山芝麻多糖的超聲輔助提取工藝優(yōu)化及對(duì)α—葡萄糖苷酶的抑制活性

劉錢薇++葛小東+張錢+程德林+許偉+邵榮+云志

摘要：以山芝麻粉為原料，以蒸餾水為提取劑，以多糖提取率為考察指標(biāo)，采用超聲輔助法提取山芝麻多糖。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化山芝麻多糖提取的工藝條件，并考察山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。結(jié)果表明，最佳工藝條件為提取時(shí)間42 min、提取溫度83 ℃、液料比32 mL ∶[KG-*3]1 g，在此最優(yōu)條件下，山芝麻多糖的提取率達(dá)到7.676%。山芝麻多糖的紫外、紅外譜圖分析可知，主要官能團(tuán)有O—H鍵、糖類中甲基的C—H對(duì)稱和非對(duì)稱鍵、C[FY=，1]O鍵和吡喃型糖環(huán)。比較同濃度下阿卡波糖片和山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度大于30 μg/mL時(shí)，山芝麻多糖的抑制率高于阿卡波糖片。綜合分析可知，山芝麻多糖有明顯的降血糖功效，研究結(jié)果可為山芝麻降糖產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：山芝麻多糖；提取；響應(yīng)面法；α-葡萄糖苷酶

中圖分類號(hào)： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0183-05

山芝麻（Helicteres angustifolia L.）為梧桐科植物，其味苦、性寒，可解表清熱、解毒消腫。山芝麻始載于《生草藥性備要》[1]，是民間常用的中草藥。國(guó)內(nèi)目前對(duì)山芝麻的研究主要著眼于抗炎、抗病毒[2]。潘英采用山芝麻、地膽草等制成復(fù)方感冒顆粒，用于治療感冒[3]；郭宏炳等采用崗梅、水楊梅和山芝麻制成復(fù)方崗梅沖劑，用于急性咽喉炎的治療[4]；黃權(quán)芳等采用血清藥理學(xué)方法，在乙型肝炎病毒（HBV）的體外細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)中進(jìn)行山芝麻抗HBV作用觀察[5]。日本筑波大學(xué)張振亞等發(fā)現(xiàn)，山芝麻的水提物和醇提物具有降血糖、抗腫瘤的功效[6-9]。山芝麻作為一種中藥材，在總體藥效方面得到了廣泛的認(rèn)可，但對(duì)于其有效活性成分的提取分離研究還不夠深入。近年來(lái)研究表明，部分天然植物多糖具有降血糖[10]、降血脂[11]、抗氧化[12]、抗凝血[13]、抗衰老[14]、增強(qiáng)免疫[15]等多重功效，使其成為科研人員關(guān)注的重點(diǎn)。

超聲波法提取多糖具有分散破壞植物組織、加快溶劑萃取、縮短浸提時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)，既彌補(bǔ)了傳統(tǒng)水提法的高能耗、低提取率的缺點(diǎn)，也避免了酶提法的耗時(shí)和超臨界萃取法對(duì)設(shè)備的高要求[16]。本研究采用超聲輔助法提取山芝麻多糖，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，同時(shí)比較同濃度山芝麻多糖、阿卡波糖片對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率。

1材料與方法

1.1材料

試驗(yàn)原料為山芝麻根。

試驗(yàn)試劑：無(wú)水葡萄糖、濃硫酸、苯酚、無(wú)水乙醇、無(wú)水碳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷、谷胱甘肽、溴化鉀，購(gòu)自國(guó)藥科技有限公司；α-葡萄糖苷酶，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖片，購(gòu)自德國(guó)拜耳公司。以上試劑均為分析純。

1.2主要儀器設(shè)備

主要儀器與設(shè)備：XO-SM50超聲微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐生物科技有限公司；TGLL-18K高速冷凍離心機(jī)，太倉(cāng)市華美生化儀器廠；EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，埃朗科技國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；FD-1A-5D冷凍干燥箱，北京博醫(yī)康醫(yī)療有限公司；IRTracer-100傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；UV2310Ⅱ紫外可見(jiàn)分光光度儀，上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1原料預(yù)處理將山芝麻根洗凈，于50 ℃烘干、粉碎，過(guò)100目篩，再將粉末于95%乙醇中浸泡48 h，去除其中的雜質(zhì)，于50 ℃烘干備用。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制稱取適量經(jīng)過(guò)105 ℃干燥的無(wú)水葡萄糖，加蒸餾水配成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精確量取葡萄糖對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL于8支試管中，分別加蒸餾水至總體積為2.0 mL，另加2.0 mL蒸餾水于1支試管中作為空白對(duì)照。采用改良的硫酸-苯酚法[17-18]，在490 nm處測(cè)吸光度，以稀釋的葡萄糖標(biāo)樣濃度C（mg/mL）為橫坐標(biāo)，以D490 nm為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：D490 nm=0.843 5C+0.170 3，r2=0.993。

