基于此，本研究采用基于LCTOFMS技術(shù)的尿液代謝組學(xué)方法，從大鼠尿液內(nèi)源性代謝物組的變化角度，初步闡明臨床常用黃芪制劑黃芪口服液（HO）降低CDDP毒性的作用及其機(jī)制。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)ABSCIEX公司），配有MarkerViewTM和PeakViewTM等代謝組學(xué)研究相關(guān)軟件、CDS質(zhì)譜自動(dòng)校準(zhǔn)系統(tǒng)、Agilent1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；Biofugeprimor冷凍高速離心機(jī)、AU5800生化儀（美國(guó)Beckman公司）。

甲醇和乙腈（HPLC級(jí)，德國(guó)默克公司）；甲酸和甲酸銨（HPLC級(jí)，美國(guó)Tedia公司）；肌酐和尿素氮測(cè)定試劑（美國(guó)Beckman公司）。SD大鼠購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SCXK（滬）20130006。黃芪口服液（江蘇省中醫(yī)院院內(nèi)制劑，產(chǎn)品批號(hào)：1501001，10mL/支）；注射用順鉑（CDDP，凍干型）源自齊魯制藥（海南）有限公司（批號(hào)：2WA2A1307047B，20mg/瓶）。實(shí)驗(yàn)用水為MilliporeMilliQAdvantageA10超純水機(jī)制備的超純水。

2.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及樣品處理

雄性SD大鼠24只，隨機(jī)均分為3組，分別為：（A）順鉑模型組（CDDPgroup）；（B）黃芪口服液組（HOgroup）；（C）正常對(duì)照組（Controlgroup）。適應(yīng)1周后，A和B組均腹腔注射給予CDDP，給藥時(shí)間分別為第1，3，7，11，14天，共計(jì)5次，每次劑量為2.5mg/kg；C組腹腔注射等量生理鹽水。期間B組每日灌胃給予劑量為每只2mLHO，連續(xù)16天。于第18天搜集各組大鼠24h尿液，

70℃凍存?zhèn)溆茫挥诘?0天采集各組大鼠血清，采用BECKMANAU5800生化儀測(cè)定血清肌酐和尿素氮水平，采用單因素方差分析對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

樣品分析前，室溫解凍各尿液樣品，渦旋混勻，吸取200μL，依次加入500μL甲醇，300μL水，渦旋振蕩1min混勻，在4℃以12000g離心10min，取上清液進(jìn)行LCMS分析。同時(shí)取每個(gè)尿樣的上清液各20μL，渦旋混勻作為質(zhì)控（QC）樣品。

2.3色譜質(zhì)譜條件及樣品分析

色譜條件：Agilent1200液相色譜系統(tǒng)，色譜柱為Poroshell120SBC18（100mm×3.0mm，2.7μm），預(yù)柱為Poroshell120SBC18（5.0mm×3.0mm，2.7μm）。流動(dòng)相A為含2mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸，流動(dòng)相B為含2mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇/乙腈（1〖KG-3∶〖KG-51，V/V）。梯度洗脫：0～0.5min，5%B；0.5～12min，5%～100%B；12～16min，16～16.1min，100%～5%B；16.1～22min，5%B；1.3～16.5min切入質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。流速：300μL/min，柱溫：35℃，進(jìn)樣量：5μL，進(jìn)樣室控溫：8℃。

質(zhì)譜條件：采用ABSCIEXTripleTOFTM5600液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行檢測(cè)，采用電噴霧離子化（ESI）源正負(fù)離子掃描模式，噴霧電壓（ISVF）：正離子5400V，負(fù)離子

4500V；離子化溫度（TEM）：550℃；霧化氣（GS1）：60psi；輔助加熱氣（GS2）：60psi；氣簾氣（CUR）：35psi。一級(jí)質(zhì)譜采集范圍為m/z100～1000，累積時(shí)間0.250015s；DP：80V；CE：10eV。采用IDA模式采集二級(jí)質(zhì)譜，采集范圍為m/z50～1000，累積時(shí)間0.100006s，DP：80V；CE：35eV；CES：15；IRD為67；IRW為25。IDA轉(zhuǎn)換標(biāo)準(zhǔn)為：信號(hào)強(qiáng)度>500cps，分子量誤差50mDa，每個(gè)循環(huán)最多監(jiān)測(cè)8個(gè)離子，在4Da內(nèi)排除同位素。采用Analyst1.6.0軟件控制LCMS分析系統(tǒng)，并采集分析數(shù)據(jù)。

