水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)解析及能力驗(yàn)證工作探討

孫偉紅，劉歡，邢麗紅，郭萌萌，孫曉杰，吳海燕，魏志強(qiáng)

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(青島)，青島 266071；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141;3.山東省青島市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，青島266003)

水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)解析及能力驗(yàn)證工作探討

孫偉紅1，劉歡2*，邢麗紅1，郭萌萌1，孫曉杰1，吳海燕1，魏志強(qiáng)3

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(青島)，青島 266071；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141;3.山東省青島市環(huán)境監(jiān)測(cè)中心站，青島266003)

隨著水產(chǎn)品養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量的不斷提高，水產(chǎn)品質(zhì)量安全問(wèn)題日益突出，特別是獸藥殘留，已逐漸引起消費(fèi)者極大的關(guān)注，其重要性也愈發(fā)凸顯。文章從水產(chǎn)品獸藥殘留常用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法、方法操作要領(lǐng)和關(guān)鍵點(diǎn)以及做好水產(chǎn)品能力驗(yàn)證工作的建議入手，詳細(xì)闡述了中國(guó)水產(chǎn)品藥物殘留監(jiān)控重點(diǎn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)方法差異及注意事項(xiàng)，旨在為實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)技術(shù)水平的提高，能力驗(yàn)證通過(guò)率的增加及檢驗(yàn)質(zhì)量的保證提供參考與借鑒。[中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，2017,7(2):11-18]

水產(chǎn)品；獸藥殘留；標(biāo)準(zhǔn)；檢測(cè)技術(shù)；能力驗(yàn)證

獸藥殘留(animal drug residues)是指給動(dòng)物使用藥物后蓄積或貯存在細(xì)胞、組織或器官內(nèi)的藥物原形、代謝產(chǎn)物和藥物雜質(zhì)[1]。近10年來(lái)，水產(chǎn)品中獸藥殘留問(wèn)題引起了社會(huì)的廣泛關(guān)注，也經(jīng)歷了貿(mào)易壁壘的多發(fā)期，直接影響著中國(guó)水產(chǎn)行業(yè)的轉(zhuǎn)型和升級(jí)。在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過(guò)程中，非法使用違禁藥物、不遵守休藥期、生物體代謝差異和不合理用藥等都有可能導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)。

獸藥殘留分析的檢測(cè)手段多樣，酶聯(lián)免疫試劑盒、膠體金免疫試紙條和熒光試紙條等快速檢測(cè)產(chǎn)品能夠?qū)崿F(xiàn)高通量、快速篩選，其靈敏度、準(zhǔn)確性和時(shí)效性正在不斷優(yōu)化和革新；氣相色譜儀、液相色譜儀、氣相色譜-質(zhì)譜儀、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀和高分辨質(zhì)譜等儀器是實(shí)驗(yàn)室常用的分析設(shè)備，具有定量準(zhǔn)確、準(zhǔn)確度更高等優(yōu)點(diǎn)，特別是具有高靈敏度、高分辨率的質(zhì)譜儀，是進(jìn)行陽(yáng)性樣品確證分析的首選。

目前，獸藥殘留測(cè)定是進(jìn)行水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的主要手段，氯霉素、孔雀石綠和硝基呋喃等禁用藥物是藥物殘留監(jiān)控的重點(diǎn)，為了確保水產(chǎn)品的質(zhì)量安全，氟甲砜霉素、甲砜霉素、磺胺類和喹諾酮類等限用藥物也早已納入監(jiān)控工作。但是由于各個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的檢驗(yàn)?zāi)芰α驾积R，有時(shí)會(huì)對(duì)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性存在質(zhì)疑，影響了監(jiān)控工作的權(quán)威性，因此監(jiān)管部門將能力驗(yàn)證作為檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室能力水平的一個(gè)主要的方式。

