Rab11-FIP4對結腸癌細胞生物學特性的影響

楊守醒，俞耀軍，王建嶂，鄭波，薛戰雄，徐昌隆

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.消化內科；2.胃腸外科）

Rab11-FIP4對結腸癌細胞生物學特性的影響

楊守醒1，俞耀軍2，王建嶂1，鄭波1，薛戰雄1，徐昌隆1

（溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院，浙江 溫州 325027，1.消化內科；2.胃腸外科）

目的:探討Rab11-FIP4的表達變化對結腸癌細胞生物學特性的影響。方法:采用結腸癌細胞株HCT116轉染Rab11-FIP4特異性siRNA干擾Rab11-FIP4表達。用Western blot實驗檢測干擾效率。運用CCK-8實驗和Transwell實驗分別檢測干擾Rab11-FIP4對結腸癌細胞株HCT116增殖和運動能力的影響。結果:siRNA轉染使Rab11-FIP4表達量從100.2±21.5降低至23.5±5.8，差異有統計學意義（P＜0.01）。干擾Rab11-FIP4后結腸癌細胞株HCT116的體外增殖明顯下降，第2天的抑制率為29.40%，差異無統計學意義（P＜0.05），第3天的抑制率為37.65%，差異有統計學意義（P＜0.05），結腸癌細胞的遷移數從193.4±22.1降至113.9± 12.7，差異有統計學意義（P＜0.05），細胞侵襲數從113.3±16.7降至66.5±6.7，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論:干擾Rab11-FIP4的表達能抑制結腸癌細胞的體外增殖、遷移和侵襲能力，Rab11-FIP4可能在結腸癌的進展中發揮重要作用。

Rab11-FIP4；結腸腫瘤；RNA，小分子干擾；細胞增殖；細胞運動；腫瘤侵潤

Rab11-FIP4（Rab11-family interacting protein 4）是小G蛋白Rab11相互作用蛋白家族（Rab11 family interacting proteins，Rab11-FIPs）中的一員，其C末端含有一個同源的Rab11結合區（Rab11 binding domain，RBD），屬于第二類Rab11-FIPs亞家族[1]。Rab11-FIP4主要定位于細胞內的再循環內體、高爾基體反面網狀結構，其與Rab11結合后參與調控胞內囊泡運輸和胞質的分裂過程。近期有研究顯示，Rab11-FIP4可通過調控mTOR/PRAS40信號通路影響細胞性肝癌的進展[2]。但迄今關于Rab11-FIP4在結腸癌中的表達及其作用尚未見報道。

本研究檢測結腸癌細胞株HCT116中Rab11-FIP4的表達，隨后轉染Rab11-FIP4特異性siRNA干擾其表達，檢測干擾效率，并運用Cell counting kit-8（CCK-8）實驗和Transwell實驗分別檢測干擾后對結腸癌細胞株HCT116增殖、遷移和侵襲能力的影響，以探討Rab11-FIP4在結腸癌中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 結腸癌細胞株HCT116購自中國科學院細胞庫，高糖DMEM（Dulbecco’s modified eagle’s medium）培養基購自美國Gibco公司，胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司，siRNAs購自上海拓然生物公司，CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司，Transwell小室購自美國BD Biosciences公司，Matrigel基質膠購自美國BD Biosciences公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養:結腸癌細胞株HCT116用含10% FBS、100 ng/mL鏈霉素、100 U/mL青霉素的DMEM培養液于5% CO2和37 ℃條件下培養，細胞生長至80%～90%融合度時進行傳代。

1.2.2 Western blot實驗:生長狀態良好的細胞加入細胞裂解液，置冰上裂解細胞，用細胞刮刀收集細胞裂解液，4 ℃ 12 000 r/min離心后收集上清備用。配制SDS-聚丙烯酰胺分離膠，各泳道加入等量蛋白樣品，用Electrophoresis power supply（Bio-Rad）電泳儀進行電泳。蛋白轉膜后，將轉印有蛋白質的硝酸纖維素濾膜在適量的封閉液中室溫封閉。一抗雜交液4 ℃孵育過夜。次日用含0.02% Tween-20的PBS室溫漂洗濾膜，加入以封閉液配制的辣根過氧化物酶（HRP）標記的相應二抗的雜交液，室溫下在平穩搖床上孵育。使用SuperSignal West Pico化學發光試劑盒進行檢測。