樣品采用上述LCTOFMS分析方法進(jìn)行分析。為保證并監(jiān)測(cè)分析系統(tǒng)穩(wěn)定性，確保獲取數(shù)據(jù)的可靠性，本實(shí)驗(yàn)首先連續(xù)進(jìn)樣5針QC樣品以平衡色譜柱和系統(tǒng)，然后分析待測(cè)樣品。每隔5個(gè)樣品采用CDS系統(tǒng)自動(dòng)校準(zhǔn)一次，每隔10個(gè)樣品插入一個(gè)QC樣品。同時(shí)各組樣品隨機(jī)分布在整個(gè)分析批，以消除進(jìn)樣次序?qū)Ψ治鼋Y(jié)果的影響。

2.4數(shù)據(jù)處理

2.4.1數(shù)據(jù)有效性驗(yàn)證

根據(jù)QC樣品中分布于不同保留時(shí)間的代表性離子的色譜峰強(qiáng)度、保留時(shí)間（tR）和質(zhì)荷比（m/z）準(zhǔn)確度信息，對(duì)儀器系統(tǒng)的穩(wěn)定性和分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，并為后續(xù)樣品預(yù)處理參數(shù)設(shè)定提供依據(jù)。采用主成分分析（PCA）評(píng)估QC樣品聚類效果，進(jìn)一步驗(yàn)證分析數(shù)據(jù)的有效性和可靠性。

2.4.2預(yù)處理過程依據(jù)QC樣品中代表性色譜離子的tR和m/z的誤差范圍設(shè)定參數(shù)，將LCMS原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Markerview軟件中進(jìn)行色譜峰的尋找和校準(zhǔn)。根據(jù)tRm/z數(shù)據(jù)對(duì)應(yīng)檢測(cè)到的色譜峰的離子強(qiáng)度；根據(jù)80%原則及去除同位素離子獲取有意義的連續(xù)性變量；采用色譜峰總面積歸一化法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。

2.4.3多元統(tǒng)計(jì)分析將預(yù)處理過的分析數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCAP14.0中進(jìn)行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判別分析（OPLSDA）。PCA用于驗(yàn)證分析系統(tǒng)性能的穩(wěn)定性和分析數(shù)據(jù)的質(zhì)量，并發(fā)現(xiàn)可能的逃逸樣品。OPLSDA用于概覽整個(gè)分析批的數(shù)據(jù)，并分辨出導(dǎo)致組間差異的變量。以O(shè)PLSDA模型中得到的投射變量影響值（Variableimportanceinprojection，VIP）的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異閾值大于1作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。同時(shí)，采用Markerview軟件的t檢驗(yàn)功能對(duì)預(yù)處理過的數(shù)據(jù)進(jìn)行組間雙側(cè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和倍數(shù)變化（Foldchange，F(xiàn)C）分析，以同時(shí)滿足t檢驗(yàn)的p<0.01和FC>2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異代謝物。選取上述兩種篩選方法中的共同部分作為最終的差異代謝物。通過對(duì)比CDDP組與Control組和HO組間的共有差異代謝物，篩選變化趨勢(shì)一致者作為HO緩解大鼠CDDP毒性作用的潛在生物標(biāo)志物（Potentialbiomarkers，PBs）。

2.4.4生物標(biāo)志物鑒定和代謝通路分析通過解析各個(gè)PB的母離子和子離子TOFMS圖譜中蘊(yùn)含的元素組成和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，獲得其相應(yīng)的候選化合物列表；通過搜索匹配Chemspider，HMDB，METLIN，Massbank和KEGG等代謝組學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中的相應(yīng)化合物及其MS/MS2級(jí)圖譜，排除干擾的候選化合物，最終初步鑒定相應(yīng)PB的化學(xué)結(jié)構(gòu)。將包含峰強(qiáng)度信息的已鑒定PBs的數(shù)據(jù)集進(jìn)行如下處理：（1）導(dǎo)入MultipleArrayViewer以生成熱圖，并進(jìn)行HCA分析；（2）導(dǎo)入MetaboloAnalyst3.0中進(jìn)行代謝通路分析，同時(shí)結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道對(duì)生物標(biāo)志物的生理學(xué)意義進(jìn)行深入探討。