能力驗(yàn)證(proficiency testing)是通過(guò)實(shí)驗(yàn)室間比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則來(lái)判定實(shí)驗(yàn)室能力的活動(dòng)。能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可機(jī)構(gòu)加入和維持國(guó)際相互承認(rèn)協(xié)議(mutual recognition agreement, MRA)的必要條件之一，也是實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行自我評(píng)價(jià)的手段[2]。中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品能力驗(yàn)證考核始于2003年，雖然起步較晚，但是實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的方法標(biāo)準(zhǔn)均參考國(guó)外權(quán)威機(jī)構(gòu)的標(biāo)準(zhǔn)制定，10多年來(lái)技術(shù)能力取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步。能力驗(yàn)證在檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的覆蓋率逐年增加，監(jiān)管部門通過(guò)組織能力驗(yàn)證，可以了解實(shí)驗(yàn)室是否有能力勝任所從事的監(jiān)控工作；實(shí)驗(yàn)室通過(guò)參加能力驗(yàn)證，了解自身能力，將其作為內(nèi)部質(zhì)量控制的補(bǔ)充措施，滿足持續(xù)改進(jìn)的要求。

在實(shí)際檢測(cè)工作中，同一個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目可以從多個(gè)檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)中選擇，這些技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)主要在前處理方法和儀器設(shè)備的選擇上存在差異，需要根據(jù)檢測(cè)的目的和要求進(jìn)行選擇。為了解決水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)中由于標(biāo)準(zhǔn)方法差異和操作不熟練出現(xiàn)檢驗(yàn)結(jié)果不準(zhǔn)確的問(wèn)題，本文綜述了水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控工作中關(guān)注較多的獸藥殘留測(cè)定檢測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各種檢測(cè)方法的差異、適用性和靈敏度等進(jìn)行了介紹，并詳細(xì)說(shuō)明了標(biāo)準(zhǔn)操作中應(yīng)該注意的問(wèn)題和解決辦法等，最后提出做好能力驗(yàn)證工作的建議，旨在為提高實(shí)驗(yàn)室的水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)能力和能力驗(yàn)證整體水平提供借鑒。

1 水產(chǎn)品獸藥殘留標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法概述

1.1 硝基呋喃類代謝物

硝基呋喃類藥物是一類化學(xué)合成的廣譜抗菌藥物，常見(jiàn)的有呋喃唑酮(furazolidone，F(xiàn)ZD)、呋喃西林(nitrofurazone，NFZ)、呋喃妥因(nitrofurantion，NFT)和呋喃它酮(furaltadone，F(xiàn)TD)，曾廣泛用于畜禽、水產(chǎn)等動(dòng)物傳染病的預(yù)防與治療。硝基呋喃類藥物原藥及其代謝產(chǎn)物具有一定的毒性，有致畸、致突變和致癌的危險(xiǎn)[3]。出于安全性考慮，自1993年開(kāi)始，歐盟、美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)先后頒布了禁止使用該類獸藥的禁令[4-5]。中國(guó)于2002年頒布的農(nóng)業(yè)部第193號(hào)公告《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其它化合物清單》，明確禁止使用硝基呋喃類廣譜抗菌藥物[6]。但是由于硝基呋喃類藥物價(jià)格低廉、療效好，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中仍存在違禁使用的現(xiàn)象，在近幾年開(kāi)展的水產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)隱患排查工作中屢有檢出。硝基呋喃類藥物在生物體內(nèi)代謝迅速，很難檢測(cè)到原藥，因此標(biāo)準(zhǔn)方法都是對(duì)其代謝產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)定，表1中列出了當(dāng)前適用于水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，均采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)進(jìn)行測(cè)定，其中農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006是中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的推薦方法，該方法的適用范圍廣、定量準(zhǔn)確、靈敏度高，是常用的檢測(cè)方法。

表1 水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物殘留測(cè)定方法標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Detection standard of nitrofuran metabolic residues in aquatic products

