應(yīng)用Cocktail探針?biāo)幬锓ǚ治鲋兴帉YP450酶活性影響的研究進(jìn)展

杜犀+何新+黃宇虹+李自強(qiáng)

[摘要] Cocktail探針?biāo)幬锓ㄗ鳛橐环N快速、準(zhǔn)確、高通量的評價CYP450酶活性的研究方法廣泛應(yīng)用于藥物研發(fā)早期篩選、藥物代謝途徑及機(jī)制研究、藥物相互作用研究、指導(dǎo)臨床合理用藥、上市藥物再評價及協(xié)助肝腎病理研究等諸多領(lǐng)域。該文對Cocktail探針?biāo)幬锓ǖ奶攸c做簡要說明，著重介紹其在中醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用進(jìn)展，從中藥活性成分的代謝機(jī)制研究，炮制過程，方劑配伍對CYP450的影響，揭示中成藥CYP450代謝特點規(guī)律，民族藥學(xué)應(yīng)用情況，中藥保肝作用及中醫(yī)證候模型研究等，并總結(jié)歸納現(xiàn)有研究成果，比較其在中西醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用的異同點，為該領(lǐng)域的深入研究工作提供參考。

[關(guān)鍵詞] Cocktail探針?biāo)幬锓?；?xì)胞色素P450酶；中醫(yī)藥；代謝

[Abstract] Cocktail probe substrates approach is a fast，sensitive and high through put method to determine cytochrome P450 enzymes activity. It has been widely used to screen early drug development，analyze drug metabolism types and confirm the metabolism pathways，study drug-drug interactions，optimize clinical regimen，evaluate post marketing drugs and help liver/kidney pathological studies. This article reviewed characteristics of Cocktail probe substrates，focused on the application to traditional Chinese medicine to CYP450 system as follows： the metabolic pathway research of Chinese herb active ingredients；processing way and compatibility of medical herbs affect CYP450；find out the metabolic characteristic of Chinese patent medicine，study in pharmacy of national minority；do research in liver protective effect of traditional Chinese medicine and evaluate traditional Chinese medicine syndromes in animal models. This article make a summary of existing research results and also make a comparison of cocktail probe substrates approach application to western medicine and Chinese medicine.

[Key words] Cocktail probe substrates approach；cytochrome P450；traditional Chinese medicine；metabolism

doi：10.4268/cjcmm20162410

肝臟細(xì)胞色素 P450（CYP450）是肝臟微粒體混合功能氧化酶系的主要成分，是一組由許多同工酶組成的超基因大家族，具有遺傳多態(tài)性，承擔(dān)著大部分內(nèi)源性、外源性化合物在生物體內(nèi)的Ⅰ相轉(zhuǎn)化作用，對藥理學(xué)和藥物代謝的研究具有重要意義。早在20世紀(jì)90年代初，Breimer等[1]首次提出使用多個探針?biāo)幬锿瑫r評價多種CYP450同工酶活性的方法，即Cocktail探針?biāo)幬锓ǎ和瑫r給予多種相對低劑量的探針?biāo)幬?，?yīng)用現(xiàn)代儀器分析技術(shù)測定生物樣本中各探針?biāo)幬锏拇x率或代謝分型指標(biāo)，以獲取多個CYP450 同工酶表型信息的方法。該法具有高通量、高準(zhǔn)確性、經(jīng)濟(jì)簡便的特點，在藥物研發(fā)早期篩選、藥物代謝途徑及機(jī)制研究、藥物相互作用研究、上市藥物再評價及疾病對CYP450同工酶表型影響、改變藥物代謝特點等領(lǐng)域均有重要應(yīng)用價值?，F(xiàn)本文將對Cocktail探針?biāo)幬锓ǖ奶攸c做簡要說明，將其在中醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的研究進(jìn)展進(jìn)行綜合論述，并對其在中西醫(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)應(yīng)用的異同點進(jìn)行比較說明。