3結(jié)果與討論

3.1HO對(duì)CDDP模型大鼠的肌酐、尿素氮含量的影響

腎臟損害是CDDP最為常見的嚴(yán)重不良反應(yīng)。血清中肌酐和尿素氮水平是反應(yīng)腎功能的主要指標(biāo)。如表1所示，給予CDDP后，大鼠血清中肌酐和尿素氮水平顯著升高（p<0.01），而連續(xù)給予HO可顯著降低CDDP導(dǎo)致的肌酐和尿素氮水平的升高（p<0.05），表現(xiàn)出明顯的改善腎臟損傷作用。

3.2HO降低大鼠CDDP毒性的代謝〖ZH（組學(xué)研究

3.2.1代謝輪廓分析采用LCTOFMS進(jìn)行尿液樣本的分離和數(shù)據(jù)采集，圖1分別展示了正、負(fù)離子模式下各組典型的總離子流色譜圖（Totalionchromatograms，TICs）。由TIC圖可知，CDDP組，HO組和Control組的圖譜有一定差異。在對(duì)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理前，首先需要對(duì)所獲得的分析數(shù)據(jù)的質(zhì)〖ZH）量和有效性進(jìn)行驗(yàn)證。數(shù)據(jù)有效性驗(yàn)證結(jié)果表明，QC樣品中分布于不同保留時(shí)間的代表性離子的色譜峰強(qiáng)度的RSD均小于10%，tR漂移均小于0.25min，m/z波動(dòng)范圍不超過0.000007；同時(shí)本批分析數(shù)據(jù)的PCA分析結(jié)果顯示，PCA得分圖（圖2）中QC樣品緊密聚集。由此可知，該批次樣品分析過程中分析系統(tǒng)相對(duì)穩(wěn)定，獲得的分析數(shù)據(jù)基本可以反映樣品的真實(shí)狀態(tài)。

為了進(jìn)一步考察其代謝輪廓變化，采用無監(jiān)督的PCA方法處理LCMS數(shù)據(jù)，以表征組間差異。從PCA得分圖（圖2）可見：3組樣品在不同的區(qū)域分別聚類，組間可明顯區(qū)分，且HO組樣品位于CDDP組和Control組之間，表明給予HO后可使CDDP所致的機(jī)體損傷向正常狀態(tài)恢復(fù)。

3.2.2生物標(biāo)志物的篩選和鑒定先后采用監(jiān)督性的OPLSDA模式識(shí)別方法、組間雙側(cè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和倍數(shù)變化分析對(duì)LCMS數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以同時(shí)滿足VIP>1，p<0.01和FC>2為標(biāo)準(zhǔn)篩選導(dǎo)致組間差異的尿液代謝產(chǎn)物。根據(jù)其在不同組間的含量變化趨勢(shì)，共從中篩選出197個(gè)（正離子133個(gè)，負(fù)離子64個(gè)）差異代謝物作為HO緩解大鼠CDDP毒性作用的PBs。

采用2.5節(jié)方法對(duì)所有197個(gè)PBs進(jìn)行初步鑒定。以PB3（m/z_tR為141.0658_2.39）正離子為例，根據(jù)其分子離子m/z141.0658的精確分子質(zhì)量測(cè)定（誤差在5mDa以內(nèi)）及同位素匹配等原則可知，C6H8N2O2為其候選分子式；在METLIN和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中共有4個(gè)內(nèi)源性代謝物Ethylimidazolecarboxylate，Methylimidazoleaceticacid、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil與此分子式相對(duì)應(yīng)。如圖3所示，在PB3的二級(jí)圖譜中，其分子離子可先后丟失18Da（H2O）和28Da（CO），表明其化學(xué)結(jié)構(gòu)中含有羧基，據(jù)此可以排除候選化合物Ethylimidazolecarboxylate、Gaboxadol和1，3Dimethyluracil。而可歸屬為咪唑環(huán)的特征碎片的m/z為68.0516的碎片離子的存在，可進(jìn)一步證明該圖譜應(yīng)為Methylimidazoleaceticacid的二級(jí)圖譜。借助TOFMS的精確分子質(zhì)量測(cè)定和Peakview軟件的fragmentsPane功能，我們對(duì)PB3的特征碎片離子進(jìn)行了合理歸屬（如圖3所示）。需要指出的是，上述步驟并不能保證PBs的唯一歸屬，尚需參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道來確認(rèn)鑒定結(jié)構(gòu)。最終，通過匹配METLIN等數(shù)據(jù)庫(kù)，解析2級(jí)圖譜和參考相關(guān)報(bào)道，初步鑒定了35個(gè)PBs。表2總結(jié)了35個(gè)PBs的詳細(xì)信息，包括離子類型、質(zhì)荷比、保留時(shí)間、分子式、化合物名稱、CDDP組與Control組相比的變化趨勢(shì)、VIP值、p值、FC值等。