1.3.3山芝麻多糖提取及其多糖含量測(cè)定精確稱取10 g山芝麻根粉末（經(jīng)“1.3.1”節(jié)方法處理），在不同提取溫度、時(shí)間、料液比條件下提取山芝麻多糖，對(duì)提取液進(jìn)行離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測(cè)定提取液的體積；取 1 mL 粗多糖溶液，稀釋至50 mL，采用硫酸-苯酚法測(cè)定其多糖含量（D490 nm），根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算山芝麻多糖提取率。剩余的提取液于55 ℃減壓蒸餾至原體積的1/8～1/10，在濃縮液中加入4倍體積的無(wú)水乙醇（最終乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%），并于 4 ℃ 下靜置過(guò)夜、離心，得到固體沉淀物，加少量水至固體沉淀物完全溶解，冷凍干燥得山芝麻粗多糖。多糖的提取率（Y）按式（1）計(jì)算：

Y=（D490 nm-0.170 3）×50V/（m×0.843 5）×100%。[JY]（1）

式中：Y為多糖的提取率，%；V為提取液體積，mL；m為山芝麻原料的質(zhì)量，g。

1.3.4α-葡萄糖苷酶的抑制率測(cè)定量取1 mL多糖樣品溶液于試管中，加入2 mL 67 mmol/L pH值6.8的磷酸鹽緩沖溶液，再加入0.1 mL 1 μ/mL α-葡萄糖苷酶，混勻后于 37 ℃ 溫孵10 min；然后加入0.1 mL 3 mmol/L谷胱甘肽溶液，再加入0.25 mL 10 mmol/L 4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷起始反應(yīng)。該反應(yīng)于37 ℃進(jìn)行20 min，加入2 mL 0.1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定400 nm處的吸光度D400 nm[19]。試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

[JZ（]Y=[SX（]（D0-DC2）-（Di-DC1）（D0-DC2）[SX）]×100%。[JZ）][JY]（2）

1.3.5山芝麻多糖紫外光譜分析將山芝麻多糖樣品充分溶解于超純水中，離心后取上清液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描其水溶液在200～400 nm范圍內(nèi)的吸收光譜。

1.3.6山芝麻多糖紅外光譜分析將干燥的山芝麻多糖與溴化鉀（KBr）混合研磨后壓片，采用紅外光譜檢測(cè)器在 4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.7單因素試驗(yàn)分別稱取10 g山芝麻粉，按液料比 15 mL ∶[KG-*3]1 g、20 mL ∶[KG-*3]1 g、25 mL ∶[KG-*3]1 g、30 mL ∶[KG-*3]1 g、35 mL ∶[KG-*3]1 g、40 mL ∶[KG-*3]1 g加入蒸餾水，70 ℃超聲40 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測(cè)量提取液體積。

分別稱取10 g山芝麻粉，液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g，在70 ℃環(huán)境下超聲，時(shí)間分別為25、30、35、40、45、50 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測(cè)量提取液的體積。

分別稱取10 g山芝麻粉，液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g，分別在50、60、70、80、90、100 ℃超聲40 min，離心（8 000 r/min，15 min），取上清液，測(cè)定提取液的體積。

以上試驗(yàn)結(jié)束后，均取1 mL粗多糖溶液稀釋至50 mL，采用硫酸-苯酚法測(cè)定其多糖含量，并計(jì)算多糖提取率。

1.3.8響應(yīng)面試驗(yàn)綜合單因素試驗(yàn)結(jié)果，根據(jù) Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[20]，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)山芝麻多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因素和水平見(jiàn)表2。