1 Cocktail探針?biāo)幬锓ㄌ攸c

傳統(tǒng)的探針?biāo)幬镅芯糠ㄒ殉墒鞈?yīng)用于各種CYP450同工酶的表型及活性研究，但是單次探針實驗僅能反應(yīng)單一亞型同工酶的活性特點，且存在的個體差異會導(dǎo)致數(shù)據(jù)的波動，不利于實驗研究，而Cocktail法則可以通過一次實驗獲取多個CYP450同工酶的表型信息，具有快速、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)、高通量的特點，具有良好而廣闊的應(yīng)用前景。

藥物進(jìn)入生物體內(nèi)，大部分通過CYP450酶系進(jìn)行生物Ⅰ相轉(zhuǎn)化，同時也影響著同工酶的活性及表達(dá)水平。通過轉(zhuǎn)化后，活性藥物可能代謝失活，而前體藥物則可能轉(zhuǎn)化成具有活性的代謝產(chǎn)物，在此過程中藥物有可能對CYP產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)的作用，誘導(dǎo)會加速藥物代謝失活，而抑制作用會減慢藥物代謝從而導(dǎo)致藥效增強(qiáng)，對CYP450酶系的誘導(dǎo)及抑制作用也是引起藥物相互作用的重要原因。2000年Basal會議及2012年FDA《藥物相互作用研究指南》推薦的體內(nèi)研究CYP450同工酶敏感底物、抑制劑及誘導(dǎo)劑見表1[2-3]。

現(xiàn)代儀器分析技術(shù)與Cocktail法聯(lián)用，使方法學(xué)的開發(fā)更加精準(zhǔn)、便捷、高通量。Peng Y等[4]開發(fā)了使用LC-MS/MS同時測定針對人肝微粒體9種CYP450同工酶（1A2，2A6，2B6，2C8，2C9，2C19，2D6，2E1，3A4）的16種Cocktail探針?biāo)幬镝樀姆椒?，多重探針?biāo)幬锏膽?yīng)用解決了多重底物結(jié)合及底物依賴性抑制的現(xiàn)象。Donzelli M等[5]開發(fā)了市場化的Basel Cocktail探針?biāo)幬镌噭┖?，包?6種低劑量的探針?biāo)幬锝M合：咖啡因、依法韋侖、氯沙坦、奧美拉唑、美托洛爾、咪達(dá)唑侖，可以同時、快速檢測CYP1A2，2B6，2C9，2C19，2D6 和3A4在血漿、唾液和干血點樣品中全部的基因型和藥代動力學(xué)類型。和凡等[6]使用LC-MS/MS系統(tǒng)快速篩查了33 種黃酮類化合物對 CYP450 6 種同工酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)黃酮苷類無抑制作用，苷元類對1A2有抑制作用，對3A4有誘導(dǎo)作用。以上研究皆說明國內(nèi)外Cocktail法的相關(guān)研究基礎(chǔ)良好，在方法開發(fā)及獲取數(shù)據(jù)方面具有獨到優(yōu)勢，有利于藥物代謝過程、相互作用等的研究。

2 Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔ谥嗅t(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用

祖國醫(yī)學(xué)博大精深，源遠(yuǎn)流長，是傳統(tǒng)文化的瑰寶，歷經(jīng)數(shù)千年的臨床考驗而不倒，但由于中藥調(diào)和而成，組分復(fù)雜，作用靶點多，如何利用現(xiàn)代的科學(xué)手段明確闡述中藥的藥理作用和代謝過程成為當(dāng)今中藥研究的重點與難點。Cocktail探針?biāo)幬锓▽τ谠u價肝 CYP450 酶系對中藥進(jìn)行整體化的代謝物性質(zhì)、藥物相互作用研究、藥物代謝表型分析及臨床給藥方案調(diào)整與評估，正與中醫(yī)中藥的整體辯證觀不謀而合，其對中醫(yī)藥現(xiàn)代化研究的應(yīng)用價值不容忽視。目前應(yīng)用Cocktail法對中醫(yī)藥的研究主要集中在下幾個領(lǐng)域：①中藥活性成分的代謝機(jī)制研究；②中藥不同炮制過程對CYP450的影響；③方劑配伍對CYP450活性的影響；④中成藥的CYP450代謝特點研究及藥物相互作用提示；⑤應(yīng)用于民族藥學(xué)研究；⑥中藥保肝作用研究；⑦中醫(yī)證候模型研究。本文也將從上述7個方面來梳理總結(jié)現(xiàn)有的研究成果。