將包含35個(gè)PBs化合物名稱和相對(duì)色譜峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MultipleArrayViewer軟件，經(jīng)lg2轉(zhuǎn)化后進(jìn)行HCA聚類分析生成其相應(yīng)的熱圖（圖4）。由圖4中顏色變化可以清晰地看到，給予CDDP后，各個(gè)PBs在尿液中的含量與Control組相比出現(xiàn)了明顯變化，而給予HO可改善這些改變；樹狀分支圖顯示了各個(gè)樣品間的親緣關(guān)系，由此可知，HO大體位于CDDP和Control中間，形象地反映了HO改善CDDP所致?lián)p傷的作用。

3.3代謝通路分析及其生物學(xué)意義探討

將包含35個(gè)PBs化合物名稱和相對(duì)色譜峰強(qiáng)度的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MetaboloAnalyst3.0中進(jìn)行代謝通路分析，如圖5所示，有6條顯著改變（p>0.05）的代謝通路，分別對(duì)應(yīng)12個(gè)已鑒定的PBs。而通過HMDB和KEGG等數(shù)據(jù)庫(kù)及文獻(xiàn)搜索可知，剩余21個(gè)PBs對(duì)應(yīng)于7條通路（詳見表2中的PA14～20）。這些通路的紊亂與回調(diào)與CDDP的機(jī)體毒性及HO的解毒作用機(jī)制緊密相關(guān)。

氨基酸是機(jī)體的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，和蛋白質(zhì)及多肽一樣，氨基酸代謝對(duì)于機(jī)體的生長(zhǎng)、繁殖及免疫等而言至關(guān)重要[14]。標(biāo)志物鑒定結(jié)果（表2）表明，共有16個(gè)潛在生物標(biāo)志物可能與9條氨基酸生物合成及代謝通路相關(guān)，其中13個(gè)在給予CDDP后濃度水平顯著上調(diào)，而在給予HO后可明顯下降，說明連續(xù)給予HO可回調(diào)CDDP導(dǎo)致〖CM（44的機(jī)體氨基酸代謝通路紊亂。而代謝通路分析（圖5）結(jié)果顯示，苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝〖CM）

通路為改變最為顯著的代謝通路，且有多達(dá)12個(gè)潛在標(biāo)志物與此通路相關(guān)（圖6）。由此可知，回調(diào)苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝通路的紊亂為HO降低CDDP機(jī)體毒性的主要作用途徑之一。此外，給予CDDP后Allysine[15]和4Pyridoxicacid的下調(diào)，表明CDDP會(huì)導(dǎo)致機(jī)體維生素B6代謝通路紊亂。而維生素B6是機(jī)體內(nèi)某些輔酶的組成成分，參與多種代謝反應(yīng)，尤其是和氨基酸代謝有密切關(guān)系[16]。由此可以推測(cè)，CDDP導(dǎo)致的氨基酸代謝紊亂可能與維生素B6代謝紊亂有關(guān)。

脂肪酸是細(xì)胞膜的重要組成成分和體內(nèi)最大的能量?jī)?chǔ)備物質(zhì)。據(jù)報(bào)道，單一劑量的CDDP會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣非依賴性磷脂酶A2的激活和線粒體脂肪酸氧化的抑制，最終會(huì)使非酯化脂肪酸和甘油三酯在血清、尿液和腎臟組織內(nèi)積累[17]。由表2和圖6可知，給予CDDP后，有3個(gè)脂肪酸類代謝產(chǎn)物（PB16，PB27，PB35）出現(xiàn)明顯上調(diào)，這與之前的研究報(bào)道一致；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)1個(gè)脂肪酸類代謝產(chǎn)物（PB26）下調(diào)。

