地黃飲子對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛及其空間學習記憶能力的影響

周景慧

?

·基礎醫學· ·論著·

地黃飲子對腦缺血再灌注損傷大鼠腦組織超氧化物歧化酶、丙二醛及其空間學習記憶能力的影響

周景慧

目的 探討地黃飲子對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 選取健康清潔級Wistar大鼠72只，雌雄不限，體質量260～280 g，隨機分為A組、B組、模型組、正常組，每組18只。A組：在造模后每日灌服地黃飲子36 g/kg。B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg。模型組：造模后胃灌鹽水1次/d。正常組：正常飲食。前3組造模：夾閉大鼠雙側頸總動脈，大鼠發生腦缺血再灌注損傷。灌藥3周后檢測腦組織內超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)。Morris水迷宮實驗和跳臺實驗比較大鼠學習記憶能力，測量大鼠腦梗死面積。結果 模型組中SOD含量[(93.42±18.78) kU/g prot]明顯低于正常組[(158.36±22.32) kU/g prot]，MDA含量[(6.35±2.04) μmol/g prot]明顯高于對照組[(2.63±1.86) μmol/g prot]，差異有統計學意義(P<0.05)，本實驗造模成功。A組[(135.34±20.12) kU/g prot]和B組[(132.78±19.56) kU/g prot]的SOD含量明顯高于模型組，MDA含量[A組：(3.46±1.75) μmol/g prot]，B組：(3.82±1.82) μmol/g prot]明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。A組和B組的學習能力和記憶能力的錯誤次數、潛伏期均明顯少于模型組，A組和B組的潛伏期均明顯少于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。A組和B組的腦梗死面積均明顯小于模型組，且A組的腦梗死面積明顯小于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 地黃飲子能夠改善受損的腦細胞血液循環減少梗死面積，改善大腦的能量代謝，改善被抑制的神經細胞，修復神經功能缺損，保護受損的神經元。

地黃飲子；腦缺血再灌注損傷；保護作用

地黃飲子出自《圣濟總錄》五十一卷[1]，地黃飲子具有驅毒化瘀、滋腎陰、補腎陽、化痰等功效，能夠促進內源性神經干細胞增殖和遷移，補充缺血區的神經元，修復神經損傷[3]。近年來，發現腦缺血再灌注后神經細胞數量減少，部分神經功能缺失[4]。本研究通過地黃飲子治療腦缺血再灌注大鼠，觀察大鼠的學習記憶能力及對腦組織的保護作用。

1 資料與方法

1.1 實驗動物及分組

由中國醫科大學提供健康清潔級Wistar大鼠72只，編號：SCXK-LN2013-0007，雌雄不限，體質量260～280 g。按數字表法隨機分為A組、B組、模型組、對照組，每組18只。A組、B組、模型組制造腦缺血再灌注模型。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg。B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg(天津藥業生產，批號：20130067，規格：20 mg/片。與注射用水溶解)。模型組：造模后每日胃灌鹽水1次。正常組：正常飲食。均灌藥3周。

1.2 動物模型的建造

用10%水合氯醛腹腔麻醉、固定，頸部正中切開，兩側分別分離雙側頸總動脈并鉗夾30 min(紗布覆蓋切口創面)，松開動脈夾30 min，再次鉗夾30 min，松開動脈鉗，模型完成。

造模完成后每組隨機取出1只大鼠斷頭，取腦組織稱重，加緩沖液制成1∶9體積的腦組織勻漿液，離心后取上清液，采用羥胺法測定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量(參照南京建成生物研究所的說明書進行)。

1.3 藥物配方

參照《黃帝素問宣明論方》配制地黃飲子方法：熟地黃12 g、山茱萸15 g、炮附子15 g、白茯苓12 g、石斛15 g、麥門冬15 g、菖蒲12 g、巴戟天15 g、肉蓯蓉15 g、官桂10 g、五味子10 g、遠志10 g。煎煮2次，每次1 h，將2次藥液混合，用旋轉儀蒸發濃縮，干燥密封。

