山芝麻多糖的超聲輔助提取工藝優化及對α—葡萄糖苷酶的抑制活性

劉錢薇++葛小東+張錢+程德林+許偉+邵榮+云志

摘要：以山芝麻粉為原料，以蒸餾水為提取劑，以多糖提取率為考察指標，采用超聲輔助法提取山芝麻多糖。在單因素試驗的基礎上，設計響應面試驗優化山芝麻多糖提取的工藝條件，并考察山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率。結果表明，最佳工藝條件為提取時間42 min、提取溫度83 ℃、液料比32 mL ∶[KG-*3]1 g，在此最優條件下，山芝麻多糖的提取率達到7.676%。山芝麻多糖的紫外、紅外譜圖分析可知，主要官能團有O—H鍵、糖類中甲基的C—H對稱和非對稱鍵、C[FY=，1]O鍵和吡喃型糖環。比較同濃度下阿卡波糖片和山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率發現，當濃度大于30 μg/mL時，山芝麻多糖的抑制率高于阿卡波糖片。綜合分析可知，山芝麻多糖有明顯的降血糖功效，研究結果可為山芝麻降糖產品的開發提供參考。

關鍵詞：山芝麻多糖；提取；響應面法；α-葡萄糖苷酶

中圖分類號： R284.2文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0183-05

山芝麻（Helicteres angustifolia L.）為梧桐科植物，其味苦、性寒，可解表清熱、解毒消腫。山芝麻始載于《生草藥性備要》[1]，是民間常用的中草藥。國內目前對山芝麻的研究主要著眼于抗炎、抗病毒[2]。潘英采用山芝麻、地膽草等制成復方感冒顆粒，用于治療感冒[3]；郭宏炳等采用崗梅、水楊梅和山芝麻制成復方崗梅沖劑，用于急性咽喉炎的治療[4]；黃權芳等采用血清藥理學方法，在乙型肝炎病毒（HBV）的體外細胞培養系統中進行山芝麻抗HBV作用觀察[5]。日本筑波大學張振亞等發現，山芝麻的水提物和醇提物具有降血糖、抗腫瘤的功效[6-9]。山芝麻作為一種中藥材，在總體藥效方面得到了廣泛的認可，但對于其有效活性成分的提取分離研究還不夠深入。近年來研究表明，部分天然植物多糖具有降血糖[10]、降血脂[11]、抗氧化[12]、抗凝血[13]、抗衰老[14]、增強免疫[15]等多重功效，使其成為科研人員關注的重點。

超聲波法提取多糖具有分散破壞植物組織、加快溶劑萃取、縮短浸提時間等優點，既彌補了傳統水提法的高能耗、低提取率的缺點，也避免了酶提法的耗時和超臨界萃取法對設備的高要求[16]。本研究采用超聲輔助法提取山芝麻多糖，并采用響應面法優化提取工藝，同時比較同濃度山芝麻多糖、阿卡波糖片對α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1材料與方法

1.1材料

試驗原料為山芝麻根。

試驗試劑：無水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無水乙醇、無水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、谷胱甘肽、溴化鉀，購自國藥科技有限公司；α-葡萄糖苷酶，購自美國Sigma公司；阿卡波糖片，購自德國拜耳公司。以上試劑均為分析純。

1.2主要儀器設備

主要儀器與設備：XO-SM50超聲微波組合反應系統，南京先歐生物科技有限公司；TGLL-18K高速冷凍離心機，太倉市華美生化儀器廠；EYELAN-1100旋轉蒸發儀，埃朗科技國際貿易（上海）有限公司；FD-1A-5D冷凍干燥箱，北京博醫康醫療有限公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；UV2310Ⅱ紫外可見分光光度儀，上海天美科學儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1原料預處理將山芝麻根洗凈，于50 ℃烘干、粉碎，過100目篩，再將粉末于95%乙醇中浸泡48 h，去除其中的雜質，于50 ℃烘干備用。

1.3.2葡萄糖標準曲線繪制稱取適量經過105 ℃干燥的無水葡萄糖，加蒸餾水配成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液，分別精確量取葡萄糖對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于8支試管中，分別加蒸餾水至總體積為2.0 mL，另加2.0 mL蒸餾水于1支試管中作為空白對照。采用改良的硫酸-苯酚法[17-18]，在490 nm處測吸光度，以稀釋的葡萄糖標樣濃度C（mg/mL）為橫坐標，以D490 nm為縱坐標，繪制標準曲線方程：D490 nm=0.843 5C+0.170 3，r2=0.993。

1.3.3山芝麻多糖提取及其多糖含量測定精確稱取10 g山芝麻根粉末（經“1.3.1”節方法處理），在不同提取溫度、時間、料液比條件下提取山芝麻多糖，對提取液進行離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測定提取液的體積；取 1 mL 粗多糖溶液，稀釋至50 mL，采用硫酸-苯酚法測定其多糖含量（D490 nm），根據標準曲線計算山芝麻多糖提取率。剩余的提取液于55 ℃減壓蒸餾至原體積的1/8～1/10，在濃縮液中加入4倍體積的無水乙醇（最終乙醇體積分數為80%），并于 4 ℃ 下靜置過夜、離心，得到固體沉淀物，加少量水至固體沉淀物完全溶解，冷凍干燥得山芝麻粗多糖。多糖的提取率（Y）按式（1）計算：