2結(jié)果與分析

2.1單因素試驗(yàn)中各因素對(duì)多糖提取率的影響

由圖1-a可知，當(dāng)液料比從15 mL ∶[KG-*3]1g增加到30 mL ∶[KG-*3]1 g時(shí)，多糖提取率明顯提高。原因是隨著溶劑的增加，液固間質(zhì)量濃度差增加，傳質(zhì)推動(dòng)力加大，傳質(zhì)速率和提取率也相應(yīng)提高[21]。當(dāng)液料比達(dá)到30 mL ∶[KG-*3]1 g時(shí)，多糖的擴(kuò)散達(dá)到極點(diǎn)，多糖提取率達(dá)到7.334%，這與郭希娟等超聲提取南瓜多糖的工藝研究中的最佳液料比34 mL ∶[KG-*3]1 g接近[22]。隨著液料比進(jìn)一步提高到40 mL ∶[KG-*3]1 g，多糖提取率略有下降，這是由于固體內(nèi)部存在傳質(zhì)極限，達(dá)到極限時(shí)即使增加溶劑，傳質(zhì)推動(dòng)力也不會(huì)加大，且溶劑對(duì)超聲有吸收損耗，降低了超聲對(duì)細(xì)胞壁的破損[23]。考慮到浸提液在后續(xù)工序中需要濃縮，從節(jié)約原料角度考慮選擇液料比為30 mL ∶[KG-*3]1 g。

由圖1-b可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率在 40 min 前增加較為明顯，40 min后多糖提取率略有下降。超聲的機(jī)械作用及空化效應(yīng)加快了分子運(yùn)動(dòng)，使山芝麻細(xì)胞壁被破壞，加快溶質(zhì)溶出，而超聲時(shí)間過(guò)短，超聲效應(yīng)不明顯，多糖提取率也較低[24]。在40 min多糖提取率達(dá)到極點(diǎn)，達(dá)到 7.502%，這與諸愛(ài)士等用超聲提取海菜多糖工藝研究中的最佳提取時(shí)間45 min接近[25]。超聲時(shí)間超過(guò)40 min時(shí)，提取出的山芝麻多糖會(huì)在超聲作用下斷鍵，使多糖提取率有所降低[26]。為減少能耗，節(jié)省時(shí)間，本研究選擇提取時(shí)間為 40 min。

由圖1-c可知，在80 ℃之前，隨溫度的升高，多糖提取率不斷提高。原因是隨著溫度的升高，分子運(yùn)動(dòng)加快，使得溶劑交換速度增加，從而提高多糖提取率[27]。在80 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最大值，這與劉巋等超聲輔助提取大蒜多糖工藝研究中的最佳提取溫度85 ℃接近[28]。溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，山芝麻多糖提取率緩慢下降，可能是由于溫度過(guò)高，多糖會(huì)斷鍵，使提取率降低[29]。因此，本研究選擇提取溫度為80 ℃。

2.2響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1回歸方程建立與回歸模型分析響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果匯總?cè)绫?所示。在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以液料比（A）、提取時(shí)間（B）、提取溫度（C）為自變量，以多糖提取率Y為響應(yīng)值，采用Design-Expert 8.0程序?qū)λ脭?shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸，獲得二次多項(xiàng)式回歸模型，去掉不顯著項(xiàng)，其回歸模型可以簡(jiǎn)化為

對(duì)模型系數(shù)顯著性分析可知，A、C、A2、C2對(duì)山芝麻多糖提取率的影響是極顯著的，B、B2對(duì)山芝麻多糖提取率的影響是顯著的。因素的F值可以判定因素對(duì)響應(yīng)值的顯著性，F(xiàn)值越大，表明該因素對(duì)山芝麻多糖提取率的影響越顯著。一次項(xiàng)中各因素對(duì)山芝麻多糖提取率影響的顯著性大小順序?yàn)榱弦罕龋ˋ）>提取溫度（C）>提取時(shí)間（B）。