注：a示檢出限(LOD)，b示定量限(LOQ)。下表同。

1.2 孔雀石綠

孔雀石綠(malachite green, MG)作為一種三苯甲烷類染料，曾廣泛用作水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的驅(qū)蟲(chóng)劑和殺菌劑，以防治魚(yú)類水霉病、鰓霉病、及小瓜蟲(chóng)病等，是一類抗菌效力較強(qiáng)的藥用染料。然而，MG不僅在生物體內(nèi)有明顯蓄積現(xiàn)象，且迅速被代謝成隱色孔雀石綠(leucomalachite green, LMG)。在魚(yú)體內(nèi)和環(huán)境中殘留時(shí)間長(zhǎng)，具有潛在的“三致”作用[11]，因此包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都禁止其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中使用。但是由于MG抗菌效果較好，價(jià)格低廉且無(wú)有效替代藥物等原因，在近幾年的監(jiān)控工作中發(fā)現(xiàn)MG仍在個(gè)別水產(chǎn)品種的養(yǎng)殖中違規(guī)使用。表2是水產(chǎn)品中MG殘留測(cè)定常用的方法標(biāo)準(zhǔn)，GB/T 19857—2005 (第一法)和GB/T 20361—2006的檢測(cè)結(jié)果相近，差異不顯著，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)室情況自行選擇。但是與液相色譜法(LC)相比，LC-MS/MS前處理操作相對(duì)簡(jiǎn)單，定性方式更準(zhǔn)確，是進(jìn)行陽(yáng)性樣品確證的必要方法，也是農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)控的首選方法。

表2 水產(chǎn)品中孔雀石綠殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法Tab.2 Detection standard of malachile green in aquatic products

1.3 氯霉素

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是1947年首次從委內(nèi)瑞拉鏈絲菌的培養(yǎng)液中提取而得到的抗生素[14]，具有廣譜抗菌作用，對(duì)多數(shù)G+、G-菌均有效，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中能有效防治爛鰓、赤皮病。CAP對(duì)人類的毒性較大，可抑制骨髓造血機(jī)能、造成過(guò)敏反應(yīng)，引起不可逆的再生性障礙貧血等[15]。美國(guó)、日本、韓國(guó)和歐盟等國(guó)家和地區(qū)均已禁止在食用性動(dòng)物中使用氯霉素，并規(guī)定在動(dòng)物源性食品中不得檢出。中國(guó)農(nóng)業(yè)部在2002年12月第235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定CAP為禁用藥物，在動(dòng)物性食品中不得檢出[6]。目前，CAP是中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的對(duì)象之一，其抑菌效果優(yōu)于其替代藥物，近年來(lái)在大宗水產(chǎn)品中的檢出率不高，但是帶入途徑復(fù)雜，仍是目前監(jiān)控的重點(diǎn)。

水產(chǎn)品中CAP殘留量的測(cè)定方法很多，包括酶標(biāo)法、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)和LC-MS/MS等(表3)。其中酶標(biāo)法用于CAP的快速篩查測(cè)定，氣相色譜法可以用于CAP的準(zhǔn)確定量測(cè)定， LC-MS/MS和GC-MS法均可以作為CAP殘留的確證方法，在對(duì)陽(yáng)性樣品的測(cè)定中，可以互為補(bǔ)充。

表3 水產(chǎn)品中氯霉素殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法Tab.3 Detection Standard of chloramphonicol in aquatic products