Y=（D490 nm-0.170 3）×50V/（m×0.843 5）×100%。[JY]（1）

式中：Y為多糖的提取率，%；V為提取液體積，mL；m為山芝麻原料的質量，g。

1.3.4α-葡萄糖苷酶的抑制率測定量取1 mL多糖樣品溶液于試管中，加入2 mL 67 mmol/L pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液，再加入0.1 mL 1 μ/mL α-葡萄糖苷酶，混勻后于 37 ℃ 溫孵10 min；然后加入0.1 mL 3 mmol/L谷胱甘肽溶液，再加入0.25 mL 10 mmol/L 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷起始反應。該反應于37 ℃進行20 min，加入2 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應，用紫外分光光度計測定400 nm處的吸光度D400 nm[19]。試驗分組設計見表1。

[JZ（]Y=[SX（]（D0-DC2）-（Di-DC1）（D0-DC2）[SX）]×100%。[JZ）][JY]（2）

1.3.5山芝麻多糖紫外光譜分析將山芝麻多糖樣品充分溶解于超純水中，離心后取上清液，用紫外可見分光光度計掃描其水溶液在200～400 nm范圍內的吸收光譜。

1.3.6山芝麻多糖紅外光譜分析將干燥的山芝麻多糖與溴化鉀（KBr）混合研磨后壓片，采用紅外光譜檢測器在 4 000～400 cm-1范圍內進行掃描。

1.3.7單因素試驗分別稱取10 g山芝麻粉，按液料比 15 mL ∶[KG-*3]1 g、20 mL ∶[KG-*3]1 g、25 mL ∶[KG-*3]1 g、30 mL ∶[KG-*3]1 g、35 mL ∶[KG-*3]1 g、40 mL ∶[KG-*3]1 g加入蒸餾水，70 ℃超聲40 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測量提取液體積。

分別稱取10 g山芝麻粉，液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g，在70 ℃環境下超聲，時間分別為25、30、35、40、45、50 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測量提取液的體積。

分別稱取10 g山芝麻粉，液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g，分別在50、60、70、80、90、100 ℃超聲40 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測定提取液的體積。

以上試驗結束后，均取1 mL粗多糖溶液稀釋至50 mL，采用硫酸-苯酚法測定其多糖含量，并計算多糖提取率。

1.3.8響應面試驗綜合單因素試驗結果，根據 Box-Benhnken 的中心組合試驗設計原理[20]，采用響應面法在3因素3水平上對山芝麻多糖的提取條件進行優化。試驗因素和水平見表2。

2結果與分析

2.1單因素試驗中各因素對多糖提取率的影響

由圖1-a可知，當液料比從15 mL ∶[KG-*3]1g增加到30 mL ∶[KG-*3]1 g時，多糖提取率明顯提高。原因是隨著溶劑的增加，液固間質量濃度差增加，傳質推動力加大，傳質速率和提取率也相應提高[21]。當液料比達到30 mL ∶[KG-*3]1 g時，多糖的擴散達到極點，多糖提取率達到7.334%，這與郭希娟等超聲提取南瓜多糖的工藝研究中的最佳液料比34 mL ∶[KG-*3]1 g接近[22]。隨著液料比進一步提高到40 mL ∶[KG-*3]1 g，多糖提取率略有下降，這是由于固體內部存在傳質極限，達到極限時即使增加溶劑，傳質推動力也不會加大，且溶劑對超聲有吸收損耗，降低了超聲對細胞壁的破損[23]。考慮到浸提液在后續工序中需要濃縮，從節約原料角度考慮選擇液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g。

由圖1-b可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率在 40 min 前增加較為明顯，40 min后多糖提取率略有下降。超聲的機械作用及空化效應加快了分子運動，使山芝麻細胞壁被破壞，加快溶質溶出，而超聲時間過短，超聲效應不明顯，多糖提取率也較低[24]。在40 min多糖提取率達到極點，達到 7.502%，這與諸愛士等用超聲提取海菜多糖工藝研究中的最佳提取時間45 min接近[25]。超聲時間超過40 min時，提取出的山芝麻多糖會在超聲作用下斷鍵，使多糖提取率有所降低[26]。為減少能耗，節省時間，本研究選擇提取時間為 40 min。

由圖1-c可知，在80 ℃之前，隨溫度的升高，多糖提取率不斷提高。原因是隨著溫度的升高，分子運動加快，使得溶劑交換速度增加，從而提高多糖提取率[27]。在80 ℃時，提取率達到最大值，這與劉巋等超聲輔助提取大蒜多糖工藝研究中的最佳提取溫度85 ℃接近[28]。溫度超過80 ℃時，山芝麻多糖提取率緩慢下降，可能是由于溫度過高，多糖會斷鍵，使提取率降低[29]。因此，本研究選擇提取溫度為80 ℃。