1.2.3 siRNA轉染實驗:轉染前1 d，接種適當數量的細胞至6孔板中，每孔中加入不含抗生素的培養基。siRNA轉染干擾Rab11-FIP4為實驗組，未進行siRNA轉染為對照組。siRNA轉染實驗步驟如下:①用200 μL不含FBS培養基Opti-MEM稀釋5 μL的siRNA儲存液（20 mmol/L），輕輕混勻，室溫孵育5 min；②用200 μL不含FBS培養基Opti-MEM稀釋5 μL lipo2000，輕輕混勻并室溫孵育5 min；③將兩者輕輕混勻，室溫孵育20 min；④將siRNA-lipo2000混合液加入細胞密度為30%～50%的6孔板內，同時加入400 μL無FBS培養基，輕輕混勻；⑤培養約6 h后，棄去孔內含siRNA-lipo2000混合液的培養基；⑥更換完全培養基，將6孔板置于37 ℃的CO2培養箱中培養；⑦轉染完成后48～72 h進行siRNA沉默效果檢測和細胞功能檢測。

1.2.4 CCK-8實驗:96孔板每孔種植4 000個細胞，培養0、24、48、72 h后每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，檢測450 nm波長吸收值。分別對實驗組和對照組進行檢測。

1.2.5 Transwell實驗:①細胞遷移實驗:Transwell內室接種200 μL細胞懸液（含50 000個細胞），每個Transwell外室中加800 μL含20%～30% FBS的DMEM培養基，37 ℃培養24～48 h。取出小室后，棄去內室的殘余培養基，并用棉簽擦凈內室濾膜上的細胞，用含0.1%結晶紫和20%甲醇的PBS對小室染色30 min。用棉簽擦凈小室內表面和濾膜，倒置顯微鏡下觀察小室濾膜上的細胞并計數（200×倍鏡下隨機選擇5個視野并計數），同類實驗至少重復3次。②細胞侵襲實驗:提前將貯存于-20 ℃的Matrigel基質膠置于4 ℃解凍，當其由凝固狀態變為液態時，用預冷的無血清DMEM將Matrigel基質膠按1：6比例混合置于冰上備用；取80 μL稀釋好的Matrigel基質膠均勻鋪在Transwell小室內膜上，37 ℃放置約4 h，確保去凝成膠體。其余實驗過程同細胞遷移實驗。以上實驗分別對實驗組和對照組進行檢測。

1.3 統計學處理方法 應用SPSS12.0軟件進行統計學分析。所有計量資料用±s表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 siRNA轉染后Rab11-FIP4的表達情況 Western blot結果顯示，實驗組siRNA轉染后Rab11-FIP4的產物條帶灰度明顯低于對照組，Rab11-FIP4表達從100.2±21.5降低至23.5±5.8，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖1。

2.2 干擾Rab11-FIP4抑制結腸癌細胞的體外增殖能力 CCK-8實驗顯示，干擾Rab11-FIP4的表達后，結腸癌細胞株HCT116的體外增殖明顯下降，第2天的抑制率為29.40%，差異無統計學意義（P＞0.05），第3天的抑制率為37.65%，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 干擾Rab11-FIP4抑制結腸癌細胞的體外遷移和侵襲能力 細胞遷移實驗結果顯示，干擾Rab11-FIP4后，結腸癌細胞的遷移數從193.4±22.1降至113.9±12.7，差異具有統計學意義（P＜0.05），見圖3A。細胞侵襲實驗結果顯示，干擾Rab11-FIP4后細胞侵襲數從113.3±16.7降至66.5±6.7，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖1 Western blot檢測siRNA轉染后Rab11-FIP4的表達變化

圖2 CCK-8實驗分析細胞增殖變化

3 討論

圖3 Transwell實驗檢測干擾Rab11-FIP4后細胞遷移和侵襲能力的變化（×200）

癌基因的表達上調或抑癌基因的缺失是驅動腫瘤侵襲和遠端轉移的關鍵因素，而在絕大多數類型的腫瘤（包括結腸癌）中轉移是導致腫瘤相關死亡的主要原因[3]。由于轉移的存在，手術切除和藥物治療后結腸癌患者的存活率依然很低[4]。迄今，參與調控結腸癌轉移過程的關鍵機制尚未闡明。有研究顯示，過表達Rab11-FIP4可以促進肝癌細胞的體外運動侵襲能力以及體內的轉移能力[2]。但關于Rab11-FIP4在其他類型實體瘤中是否有同樣的功能尚不清楚。本實驗通過轉染特異靶向性siRNA干擾Rab11-FIP4的表達可顯著抑制結腸癌細胞株HCT116的體外增殖、遷移和侵襲能力，提示Rab11-FIP4在結腸癌的進展中發揮重要作用。