1.4 磺胺類

磺胺類藥物(sulfonamides, SAs)是對(duì)氨基苯磺酰胺結(jié)構(gòu)的一類藥物的總稱，主要用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染性疾病。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中主要用于治療魚(yú)、蝦、蟹、鱉等動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，防治鯉的赤鰭病，香魚(yú)、虹鱒等的弧菌病等。由于SAs在生物體內(nèi)的作用時(shí)間和代謝時(shí)間較長(zhǎng)，蓄積濃度超過(guò)一定值會(huì)對(duì)人體健康造成危害，導(dǎo)致很多細(xì)菌對(duì)SAs產(chǎn)生抗藥性[1]。因此，許多國(guó)家都對(duì)SAs的使用限量進(jìn)行了規(guī)定，歐盟規(guī)定肉類食品中磺胺類藥物的最高殘留限量(MRL)為：?jiǎn)我籗As藥物≤25 μg/kg，SAs總量≤100 μg/kg；日本肯定列表規(guī)定動(dòng)物源性食品中單一SAs 0.01～0.1 mg/kg，其中水產(chǎn)品為0.1 mg/kg；國(guó)際食品法典委員會(huì)與中國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中均規(guī)定動(dòng)物組織中SAs藥物的MRL為100 μg/kg。

表4是水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留測(cè)定的方法標(biāo)準(zhǔn)，其中農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007和農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008是常用的檢測(cè)方法，農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007前處理繁瑣，回收率稍低，靈敏度基本能夠滿足限量要求；農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008方法簡(jiǎn)便快捷，靈敏度高，可以用于磺胺類藥物的陽(yáng)性確證。

2 方法操作要領(lǐng)和關(guān)鍵點(diǎn)

2.1 硝基呋喃類代謝物

2.1.1 標(biāo)液配制

1)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制時(shí)，應(yīng)查看證書(shū)上的分子式和純度，氨基脲(semicarbazize,SEM)和1-氨基乙內(nèi)酰脲(1-aminohydantoin,AHD)的分子結(jié)構(gòu)中通常帶有鹽酸鹽，應(yīng)根據(jù)分子量和純度進(jìn)行折算，配制時(shí)可借助超聲波助溶。

表4 水產(chǎn)品中磺胺類殘留標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法Tab.4 Detection standard of SAs in aquatic products

2)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液低溫放置后，稀釋時(shí)應(yīng)恢復(fù)至室溫，觀察是否有結(jié)晶析出，如有結(jié)晶析出，需重新?lián)u勻溶解后再稀釋。

3)硝基呋喃類代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線需要衍生化，因此要與測(cè)試樣品同時(shí)進(jìn)行前處理。

2.1.2 提取過(guò)程

1)待測(cè)樣品開(kāi)始提取時(shí)加入鹽酸調(diào)節(jié)pH約為1，因?yàn)椴煌瑯悠坊|(zhì)酸堿度有差異，故要測(cè)pH。

2)衍生化過(guò)程振蕩時(shí)間16 h并非嚴(yán)格控制，實(shí)驗(yàn)證明振蕩12 h以上就能保證衍生化完全。

3)衍生化后調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5(pH試紙測(cè)試)，常規(guī)樣品不需要再調(diào)節(jié)，如果難以調(diào)節(jié)，可考慮加入50 μL NaOH溶液(1 mol/L)。

2.1.3 凈化過(guò)程

1)對(duì)于乙酸乙酯反萃取過(guò)程中發(fā)生乳化的樣品，可將離心轉(zhuǎn)速提高至6 000 r/ min以上，或者增加離心時(shí)間，可明顯改善乳化層。

2)對(duì)于定容后仍舊渾濁的樣品，可以采用正己烷去脂，14 000r/min離心10 min以上，脂肪漂浮在上層，取下層清液，過(guò)0.22 μm濾膜后進(jìn)樣。

3)對(duì)于基質(zhì)干擾大的樣品，如果采用SPE法凈化，可以參考GB/T 20752—2006，使用Oasis HLB 固相萃取柱。使用前依次用5 mL甲醇、10 mL水活化，將待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中，用10 mL水洗滌，抽至近干后，用5 mL乙酸乙酯洗脫，并于40 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉?.0 mL流動(dòng)相溶解。

2.1.4 色譜條件

采用C18色譜柱進(jìn)行測(cè)試，推薦進(jìn)樣量為10 μL。流動(dòng)相中的有機(jī)相推薦使用甲醇，因?yàn)槠潇`敏度和分離效果更好。不同廠家的儀器對(duì)水相的選擇有差別，通常采用2 mmol/L醋酸銨或者0.1%甲酸。