2.1 中藥活性成分的代謝機(jī)制研究 中藥活性成分是新藥開發(fā)的重要來源，隨著技術(shù)手段的更新發(fā)展，研究者對中藥活性成分的藥理、毒理及藥效機(jī)制的研究越發(fā)深入。Cocktail法用于快速篩選考察中藥活性成分的肝藥酶代謝特點，對于藥物的代謝特點、毒副反應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制及潛在的藥物-藥物相互作用起到一定的提示作用?，F(xiàn)有研究結(jié)果中常見中藥活性成分的CYP450酶代謝特點見表2。

2.2 不同炮制過程對CYP450的影響 不同的炮制過程會改變中藥的性味歸經(jīng)，從而發(fā)揮不同的藥效?，F(xiàn)代學(xué)者運用Cocktail法從肝藥酶角度分析生藥及炮制品或不同炮制過程所帶來的代謝特點上的差異，為解釋其炮制機(jī)制及臨床用藥安全提供證據(jù)?，F(xiàn)有的關(guān)于生藥炮制的CYP450代謝特點見表3。通過表中文獻(xiàn)提示，經(jīng)過炮制后或者不同炮制過程的制藥與生藥之間，CYP450酶的代謝特點確實出現(xiàn)了不同的變化，從這個角度或可解釋生藥經(jīng)炮制后減毒增效的機(jī)制。

2.3 藥對配伍及傳統(tǒng)經(jīng)方對CYP450活性的影響 中藥配伍應(yīng)用是體現(xiàn)中醫(yī)理論和“辨證論治”思想的重要載體。探索中藥配伍規(guī)律及其內(nèi)在聯(lián)系，對闡明中藥復(fù)方的作用機(jī)制是必不可少，是中藥復(fù)方研究領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。中藥素來有“十八反、十九畏”等配伍禁忌，同時，在既往研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過復(fù)方配伍后，藥效指標(biāo)成分的體內(nèi)藥動學(xué)行為及反映的藥效與原單方藥物相比確會出現(xiàn)明顯的改變，這一過程必然涉及到體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運的過程。藥物代謝酶可能是方劑配伍規(guī)律研究的突破點之一，應(yīng)用Cocktail法研究中藥復(fù)方對CYP450酶影響的規(guī)律也成為近年來的研究熱點。目前藥對配伍及經(jīng)方的肝藥酶研究進(jìn)展見表4?，F(xiàn)有研究通過CYP450酶的代謝特點發(fā)現(xiàn)，“十八反、十九畏”的藥對配伍共同作用后，確實有增強(qiáng)抑制/誘導(dǎo)某個或某幾個同工酶的作用，這也可能就是造成其代謝滯留產(chǎn)生毒性/促進(jìn)代謝降低毒性的原因。王宇光[57]探討了基于CYP450酶的“十八反”配伍的中藥相互作用，研究中揭示了瓜萎、白及、半夏、貝母與烏頭合用按作用強(qiáng)度順序?qū)YP3A和CYPIA2在基因、蛋白和酶活性水平均產(chǎn)生不同程度抑制作用，并通過代謝產(chǎn)物的鑒定和分析，表明可能正是由于對CYP3A和CYPlA2的抑制作用減緩了烏頭堿的代謝速率并提高了其血藥濃度，從而造成毒性的蓄積，也正是配伍禁忌所在；丹參、苦參、人參及其與藜蘆合用后均不同程度的抑制了P450酶含量和主要的藥物代謝酶CYP3A及CYP2EI的酶活性，提示可能正是由于3種中藥與藜蘆配伍后對藥物代謝酶的抑制作用減緩了劇毒中藥藜蘆中相關(guān)物質(zhì)的代謝，導(dǎo)致毒性增加，應(yīng)和“諸參辛芍叛藜蘆”；“藻戟遂芫具戰(zhàn)草”，主要是由于甘草具有誘導(dǎo)CYP3A的代謝特點，導(dǎo)致與其合用時海藻、大戟、甘遂、芫花的加速代謝。

