生物法合成谷胱甘肽及其分離純化條件研究進展

*何 軼

(成都石室中學(xué)北湖校區(qū) 四川 610000)

生物法合成谷胱甘肽及其分離純化條件研究進展

*何 軼

(成都石室中學(xué)北湖校區(qū) 四川 610000)

谷胱甘肽是細胞內(nèi)重要活性物質(zhì),在維持生物體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面起著重要作用.本文綜述了生物合成法生產(chǎn)谷胱甘肽的條件優(yōu)化策略和分離純化的研究進展,簡單介紹了谷胱甘肽生物合成和分離轉(zhuǎn)化的發(fā)展前景.

谷胱甘肽;合成;分離純化

1.前言

谷胱甘肽的全稱是γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸,(γ-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine,簡稱GSH).其相對分子量為307.33,等電點為5.93.它是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵形成,分子中有一特殊的γ-肽鍵,即由谷氨酸的γ-COOH與半胱氨酸的α-NH2縮合成的肽鍵,它不同于蛋白質(zhì)分子中的普通肽鍵.GSH為白色晶體,易溶于水、低濃度乙醇水溶液、液氨和二甲基甲酰胺.谷胱甘肽是廣泛存在于動植物和微生物中,是生物體內(nèi)最重要的非蛋白巰基化合物之一,是一種具有重要生理功能的天然活性肽.其在體內(nèi)以兩種形態(tài)存在,還原型谷胱甘肽(γ-GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG),還原型谷胱甘肽的基本單元是L-谷氨酸、L-半胱氨酸及甘氨酸.兩分子還原性谷胱甘肽的巰基(-SH)經(jīng)氧化脫氫得到氧化型谷胱甘肽.還原型谷胱甘肽在生物體中存在大量并起主要作用.其較好的抗氧化,清除自由基作用,可以用于藥物.研究表明,發(fā)揮抗氧化等作用的活性位點是谷胱甘肽的巰基(-SH).GSH還在蛋白質(zhì)和DNA合成、物質(zhì)運輸、酶活性、新陳代謝及細胞保護等生物學(xué)功能中起著直接或間接的作用.許多酶反應(yīng)的輔基也是GSH,主要參與生物體三羧酸循環(huán)及糖代謝.具有良好的解重金屬毒性、預(yù)防糖尿病、消除疲勞或抗癌作用.GSH可抑制肉食類、魚類和海鮮類食品的核酸分解,延長保鮮期以及提高奶酪質(zhì)量,防止酪蛋白褐變,作為生物和食品活性添加劑及抗氧化劑用于食品及化妝品領(lǐng)域.

目前對于還原性谷胱甘肽的制備方法的研究,主要集中于溶劑提取法、酶合成法、液相合成法和生物發(fā)酵法.溶劑提取法生產(chǎn)工藝比較落后,生產(chǎn)規(guī)模小且產(chǎn)量低,產(chǎn)品質(zhì)量不高.液相合成法反應(yīng)步驟多、反應(yīng)時間長、操作復(fù)雜、需光學(xué)拆分且產(chǎn)品純度不高,環(huán)境污染嚴重.缺點都較明顯,使用較少.酶合成法操作較復(fù)雜且需要底物氨基酸和昂貴的ATP,成本高.目前工業(yè)生產(chǎn)以發(fā)酵法為主,但因其所得的目標(biāo)產(chǎn)物含量不高、提取困難、成本造價高、產(chǎn)率不穩(wěn)定,生產(chǎn)周期長等原因,應(yīng)用也受到限制.成本低,操作簡便,產(chǎn)率較高,純化效果好的合成方法有待進一步發(fā)展.

2.谷胱甘肽的生物合成

鄭麗雪等人開展以葡萄糖和半胱氨酸與葡萄糖協(xié)同作用兩種方式,研究了酵母對分批發(fā)酵谷胱甘肽的影響,發(fā)現(xiàn)GSH分批發(fā)酵48h后生物量GSH產(chǎn)量降低,原因是菌體開始自溶,發(fā)酵液中菌體濃度下降.同時GSH易被氧化,所以其濃度也隨之小幅下降,所以在高密度發(fā)酵中,加入適量葡萄糖對GSH積累很重要,發(fā)酵直至24h,GSH產(chǎn)量直線上升,總量提高37%,但L-半胱氨酸添加有待優(yōu)化,因此在補料分批發(fā)酵中采用恒定PH分批發(fā)酵來提高GSH產(chǎn)量有較大發(fā)展空間.