2.1.5 特殊樣品的處理

1)對(duì)于殘留量超出線性范圍的樣品，可以采取以下方式：一是減少稱樣量，根據(jù)估算結(jié)果，確定是否可以通過(guò)減少稱樣量實(shí)現(xiàn)目的；二是加大內(nèi)標(biāo)的量，并在定容時(shí)稀釋到相應(yīng)濃度。

2)SEM是呋喃西林藥物的特征性代謝產(chǎn)物，但是它作為內(nèi)源性物質(zhì)在甲殼類產(chǎn)品中普遍存在，因此在對(duì)這類樣品進(jìn)行測(cè)試時(shí)，應(yīng)考查該藥物的帶入途徑。

2.2 孔雀石綠

2.2.1 標(biāo)液配制

1)孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品的分子結(jié)構(gòu)中可能帶有草酸鹽，配制標(biāo)準(zhǔn)貯備液時(shí)應(yīng)根據(jù)分子量和純度進(jìn)行折算。

2)由于孔雀石綠不穩(wěn)定，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液保存可采用少量分裝，-18℃避光保存的方式。

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線現(xiàn)用現(xiàn)配，標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度最高點(diǎn)≤100 ng/mL，避免檢測(cè)器飽和并防止污染儀器和色譜柱。

2.2.2 提取過(guò)程

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 20361—2006，采用二氯甲烷進(jìn)行反萃取時(shí)，如果分層不明顯，可能二氯甲烷發(fā)生倒相，此時(shí)應(yīng)該加入適量的超純水或二氯甲烷，以使二氯甲烷相處于下層。

2.2.3 定容過(guò)程

采用標(biāo)準(zhǔn)方法GB/T 19857—2005測(cè)定時(shí)，定容過(guò)程應(yīng)充分溶解殘留物，可超聲30 s。如果定容后樣品溶液較渾濁，可將溶液移入2 mL離心管中，進(jìn)行14 000 r/min高速離心，進(jìn)一步去除大分子雜質(zhì)。

2.2.4 色譜條件

流動(dòng)相中水相的pH對(duì)色譜峰形影響較大(圖1)，pH調(diào)為4.5后峰形明顯改善，調(diào)節(jié)方式為在500 mL乙酸銨溶液中加入60 μL甲酸即可。

圖1 流動(dòng)相pH對(duì)孔雀石綠(1 ng·mL-1)色譜峰形的影響(a)未調(diào)節(jié)pH的水相;(b)pH調(diào)為4.5的水相。Fig.1 Effects of mobile phase pH on chromatographic peak profiles of MG (1 ng·mL-1)(a)The pH value of aqueous phase was not adjusted;(b)The pH value of aqueous phase was adjusted to 4.5.

2.3 氯霉素

2.3.1 氣相色譜法

SC/T 3018—2004為水產(chǎn)品中氯霉素殘留量測(cè)定的氣相色譜法，方法前處理步驟繁瑣，操作中要注意以下幾點(diǎn)：

1)樣品均質(zhì)提取應(yīng)充分，并減少刀頭上樣品的附著，避免樣品交叉污染。

2)凈化時(shí)振蕩混合過(guò)程要?jiǎng)×摇⒊浞郑看尾簧儆? min，盡量減少提取液轉(zhuǎn)移過(guò)程中的損失。

3)衍生化反應(yīng)前要注意防潮，所用器皿中不能有水，衍生化反應(yīng)后，恢復(fù)室溫，再進(jìn)行氮吹，吹干過(guò)程很短，以剛好吹干為準(zhǔn)。

2.3.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

GB/T 20756—2006、SN/T 1864—2007和農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-2-2006均為水產(chǎn)品中氯霉素殘留測(cè)定的LC-MS/MS法，這3個(gè)方法的測(cè)定原理相似，前處理都比較簡(jiǎn)單，均可用于氯霉素殘留的確證分析。但是凈化過(guò)程存在區(qū)別，GB/T 20756—2006中正己烷液液萃取脫脂凈化方式的干擾較大，SN/T 1864—2007的凈化效果更好(圖2)。

圖2 3種標(biāo)準(zhǔn)方法的凈化效果比較(a)GB/T 20756—2006；(b)SN/T 1864—2007；(c)農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-2-2006。Fig.2 Comparison on purification effects of the three standard methods(a)GB/T 20756—2006; (b)SN/T 1864—2007; (c)Announcement of the Ministry of Agriculture No.781-2-2006.