2.4 中成藥的CYP450代謝特點研究 隨著疾病譜的改變和衛(wèi)生保健需求的日益增長，中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，特別是中成藥臨床應(yīng)用越來越廣泛，名優(yōu)中成藥的二次開發(fā)成為當(dāng)前開展重大新藥創(chuàng)制的主要途徑之一，也是關(guān)乎我國民生和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問題之一。臨床定位清晰是用藥安全和用藥有效的首要解決問題。我國研究者進(jìn)行了多種中成藥的肝藥酶研究，旨在闡明中成藥的代謝特點，指導(dǎo)臨床合理用藥，避免毒性較大藥物相互作用?，F(xiàn)有研究中常見中成藥的CYP代謝特點見表5，為臨床合理用藥提供依據(jù)。

2.5 Cocktail法在民族藥學(xué)中的應(yīng)用研究 王輝[82]對傣藥“雅解沙把”增強(qiáng)肝臟解毒功能的機(jī)制進(jìn)行研究探討，通過給予“雅解沙把”后小鼠洋地黃毒苷LD₅₀增大，用藥后戊巴比妥鈉對正常小鼠和肝損小鼠睡眠時間縮短，通過Cocktail法考察服用“雅解沙把”后大鼠的肝藥酶活性，發(fā)現(xiàn)其對于CYP3A4及2A1有誘導(dǎo)作用，可以加速藥物、毒物等的代謝轉(zhuǎn)化，從藥理層面上解釋傣藥“雅解沙把”增強(qiáng)肝臟解毒的機(jī)制。段雅彬等[83]分析了藏藥余甘子對大鼠CYP2C9酶活性的影響，對照組與試驗組結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異，說明藏藥甘余子不主要經(jīng)由CYP2C9代謝，對其活性無明顯影響。崔雅萍等[84]進(jìn)一步擴(kuò)大了藏藥余甘子的肝藥酶研究，通過Cocktail法研究其鞣質(zhì)部位對大鼠肝微粒體CYP3A4，2D6，2A6，1A2，2E1，2C9亞酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)其鞣質(zhì)部位對肝P450 酶活性影響的IC₅₀均較大，證明其對肝藥酶的活性影響較小，合并用藥時從代謝酶角度較為安全，不易發(fā)生藥物相互作用。頭花蓼是貴州苗藥，具有清熱解毒、利尿通淋之功，Zheng L等[85]通過Cocktail法考察了頭花蓼對大鼠體內(nèi)CYP1A2，2C9，2C19，2E1及3A4的代謝影響，發(fā)現(xiàn)其能誘導(dǎo)大鼠CYP2C9及3A4，提示其可能會加速與其合用藥物的代謝，在臨床應(yīng)用中需考慮可能發(fā)生的藥物相互作用。

2.6 中藥保肝作用研究 邱萍等[86]選用KM雄性小鼠分組灌胃給予不同劑量復(fù)方銀杏葉制劑（GCB）、銀杏葉提取物（GBE）及聯(lián)苯雙酯連續(xù)8周，再以白酒灌胃造成急性酒精性肝損模型，測定各組的血清肝功能生化指標(biāo)、TNF-α、核因子相關(guān)因子2（Nrf2）、CYP2E1活性及表達(dá)。試驗結(jié)果表明，與對照組相比，GCB組可顯著增強(qiáng)小鼠肝組織Nrf2表達(dá)并下調(diào)CYP2E1和TNF-α表達(dá)，且成劑量相關(guān)性，從代謝角度及生物分子層面解釋GCB減輕乙醇導(dǎo)致急性肝氧化應(yīng)激損傷機(jī)制。紀(jì)曉霞[87]在研究四君子湯對小鼠急性乙醇性肝損傷的干預(yù)作用中，對CYP2E1表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)四君子湯可以減少并抑制2E1的表達(dá)，從代謝機(jī)制方面解釋其保肝作用。鄭天慧等[88]通過用Cocktail法，研究扶正化瘀方對正常和肝纖維化大鼠CYP450同工酶的影響，發(fā)現(xiàn)扶正化瘀方對于正常大鼠CYP1A2，2C9，2C19，2D6具有明顯的抑制作用，而對于肝纖維化模型大鼠則僅表現(xiàn)出對2C9的抑制作用，對包括3A4在內(nèi)的其余4種同工酶則不再有明顯的抑制/誘導(dǎo)作用。肝纖維化大鼠模型的選擇更為貼近臨床實際情況，扶正化瘀方作為抗纖維化用藥，在不同病理形態(tài)下所產(chǎn)生的代謝作用是具有明顯差異的，在臨床應(yīng)用過程中應(yīng)當(dāng)注意。