2.2響應面試驗結果與分析

2.2.1回歸方程建立與回歸模型分析響應面試驗設計及試驗結果匯總如表3所示。在單因素試驗結果基礎上，以液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）為自變量，以多糖提取率Y為響應值，采用Design-Expert 8.0程序對所得數據進行非線性回歸，獲得二次多項式回歸模型，去掉不顯著項，其回歸模型可以簡化為

對模型系數顯著性分析可知，A、C、A2、C2對山芝麻多糖提取率的影響是極顯著的，B、B2對山芝麻多糖提取率的影響是顯著的。因素的F值可以判定因素對響應值的顯著性，F值越大，表明該因素對山芝麻多糖提取率的影響越顯著。一次項中各因素對山芝麻多糖提取率影響的顯著性大小順序為料液比（A）>提取溫度（C）>提取時間（B）。

2.2.2響應面試驗中雙因素交互作用影響圖2-a～圖2-f分別直觀地給出了各個因子交互作用的響應面和等高線。等高線的形狀可反映交互效應的強弱，橢圓形表示2個因素交互作用較強，而圓形則反之[30]。山芝麻多糖提取率隨液料比增加先升高后略降低，這是由于溶劑的增加使傳質推動力增加，而達到傳質極限時，傳質推動力不再增加且細胞壁破損程度減弱。山芝麻多糖提取率隨提取時間先快速升高后趨于平緩，原因是超聲可以加快溶質從細胞內到溶劑的擴散和滲透過程，而山芝麻中的多糖含量是固定的，40 min后山芝麻多糖提取率趨于平緩。從圖2也可以看出，提高溫度可提高山芝麻多糖提取率，但溫度超過80 ℃時，山芝麻多糖提取率呈下降趨勢。因為提高溫度可以加快分子運動，加快溶質擴散到溶劑中，而過高的溫度則會使多糖鍵斷裂，影響提取率。

2.3最佳工藝驗證試驗

經過Design-Expert設計得到山芝麻多糖提取的最佳條件：液料比32.64 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時間41.86 min、提取溫度 83.05 ℃，在此條件下的山芝麻多糖提取率達7.897%。考慮到實際操作的可行性，將提取條件修正為液料比32 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時間42 min、提取溫度83 ℃，在此條件下進行3次重復試驗，得到的山芝麻多糖平均提取率為7.676%，驗證性試驗與設計試驗的結果誤差為1.67%，表明該模型是可行的。

2.4山芝麻多糖紫外譜圖分析

從圖3可以看出，在200～400 nm范圍內，曲線整體呈下降趨勢，符合多糖特征；在280 nm處有弱吸收峰，表明含有少量的蛋白質[31]。

2.5山芝麻多糖紅外譜

從圖4可以看出，3 412 cm-1處有強寬峰，可能為山芝麻多糖主要官能團O—H伸縮振動引起；2 926 cm-1的峰由糖類中的甲基C—H對稱和非對稱伸縮振動引起；1 621cm-1處為 C[FY=，1]O 振動吸收峰；1 329cm-1為C—H彎曲振動吸收峰；1 258 cm-1 為C—H變角振動吸收峰；1 046 cm-1附近存在吡喃型糖環，這些均為糖的特征吸收峰[32]。

2.6山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性

阿卡波糖是市面上較為常見的治療糖尿病的口服藥物，其治療原理是抑制小腸內的α-葡萄糖苷酶，從而抑制多糖

降解，減緩糖的吸收。以阿卡波糖作為對照，分別以阿卡波糖片、山芝麻多糖濃度為橫坐標，對應的抑制率為縱坐標，繪制柱形圖。

可以看出，當濃度≥30 μg/mL時，同濃度山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制率高于阿卡波糖片，表明山芝麻多糖有一定的降糖潛力。

3結論

在單因素試驗的基礎上，將響應面法應用于優化山芝麻多糖的提取。結果表明，液料比、提取時間、液料比的平方項和提取時間的平方項對多糖提取率的影響顯著或極顯著，一次項中各因素的顯著性大小依次為液料比（A）>提取溫度（C）>提取時間（B）。得到多糖提取的最佳條件：液料比 32 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時間42 min、提取溫度83 ℃，多糖的實際提取率為 7.676%。所得試驗數據為山芝麻多糖提取工藝放大提供了參考。

對山芝麻多糖的紫外譜圖、紅外譜圖分析可得，提取的山芝麻多糖含有少量的蛋白質，主要官能團有O—H、糖類中的甲基的C—H、C[FY=，1]O、吡喃型糖環。比較同濃度下的阿卡波糖片和山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶抑制率可知，當濃度≥ 30 μg/mL 時，山芝麻多糖對α-葡萄糖苷酶有更高的抑制率。綜上所述，超聲輔助法提取山芝麻多糖是可行的，且提取的山芝麻多糖具有明顯的降糖功效，研究結果可為進一步開發降糖食品和藥品奠定基礎。

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