對(duì)于色譜條件的選擇，當(dāng)樣品中干擾雜質(zhì)對(duì)氯霉素的離子化或?qū)ιV峰背景干擾時(shí)，推薦采用梯度洗脫的方式。

2.4 磺胺類

2.4.1 液相色譜法

農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007為液相色譜法，包括紫外檢測(cè)法(UVD)和熒光檢測(cè)法(FLD)兩個(gè)方法。紫外法和熒光法的準(zhǔn)確度和靈敏度都能滿足檢測(cè)要求，但是紫外法的基質(zhì)干擾較大，目標(biāo)峰難以有效分離，而熒光法的干擾小，靈敏度更高。采用紫外檢測(cè)法時(shí)要注意以下事項(xiàng)：1)濃縮過(guò)程應(yīng)注意避光和嚴(yán)格控制溫度，同時(shí)也要避免因過(guò)快的濃縮降低回收率，才能確保藥物殘留在溶液中的穩(wěn)定性。2)濃縮后溶解殘?jiān)鼤r(shí)，要保證溶劑的用量，如果不能完全溶解時(shí)可以適當(dāng)增加乙酸溶液的用量，有效溶解梨形瓶中的SAs。3)SPE凈化時(shí)，如果上樣溶液中含有正己烷，會(huì)導(dǎo)致回收率下降，如果采用自動(dòng)固相萃取儀，將上樣速度設(shè)為3 mL/min時(shí)回收率最高。

2.4.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008是水產(chǎn)品中磺胺類多殘留測(cè)定的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，方法簡(jiǎn)單、快速。在具體操作過(guò)程中需要注意以下兩個(gè)方面。

1)部分磺胺類標(biāo)準(zhǔn)品的溶解度不好，在進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)溶液配制時(shí)，可以加入200～400 μL甲酸助溶，還可以降低標(biāo)準(zhǔn)貯備液的配制濃度。此外標(biāo)準(zhǔn)使用液應(yīng)定期配制，否則對(duì)峰形有影響。標(biāo)準(zhǔn)曲線配制時(shí)應(yīng)該采用流動(dòng)相進(jìn)行稀釋，用純甲醇稀釋的標(biāo)準(zhǔn)溶液在色譜柱上無(wú)保留。

2)提取過(guò)程中，應(yīng)將無(wú)水硫酸鈉與樣品充分?jǐn)噭蚝螅偌尤胩崛∫海乐箻悠方Y(jié)塊，提高提取效率。對(duì)于復(fù)雜基質(zhì)的樣品，正己烷去脂后，可以采用低溫高速離心的方法。

3 對(duì)做好水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)技術(shù)能力驗(yàn)證工作的建議

根據(jù)能力驗(yàn)證活動(dòng)的要求，選擇正確的檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)，掌握檢測(cè)方法的操作要領(lǐng)和關(guān)鍵點(diǎn)，減少方法對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響是確保順利通過(guò)能力驗(yàn)證工作的關(guān)鍵。在此基礎(chǔ)上，還建議采取做好準(zhǔn)備工作，提高檢測(cè)能力，保證質(zhì)量控制措施到位，以及對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行正確的修約等如下保障措施，減少不滿意結(jié)果的產(chǎn)生。

3.1 提前練習(xí)

按規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)操作程序或作業(yè)指導(dǎo)書(shū)進(jìn)行操作，熟練掌握方法的前處理過(guò)程，并能重現(xiàn)方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液核查