2.7 中醫(yī)證候模型研究 楊志福等[89]應(yīng)用Cocktail法評價急性血瘀癥對大鼠CYP450酶活性的影響。以皮下注射鹽酸腎上腺素注射液并寒冷刺激法造模急性血瘀癥大鼠模型，模擬中醫(yī)證候中的氣滯血瘀和寒凝血瘀。與正常組相比，血瘀證組探針?biāo)幬锇北巾康陌胨テ冢═_1/2）明顯延長，清除率（CL）也減慢，咖啡因的T_1/2明顯縮短，氯唑沙宗的T_1/2和CL則在2組中無顯著性差異，說明血瘀證可以抑制CYP3A4，誘導(dǎo)1A2活性，對2E1無明顯影響。Cocktail法為中醫(yī)證本質(zhì)的研究提供了新的思路和方法。

3 Cocktail法在中西醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用特點差異

前文主要闡述Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔ谥嗅t(yī)藥領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用進(jìn)展，該法起源于西方，在西方醫(yī)學(xué)中該法現(xiàn)主要應(yīng)用于以下領(lǐng)域：①藥物代謝途徑確證及CYP酶活性影響考察；②新藥開發(fā)臨床前研究，針對CYP450酶代謝途徑藥物-藥物相互作用篩選工具[3]；③評價肝臟代謝機(jī)能臨床意義及疾病發(fā)病機(jī)制研究[90-92]；④CYP450酶表型分析，個體化差異研究[93]；⑤輔助腎功能評價研究[94]。Cocktail法的合理應(yīng)用可以快速表征CYP450酶活性特點，為臨床安全用藥提供指導(dǎo)。

Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔ谥形麽t(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的異同點比較見表6。

4 小結(jié)與展望

Cocktail探針?biāo)幬锓ㄗ云溟_發(fā)以來就以快速、準(zhǔn)確、高通量的評價CYP450酶系活性而在醫(yī)藥研究領(lǐng)域受到重視，特別是在揭示藥物相互作用和臨床給藥方案優(yōu)化方面具有顯著優(yōu)勢，除FDA外，我國CFDA在2012年5月發(fā)布的《藥物相互作用研究指導(dǎo)原則》中也特別強(qiáng)調(diào)了研究CYP450酶的重要性。

中藥成分復(fù)雜，中藥安全性研究極受重視，但在研究過程中明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用靶點、揭示藥物體內(nèi)代謝過程存在巨大的困難，Cocktail法的引入與使用為中藥研究提供了新的思路，不但可以推斷中藥體內(nèi)代謝過程，更為其炮制方法選擇、組方配伍優(yōu)化給出有效幫助從而達(dá)到減毒增效的目的，如運用得當(dāng)則可以前瞻性的提高中藥臨床用藥安全。

Cocktail法體外試驗已被廣泛應(yīng)用于新藥篩選及藥物相互作用研究，但是其作為臨床試驗至今也還存在一定的爭議，包括倫理方面的問題，同時給予多種探針?biāo)幬锖笏幬锸茉囌叩捻槕?yīng)性，所選定的探針?biāo)幬锸欠窈侠?，是否同時存在其他轉(zhuǎn)運體或Ⅱ相代謝酶參與反應(yīng)從而影響藥物機(jī)體代謝過程等，說明Cocktail探針?biāo)幬锓ㄟ€存在許多挑戰(zhàn)及研究空間，但有理由相信伴隨其方法的不斷完善，必將發(fā)揮巨大的潛力和作用，為新藥研發(fā)、中藥大品種二次開發(fā)及指導(dǎo)臨床合理用藥提供更為詳實的科學(xué)依據(jù)。

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[責(zé)任編輯 馬超一]