2.2.2響應(yīng)面試驗(yàn)中雙因素交互作用影響圖2-a～圖2-f分別直觀地給出了各個(gè)因子交互作用的響應(yīng)面和等高線。等高線的形狀可反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示2個(gè)因素交互作用較強(qiáng)，而圓形則反之[30]。山芝麻多糖提取率隨液料比增加先升高后略降低，這是由于溶劑的增加使傳質(zhì)推動(dòng)力增加，而達(dá)到傳質(zhì)極限時(shí)，傳質(zhì)推動(dòng)力不再增加且細(xì)胞壁破損程度減弱。山芝麻多糖提取率隨提取時(shí)間先快速升高后趨于平緩，原因是超聲可以加快溶質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)到溶劑的擴(kuò)散和滲透過(guò)程，而山芝麻中的多糖含量是固定的，40 min后山芝麻多糖提取率趨于平緩。從圖2也可以看出，提高溫度可提高山芝麻多糖提取率，但溫度超過(guò)80 ℃時(shí)，山芝麻多糖提取率呈下降趨勢(shì)。因?yàn)樘岣邷囟瓤梢约涌旆肿舆\(yùn)動(dòng)，加快溶質(zhì)擴(kuò)散到溶劑中，而過(guò)高的溫度則會(huì)使多糖鍵斷裂，影響提取率。

2.3最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)Design-Expert設(shè)計(jì)得到山芝麻多糖提取的最佳條件：液料比32.64 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間41.86 min、提取溫度 83.05 ℃，在此條件下的山芝麻多糖提取率達(dá)7.897%。考慮到實(shí)際操作的可行性，將提取條件修正為液料比32 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間42 min、提取溫度83 ℃，在此條件下進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，得到的山芝麻多糖平均提取率為7.676%，驗(yàn)證性試驗(yàn)與設(shè)計(jì)試驗(yàn)的結(jié)果誤差為1.67%，表明該模型是可行的。

2.4山芝麻多糖紫外譜圖分析

從圖3可以看出，在200～400 nm范圍內(nèi)，曲線整體呈下降趨勢(shì)，符合多糖特征；在280 nm處有弱吸收峰，表明含有少量的蛋白質(zhì)[31]。

2.5山芝麻多糖紅外譜

從圖4可以看出，3 412 cm-1處有強(qiáng)寬峰，可能為山芝麻多糖主要官能團(tuán)O—H伸縮振動(dòng)引起；2 926 cm-1的峰由糖類中的甲基C—H對(duì)稱和非對(duì)稱伸縮振動(dòng)引起；1 621cm-1處為 C[FY=，1]O 振動(dòng)吸收峰；1 329cm-1為C—H彎曲振動(dòng)吸收峰；1 258 cm-1 為C—H變角振動(dòng)吸收峰；1 046 cm-1附近存在吡喃型糖環(huán)，這些均為糖的特征吸收峰[32]。

2.6山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性

阿卡波糖是市面上較為常見(jiàn)的治療糖尿病的口服藥物，其治療原理是抑制小腸內(nèi)的α-葡萄糖苷酶，從而抑制多糖

降解，減緩糖的吸收。以阿卡波糖作為對(duì)照，分別以阿卡波糖片、山芝麻多糖濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的抑制率為縱坐標(biāo)，繪制柱形圖。

可以看出，當(dāng)濃度≥30 μg/mL時(shí)，同濃度山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率高于阿卡波糖片，表明山芝麻多糖有一定的降糖潛力。

3結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，將響應(yīng)面法應(yīng)用于優(yōu)化山芝麻多糖的提取。結(jié)果表明，液料比、提取時(shí)間、液料比的平方項(xiàng)和提取時(shí)間的平方項(xiàng)對(duì)多糖提取率的影響顯著或極顯著，一次項(xiàng)中各因素的顯著性大小依次為液料比（A）>提取溫度（C）>提取時(shí)間（B）。得到多糖提取的最佳條件：液料比 32 mL ∶[KG-*3]1 g、提取時(shí)間42 min、提取溫度83 ℃，多糖的實(shí)際提取率為 7.676%。所得試驗(yàn)數(shù)據(jù)為山芝麻多糖提取工藝放大提供了參考。

對(duì)山芝麻多糖的紫外譜圖、紅外譜圖分析可得，提取的山芝麻多糖含有少量的蛋白質(zhì)，主要官能團(tuán)有O—H、糖類中的甲基的C—H、C[FY=，1]O、吡喃型糖環(huán)。比較同濃度下的阿卡波糖片和山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率可知，當(dāng)濃度≥ 30 μg/mL 時(shí)，山芝麻多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶有更高的抑制率。綜上所述，超聲輔助法提取山芝麻多糖是可行的，且提取的山芝麻多糖具有明顯的降糖功效，研究結(jié)果可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)降糖食品和藥品奠定基礎(chǔ)。

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