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)要求重新配置標(biāo)準(zhǔn)貯備液或購(gòu)置有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，并與在用標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行核對(duì)，保證標(biāo)準(zhǔn)溶液的有效性。

3.3 考核樣品的處理

檢查編號(hào)是否準(zhǔn)確，包裝是否完整、無(wú)破損，按照通知要求進(jìn)行保存。嚴(yán)禁用微波等加熱方式對(duì)樣品解凍，應(yīng)在室溫下自然解凍后再進(jìn)行前處理。樣品前處理過(guò)程中，應(yīng)盡量避光操作。

3.4 做好質(zhì)量控制

質(zhì)量控制中應(yīng)包括空白實(shí)驗(yàn)(包括試劑空白和對(duì)應(yīng)的基質(zhì)空白)和控制樣品(檢出限加標(biāo)、3～10倍檢出限加標(biāo))，與考核樣品同時(shí)測(cè)定。空白實(shí)驗(yàn)可確保空白值在控制限內(nèi)，避免測(cè)試過(guò)程中的污染和空白基質(zhì)中的干擾。控制樣品的有效性可確保測(cè)試結(jié)果的靈敏度和準(zhǔn)確度。

3.5 檢測(cè)結(jié)果的判斷

在進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果計(jì)算時(shí)，首先應(yīng)考察校準(zhǔn)曲線是否滿足要求，其次是平行樣的測(cè)定結(jié)果是否在相對(duì)偏差范圍內(nèi)，然后是質(zhì)控樣品的準(zhǔn)確度和靈敏度是否符合標(biāo)準(zhǔn)要求，還要進(jìn)行不確定度的計(jì)算。對(duì)于偏差較大的數(shù)據(jù)，可以采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行測(cè)算，如平均值的置信區(qū)間等。

4 小結(jié)

通過(guò)對(duì)水產(chǎn)品獸藥殘留測(cè)定中常用的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行梳理，強(qiáng)化檢測(cè)方法中的操作要領(lǐng)和關(guān)鍵點(diǎn)，使檢測(cè)人員的實(shí)驗(yàn)操作技能得到提升，有利于提高水產(chǎn)品獸藥殘留檢測(cè)水平和能力驗(yàn)證的通過(guò)率，保證檢測(cè)質(zhì)量。隨著水產(chǎn)品能力驗(yàn)證工作的規(guī)范性和公正性的不斷加強(qiáng)，實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力將會(huì)得到快速提高，水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管水平也會(huì)不斷提升，有利于保障中國(guó)的水產(chǎn)品質(zhì)量安全。

[1] 李俊鎖，邱月明，王超. 獸藥殘留分析[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2002.

[2] 唐凌天，符斌. 實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證的發(fā)展[J]. 中國(guó)無(wú)機(jī)分析化學(xué), 2013, 3(4): 11-15.

[3] 王群，呂海燕，宋懌. 硝基呋喃類在水產(chǎn)品及其養(yǎng)殖環(huán)境中的消解規(guī)律研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2014, 4(6): 16-21.

[4] Hoogenbooma L A P, van Bruchema G D, Sonne K, et a1. Absorption of a mutagenic metabolite released from protein-bound residues of furazolidone [J]. Environ Toxicol Pharmacol, 2002, 11: 273-287.

[5] Chu P S, Lopez M I, Abraham A, et a1. Residue depletion of nitrofuran drugs and their tissue-bound metabolites in channel catfish (lctaluruspunctatus) after oral dosing [J]. J Agric Food Chem, 2008, 56: 8030-8034.

[6] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部公告第193號(hào)[S].北京：農(nóng)業(yè)部，2002.http://www.aqsiq.gov.cn/jgfl/jckspaqj/zcfg/200610/t20061027_9805.htm.

[7] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1627—2005進(jìn)出口動(dòng)物源食品中硝基呋喃類代謝物殘留量測(cè)定方法 高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2005.