1.4 儀器

中國醫科大學實驗部提供Morris水迷宮實驗記錄儀和跳臺儀，光學顯微鏡。

1.5 實驗方法

1.5.1 定位航行實驗 實驗共4 d，每天訓練3次，每次1 min，訓練場地由一圓形水池和移動平臺組成，水池上方有攝像機和監視器與電腦連接，記錄大鼠的游行軌跡、路程、到達平臺的時間(潛伏期)。實驗前將池中注入清水和牛奶，使水池變成不透明的顏色，水溫保持在24 ℃，水池分為4個象限，并在密室內進行實驗。在實驗前1 d將大鼠放入水池中適應環境2 min。第2天開始進行實驗，大鼠在池中1 min內若未能找到平臺，潛伏期為60 s，在平臺上休息60 min后再次重復訓練，每只大鼠訓練3次，連續訓練4 d，分別記錄每只的錯誤次數和潛伏期。

1.5.2 跳臺實驗 定位航行實驗后在跳臺記錄儀上進行，檢測大鼠快速記憶的潛伏期。實驗前大鼠先適應環境5 min后通電，每日每只大鼠訓練3次，電腦記錄大鼠在3 min內雙足同時跳上絕緣臺次數和潛伏期。連續訓練5 d。

1.6 測量大鼠腦梗死面積

定位航行實驗和跳臺實驗結束后，斷頭取腦，間隔2 mm連續冠狀切片，快速加入1%2，3，5-三苯基四氮唑的磷酸液中進行TTC染色，用電鏡圖像分析腦組織內梗死面積比值(梗死面積/視野下全腦面積)。

1.7 統計學處理

采用SPSS 13.0進行統計分析，以均數±標準差(x±s)表示，Morris水迷宮實驗使用ANOVA分析，用單因素方差分析,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 地黃飲子對大鼠腦組織內SOD、MDA含量的影響

模型組中SOD含量明顯低于正常組，MDA含量明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，本實驗造模成功。A組和B組的SOD含量明顯高于模型組，MDA含量明顯低于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 地黃飲子對大鼠腦組織內SOD、MDA含量的影響(x±s)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。SOD：超氧化物歧化酶，MDA：丙二醛。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.2 地黃飲子對大鼠定位航行能力的影響

模型組的學習能力和記憶能力的錯誤次數、潛伏期均明顯多于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。A組和B組的學習能力和記憶能力的錯誤次數、潛伏期均明顯少于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 地黃飲子對大鼠定位航行能力的影響(x±s)

注：與正常組比較aP<0.05;與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

2.3 地黃飲子對大鼠跳臺實驗潛伏期的影響

模型組的潛伏期均明顯長于正常組，差異有統計學意義(P<0.05)。A組和B組的潛伏期均明顯短于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

2.4 地黃飲子對大鼠腦梗死面積的影響

模型組的腦梗死面積為38.36%，正常組腦梗死面積為0。A組和B組的腦梗死面積均明顯小于模型組，差異有統計學意義(P<0.05)；且A組的腦梗死面積明顯小于B組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 地黃飲子對大鼠跳臺實驗潛伏期的影響(s，x±s)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

表4 地黃飲子對大鼠腦梗死面積的影響(%)

注：與正常組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。A組：每日灌服地黃飲子湯36 g/kg，B組：每日灌服尼莫地平12.5 mg/kg

3 討論

腦缺血再灌注導致腦內氧自由基產生、細胞炎性因子釋放，刺激海馬區的神經干細胞增殖，但是由于細胞膜的通透性改變、細胞水腫、細胞能量代謝障礙、神經功能損傷，增殖的神經細胞很難遷移至缺血區，分化并補充受損的神經元。有研究發現[5-6]，而地黃飲子對腦內神經細胞的增殖和遷移起重要作用，它能夠促進缺血區SDF1、CXCR4、BDNF蛋白表達增加，SDF1、CXCR4、BDNF均具有調節腦內神經元信息傳遞、促進神經干細胞增殖粘附、調節新生神經元分化、修復受損的神經元等作用，因此，地黃飲子[7]能夠修復受損的神經元，保護腦神經。SOD和MDA是體內常見的抗氧化因子，SOD的作用是直接清除因氧化反應產生的氧自由基，MDA作用是脂質發生氧化反應后代謝產物，都代表發生氧化反應的程度[8]。