Rab11是Rab小分子GTP酶家族的一個亞家族成員，活化狀態的Rab11與GTP結合，通過識別其效應分子從而執行各種功能。執行完功能后Rab11在GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）的參與下水解GTP進而轉變為無活性的Rab11-GDP[1]。Rab11的生物學功能主要包括調節再循環內體的形成與運輸，調控細胞膜受體和黏附分子的循環再利用過程，如AMPA受體、EGF受體、Toll樣受體4、α5β1整合素、E-cadherin和N-cadherin等[5-7]。Rab11-FIPs蛋白家族成員的特點是它們的C末端含有一個同源的RBD，RBD能夠高度特異地識別Rab11-GTP。有多項研究結果顯示，Rab11-FIPs可以與Rab11相互作用，如FUKUDA等[8]報道Rab14和Rab11-FIP2相互作用，LALL等[9]研究發現所有的Rab11成員均可以與Rab14和I型FIPs（RCP、FIP2和Rip11）相互作用。此外，Rab11-FIP2、Rab11-FIP2以及Rab11可以形成復雜的復合體結構[10-12]。有研究顯示，Rab11-FIP4不僅其C末端含有一個同源的Rab11結合區，其N末端還具有特征性的EF hand和脯氨酸富含區[13]。迄今Rab11-FIP4在結腸癌中的作用是否通過Rab11尚待深入研究。有研究報道，在肝癌中缺氧微環境可以通過HIF1α上調Rab11-FIP4的表達，然后Rab11-FIP4調控mTOR/PRAS40信號通路影響肝細胞肝癌的進展[2]。另有研究報道，Rab11-FIP4不僅能與Rab11直接結合，還可與小分子GTP酶家族的另一成員Arf6/Arf5結合，參與細胞的膜泡運輸過程[14-15]。在結腸癌中，Rab11-FIP4是否也存在類似的調控機制，值得進一步的研究。

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（本文編輯：賈建敏）

The influence of Rab11-FIP4 in cytological characteristics of colorectal cancer

YANG Shouxing1, YU Yaojun2, WANG Jianzhang1, ZHENG Bo1, XUE Zhanxiong1, XU Changlong1.
1.Department of Gastroenterology, the Second Aff liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027; 2.Department of Gastrointestinal Surgery, the Second Aff liated Hospital & Yuying Children’s Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou, 325027

Objective:To investigate the effects of Rab11-FIP4 on cytological characteristics of colorectal cancer (CRC).Methods:Western blot was used to detect the expression of Rab11-FIP4 in CRC cell line HCT116, which was transfected with siRNAs that specifically targeting Rab11-FIP4. Proliferation and migration of HCT116 cells were analyzed by CCK-8 assay and Transwell assay.Results:Rab11-FIP4 by siRNA transfection expressing in 100.2±21.5 reduced to 23.5±5.8 (P＜0.01). Interference Rab11-FIP4, CRC cell line HCT116 in vitro, proliferation decreased obviously, the second day of the inhibition rate was 29.40%, the inhibition rate of 37.65% on the third day (P＜0.05), number of cells migrating from 193.4±22.1 to 113.9±12.7 (P＜0.05) and cell invasion number from 113.3±16.7 to 66.5±6.7 (P＜0.05).Conclusion:Knockdown of Rab11-FIP4 signif cantly inhibits proliferation, migration and invasion of CRC cells in vitro, indicating its important role in CRC progression.

Rab11-FIP4; colonic neoplasms; RNA, small interfering; cell proliferation; cell movement; neoplasm invasiveness

R735.3

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.03.004

2016-11-07

浙江省自然科學基金資助項目（LY16H160055）；溫州市科技計劃項目（Y20150156）。

楊守醒（1992-），男，浙江溫州人，碩士生。

徐昌隆，副主任醫師，副教授，碩士生導師，Email: xchlong@163.com。