[8] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 20752—2006 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

[9] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 21311—2007動(dòng)物源性食品中硝基呋喃類藥物代謝物殘留量檢測(cè)方法高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[10] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

[11] 王群，宋懌，馬兵.水產(chǎn)品中孔雀石綠的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估(一)[J]. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn), 2011, 1(2): 38-43.

[12] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 19857—2005水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2005.

[13] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 20361—2006水產(chǎn)品中孔雀石綠和結(jié)晶紫殘留量的測(cè)定高效液相色譜熒光檢測(cè)法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

[14] Ehrlich J Q, Bartz Q R, Smith R M, et al. Chloromycetin a new antibiotic from a soil actinomycete[J]. Science,1947, 106(2757):417.

[15] Allen E H. Review of chromatographic methods for chloramphenicol residues in milk,egg and tissues from food producing animal[J]. J Assoc Anal Chem, 1985, 68: 990-999.

[16] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部1025號(hào)公告-26-2008動(dòng)物源食品中氯霉素殘留檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008.

[17] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. SC/T 3018—2004 水產(chǎn)品中氯霉素殘留量的測(cè)定氣相色譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2004.

[18] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 20756—2006 可食動(dòng)物肌肉、肝臟和水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考?xì)埩袅康臏y(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

[19] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部781號(hào)公告-2-2006 動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的測(cè)定高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

[20] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1864—2007進(jìn)出口動(dòng)物源食品中氯霉素殘留量的檢測(cè)方法液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[21] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-14-2007水產(chǎn)品中氯霉素、甲砜霉素、氟甲砜霉素殘留量的測(cè)定氣相色譜-質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[22] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部958號(hào)公告-12-2007水產(chǎn)品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[23] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. 農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告-1-2008水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008.

[24] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 22951—2008河豚魚(yú)、鰻魚(yú)中十八種磺胺類藥物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008.

[25] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì). GB/T 21316—2007動(dòng)物源性食品中磺胺類藥物殘留量的測(cè)定高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

Standards analysis of detection techniques and discussion of proficiency testingfor veterinary drug residues in aquatic products

SUN Weihong1, LIU Huan2*, XING Lihong1, GUO Mengmeng1, SUN Xiaojie1, WU Haiyan1, WEI Zhiqiang3

(1.Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences; Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Aquatic Products(Qingdao), Ministry of Agriculture, Qingdao 266071, China; 2. Chinese Academy of Fishery Sciences；Key Labrotary of Control of Quanlity and Safety for Aquatic products，Ministy of Agriculture， Beijing 100141, China;3. Bureau of Environmental Protection of Qingdao, Shandong 266003,China)

With the constant improvement of the aquatic products breeding area and yield, the quality safety of the aquatic products become increasingly the prominent problem, especially the veterinary drug residues, and it has gradually attracted the attention of consumers due to its importance. This paper summarized the common standard methods for detecting veterinary drug residues, the main and key points in operation process of the method, and suggestions for proficiency testing work. Moreover, it has also described in detail the difference among standard methods and attentions for drug residue monitoring of accented terms in aquatic products in China. The review provided some references and suggestions for improving the level of detection techniques, increasing passing rate of laboratory proficiency testing, and ensuring the inspection quality of aquatic products.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(2):11-18]

aquatic products; veterinary drug residues; standards; detection techniques; proficiency testing

LIU Huan, liuh@cafs.ac.cn

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.02.003

2016-10-31；接收日期：2016-12-21

國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估項(xiàng)目(GJFP2016009)

孫偉紅(1977-)，女，博士，高級(jí)工程師，碩導(dǎo)，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品質(zhì)量安全及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，swh200122@163.com

S91

A

2095-1833(2017)02-0011-08

作者簡(jiǎn)介：劉歡，博士，副研，碩導(dǎo)，研究方向?yàn)樗a(chǎn)品食品安全，liuh@cafs.ac.cn