丁橘等開展了在少量可供應(yīng)ATP的南極硅藻GJ01細胞存在下,對其游離谷胱甘肽合成酶合成谷胱甘肽的條件進行優(yōu)化,主要對溫度、pH、濃度、前體氨基酸和鎂離子濃度對其合成能力進行探究.鎂離子對谷胱甘肽合成酶有激活作用,對ATP產(chǎn)生也有影響,所以提供少量鎂離子有利于谷胱甘肽的產(chǎn)生.而南極硅藻GJ01的谷胱甘肽的合成酶屬于低溫酶,在溫度較低情況下也能合成生命所需的谷胱甘肽,這將大大減少工業(yè)生產(chǎn)中能耗,這對于未來酶法生產(chǎn)谷胱甘肽具有指導(dǎo)意義.

張亮等對酶法合成谷胱甘肽進行了優(yōu)化并通過DTNB法檢測.主要對溫度、pH、反應(yīng)時間和ATP濃度進行了討論.從實驗可以看出反應(yīng)溫度35℃,pH8.0反應(yīng)濃度12.5mmol/L,反應(yīng)時間120min能達到最優(yōu)反應(yīng)結(jié)果,GSH的產(chǎn)量達到最大值為1.78g/L.該探究直觀反映出容變量對GSH產(chǎn)量影響的關(guān)系,并且加入了空白對照,提高了實驗嚴謹性.但美中不足的是缺乏對變量影響結(jié)果的原因的探究.

楊莉等人通過單因素及正交試驗時釀酒酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化,主要討論了葡萄糖濃度,接種量、裝液量、發(fā)酵時濃度、pH對谷胱谷肽合成影響.得出的最佳條件是:初糖濃度20g/L,接種量8%,發(fā)酵時間54h,裝液量50mL/250mL.該實驗展示了具體數(shù)據(jù)并用文字展現(xiàn)了變化趨勢并且對優(yōu)化前后結(jié)果進行了比較.

3.谷胱甘肽的分離純化

離子交換樹脂工業(yè)近幾年在我國迅速發(fā)展,樹脂具有可多次循環(huán)利用,成本低、分離速度快,能工業(yè)化的優(yōu)點,所以對于樹脂材料分離GSH的研究成為熱點.大孔吸附樹脂是上世紀后半葉出現(xiàn)的新型高聚物吸附劑,利用不同孔徑、極性的大孔吸附樹脂,在吸附特性和分子篩作用下,利用不同的樹脂能達到分離純化不同化合物的目的.

張玉然等人通過對D021、201*7、D354、D840、D001、001*7六種樹脂對分離傳化谷胱甘肽的對比,確認D840樹脂吸附容量最高,在pH=4.29時吸附量最大.因為pH=4.29時,GSH整體帶負電荷,更強競爭性,吸附D48樹脂功能基因末端的氨基和亞氨基在pH=2.02時樣液中存在大量的氫離子,影響GSH的吸附,此外使用0.3mL/鹽酸在1mL/min的流速下洗脫效果最好,得到洗脫液回收率72.08%,GSH純度約50.5%.此種樹脂交換容量大,樹脂使用率高,成本低,但樹脂上樣液量較大.最適濃度需進一步探究.分離高純度GSH產(chǎn)品可以在此基礎(chǔ)上進行.

朱義福等人利用大孔吸附樹脂對GSH發(fā)酵抽提液分離純化進行了研究.發(fā)現(xiàn)吸附150min后,吸附達到飽和,處于吸附平衡狀態(tài).當(dāng)GSH濃料液pH=3.0時,吸附容量與吸附率均高于其他pH下大孔吸附樹脂對GSH的吸附.在研究鹽酸、氯化鈉、磷酸平衡緩沖液實驗效果中,發(fā)現(xiàn)磷酸最佳,選用0.2mol/L并以2.00mL/min流速均勻洗脫.最終GSH純度從58.5%提高到95.3%,并且GSH回收率到達87.15%,效果較好.

趙紅玲等以高產(chǎn)菌株發(fā)酵提取液為基礎(chǔ)對兩種陽離子交換樹脂(001*7、HZ-011)、2種大孔強酸性陽離子交換樹脂(D001,HD-81)、一種大孔弱酸性陽離子交換樹脂(D113)進行篩選,并探究了時間pH、GSH濃度對吸附量的影響.可以看出120min能達到吸附平衡.D001吸附容量大,001*7樹脂在PH=3時吸附高,可達到3.57mg/g.GSH濃度提高時,001*7樹脂的吸附量也增加,GSH濃度gt;150mg/L吸附趨于平衡,達到了飽和吸附.但001*7離子交換樹脂動態(tài)分離純化條件優(yōu)化需進一步探究.