煙酸及煙酰胺是輔酶Ⅰ和輔酶Ⅱ的組成部分，參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧分解等過程。因此，給予CDDP后3個(gè)煙酸和煙酰胺通路相關(guān)代謝物的含量上調(diào)（PB23和PB24）或下降（PB21），提示可能存在脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)等代謝通路紊亂；而三羧酸循環(huán)代謝產(chǎn)物PB9的上調(diào)進(jìn)一步表明CDDP導(dǎo)致了三羧酸循環(huán)的紊亂。而這些現(xiàn)象與先前有關(guān)CDDP可導(dǎo)致機(jī)體線粒體機(jī)能失調(diào)，繼而引發(fā)ATP合成障礙，造成機(jī)體能量代謝紊亂的報(bào)道相一致[18]。

根據(jù)VIP值大小可判斷代謝物對(duì)組間差異的貢獻(xiàn)度。將表2中所有35個(gè)PBs按VIP值重新排序發(fā)現(xiàn)，共有15個(gè)PBs的組間對(duì)比VIP值均大于2，表明與這些PBs相關(guān)的代謝通路與HO改善CDDP毒性作用最為相關(guān)。而在這15個(gè)PBs中，除了11種化合物與上述的氨基酸代謝和能量代謝紊亂外，另有PB25（VIP排名第2）與嘌呤代謝相關(guān)，PB4，PB1和PB14（VIP排名第7，11，12）與嘧啶代謝相關(guān)，它們?cè)诮o予CDDP后均顯著升高，而在給予HO后又可顯著回調(diào)，這表明回調(diào)核苷酸代謝的異常激活可能為HO降低順鉑毒性的主要作用機(jī)制之一。

基于上述分析，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)信息，可將HO減弱順鉑所致大鼠機(jī)體毒性所涉及到的體內(nèi)主要代謝通路網(wǎng)絡(luò)總結(jié)如圖6所示，HO主要可通過調(diào)節(jié)機(jī)體苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸合成及代謝、脂肪酸代謝、三羧酸循環(huán)、維生素B6代謝、煙酸煙酰胺代謝、嘌呤和嘧啶代謝等通路的紊亂，恢復(fù)機(jī)體氨基酸、能量和核苷酸的代謝平衡，發(fā)揮其降低CDDP機(jī)體毒性的作用。

4結(jié)論

本研究采用基于LCTOFMS的尿液代謝組學(xué)研究方法，從整體水平代謝產(chǎn)物輪廓層面證明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用，并從尿液中篩選鑒定出35個(gè)表征HO減毒作用的PBs。本研究初步闡明了HO降低大鼠CDDP毒性的作用機(jī)制主要與改善機(jī)體氨基酸、能量和核苷酸代謝相關(guān)。

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AbstractAliquidchromatographyquadrupoletimeofflightmassspectrometer（LCQ/TOFMS）basedurinarymetabolomicapproachwasemployedtoassessthetoxicityalleviationeffectofHuangqioralsolution（HOs）oncisplatinexposedratsandexploreitspossiblemechanisms.Rattoxicitymodelwasdevelopedbymultipleintraperitonealinjectionoflowdosecisplatin，whileHOswasorallyadministratedtoratssimultaneouslyfor16consecutivedaystoattenuateorreducethecisplatininducedtoxicity.24hoururinesamplesonday18werecollectedandanalyzedusingLCQ/TOFMStoobtainthedatasetofurinarymetabolites.Principalcomponentanalysis（PCA）andorthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis（OPLSDA）wereemployedtoassessthequalityofthedatasetandscreenthepotentialtoxicityalleviationbiomarkers.Theserumlevelofratcreatinineandureanitrogenonday20wasdetermined，andtheresultsshowedthatsuccessiveadministrationofHOssignificantlyreducedthecisplatininducedincreaseofcreatinineandureanitrogen.PCAclusteranalysisclearlydemonstratedthatHOscouldpartlyimprovetheCDDPinducedabnormalityofmetabolicprofiling.35urinarymetaboliteswerefinallyscreenedasthepotentialbiomarkersassociatedwiththetoxicityattenuationeffectofHOs，accordingtothecombinationoftheanalysisresultsofOPLSDA，ttestandfoldchangeanalysis.FurthermetabolicpathwayanalysisrevealedthatHOscouldrestorethemetabolicdisordersofaminoacid，energyandnucleotide，therebyexerteditstoxicityalleviationeffect.

KeywordsHuangqioralsolution；Cisplatin；Urine；Metabolomics；Liquidchromatographytimeofflightmassspectrometry；Toxicity

（Received1November2016；accepted30December2016）

ThisworkwassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina（No.81503300）.