邱雁臨等提出了從酵母中分離GSH的新方法,使用適用于分離純化還原型谷胱甘肽的005*7強酸型陽離子交換樹脂,并通過正交試驗對滲透法提取GSH與對羥基苯甲酸丙酯法進行了對比試驗.滲透法操作后處理更加簡便(無需攪拌、絮凝、化學(xué)藥品也僅需加入鹽酸),提取效果好.通過兩種提取液上離子交換柱對比,滲透法收率遠高于對羥基苯甲酸丙酯法,對于未來研究具有啟示意義.雖然005*7型苯酸強酸型陽離子交換樹脂分離純化GSH可行,但其產(chǎn)品純度有待進一步提高.

王碩等人進行對還原型GSH的發(fā)酵與分離添加優(yōu)化詳細討論了多種變量的影響.具有指導(dǎo)意義的發(fā)現(xiàn)在于對樹脂法分離提純GSH進行了優(yōu)化,此前樹脂法特點為條件溫和成本低,但產(chǎn)品純度不高、收率低.本實驗選用碳酸氫銨溶液作為大孔樹脂D001*7的洗脫液,洗脫流速為1.0mL/min使雜蛋白能與GSH有效分離,此外碳酸氫銨分解產(chǎn)生二氧化碳,氨氣和水不會引入新雜質(zhì),洗脫能力強,收率高和純度高為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)GSH提供了理論基礎(chǔ).

[1]段學(xué)輝,謝雷波,王錦.谷胱甘肽的應(yīng)用和酶法生產(chǎn)谷胱甘肽的研究進展[J].江西科學(xué),2005,(23) 6:750-753.

[2]胡圣堯,聶志妍,袁勤生.還原型谷胱甘肽的研究進展[J].食品與藥品,2009, (11)01,69-71.

[3]LI Y, WEI G, CHEN J. Glutathione: a review on biotechnological production [J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,66:233-242.

[4]黎明,池嬌,張波,李學(xué)如.高產(chǎn)谷胱甘肽酵母菌篩選及發(fā)酵條件研究[J].2013, (49)2:9-12.

[5]崔筱琳,王鳳山.谷胱甘肽防治疾病的研究進展[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué),2017, (34)4:631-636.

[6]董永勝,馬蕾,王艷杰.釀酒酵母生產(chǎn)谷胱甘肽合成酶系發(fā)酵條件的研究[J].食品研究與開發(fā),2016,(37)24:152-154.

[7]王瑋瑋,唐亮,周文龍等.谷胱甘肽生物合成及代謝相關(guān)酶的研究進展[J].中國生物工程雜志,2014,34(7):89-95.

[8]鄭麗雪,齊斌,梅艷珍,王立梅.L-Cys與葡萄糖對酵母發(fā)酵合成谷胱甘肽的影響. 食品研究與開發(fā),2011,(32)4:157-159.

[9]丁橘,繆錦來,唐嘯塵,李光友,簡紀常,吳灶.南極硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶法生產(chǎn)谷胱甘肽[J].中國水產(chǎn)科學(xué),2007,(14)5:829-834.

[10]張亮.谷胱甘肽的酶法合成條件優(yōu)化[J].化學(xué)工程與裝備,2016,10:38-41.

[11]楊莉,吳茜,靖潔.釀酒酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)谷胱甘肽培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J].中國調(diào)味品,2014,(39)11:13-16.

[12]張玉然,楊海麟,辛瑜,仝艷軍,張玲,王武.分離谷胱甘肽D840樹脂的篩選研究[J].食品工業(yè)科技,2011,(32)3:146-152.

[13]朱義福.大孔吸附樹脂分離純化谷胱甘肽的工藝研究[J].現(xiàn)代食品科技,2013,(29)7:1641-1644.

[14]趙紅玲,呂逢春.高產(chǎn)谷胱甘肽菌種的選育及發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].承德醫(yī)學(xué)院,2017,(34)1:52-53.

[15]邱雁臨,胡靜,陳靚,孫正博.從酵母中分離純化谷胱甘肽(GSH) 的新方法[J].食品工業(yè)科技,2007,(28)3:134-136.

[16]王碩,謝躍武,張惠文,閻浩林,徐明愷.還原型谷胱甘肽發(fā)酵及分離純化條件的優(yōu)化[J].生物技術(shù)通報,2013,11:180-185.

何軼(2000-),男,成都石室中學(xué)北湖校區(qū);研究方向:化學(xué).

Research Progress of Biosynthesis of Glutathione and lts Purification Conditions

He Yi
(North Lake Campus of Shishi Middle School of Chengdu City, Sichuan, 610000)

Glutathione is an important active substance in cells and plays an important role in maintaining the homeostasis of organisms.In this paper, the optimization strategy of glutathione production and the research progress of separation and purification were reviewed, and the development prospect of glutathione biosynthesis and separation and transformation was briefly introduced.

glutathione;synthesis;separation and purification

O

A