有研究證實[9]，腦組織缺血缺氧導致腦組織內SOD含量降低、MDA含量增高，而本實驗測得模型組SOD含量減少、MDA含量增高，證實模型制作成功。因此本實驗證實地黃飲子能夠提高腦組織內抗氧化的能力，減少細胞發生氧化損傷；同時地黃飲子改善腦組織細胞膜的通透性，延緩大腦衰老，保護腦細胞的作用。

水迷宮實驗和跳臺實驗是較好的測試大腦空間學習、記憶能力的工具。本實驗得出結果地黃飲子灌喂后大鼠的學習記憶能力增強，腦梗死面積減少，本實驗結果證實地黃飲子能夠改善受損的腦細胞血液循環減少梗死面積，改善被抑制的神經細胞，修復神經功能缺損，保護受損的神經元，改善大腦的能量代謝，減輕海馬區損傷的神經元，最終提高了學習記憶能力，同時地黃飲子能夠促進神經干細胞增殖和遷移到受損腦區，修復腦神經細胞的正常功能。本實驗結果與成金枝等[10]的結果一致，

綜上所述，地黃飲子可改善神經細胞遷移，修復受損的神經元，為研究中藥促進內源性神經再生的作用機制，提供了新的研究思路。

[1] 何德山. 地黃飲子探源[J]. 江西中醫藥, 2003, 34(4): 31-33. DOI:10.3969/j.issn.0411-9584.2003.04.023.

[2] 白黎明，閆詠梅，張曉雙.地黃飲子對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用[J].遼寧中醫藥大學學報,2012,14(1):84-85.

[3] 王倩，范文濤，賀文舜.地黃飲子含藥血清對胎鼠海馬神經干細胞遷移的影響[J].中醫藥學報，2015，43(1)：8-10.

[4] 何華，王桂香，鐘士江，等. 地黃飲子對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用[J]. 山東醫藥, 2006, 46(4): 28-29. DOI:10.3969/j.issn.1002-266X.2006.04.012.

[5] 王倩，范文濤，賀又舜. 地黃飲子含藥血清對海馬腦片SD F-1的影響[J]. 陜西中醫, 2015, 36(3): 373-375. DOI:10.3969/j.issn.1000-7369.2015.03.058.

[6] 范文濤，王倩. 地黃飲子對急性腦缺血大鼠神經干細胞遷移的影響[J]. 中醫學報, 2013, 28(12): 1834-1835.

[7] 張賡，吳金娟，姜淼，等. 中醫藥治療阿爾茲海默病的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志, 2014, 20(6): 217-222.

[8] 白黎明，閆詠梅，張曉雙. 地黃飲子對大鼠局灶性腦缺血的保護作用[J]. 西北藥學雜志, 2012, 27(2): 131-132. DOI:10.3969/j.issn.1004-2407.2012.02.015.

[9] 譚永星，李雪梅，文素芳.不同時間腦室注射BDNF對大鼠腦缺血再灌注損傷氧化應激及神經細胞凋亡的影響[J].第四軍醫大學學報,2009,30(18):1681-1684.

[10] 成金枝，張俊龍，郭蕾，等. 地黃飲子傳統飲片湯劑與中藥免煎顆粒沖劑對快速衰老小鼠行為學影響的實驗研究[J]. 世界中西醫結合雜志, 2014, 9(3): 242-244.

(本文編輯：林永麗)

Protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats

ZhouJinghui

(AffiliatedHospitalofLiaoningChineseHerbalMedicineUniversity,Shenyang110032,China)

Objective To explore the protective effects of rehmannia Yinzi on ischemic injury induced by reperfusion in rats.Methods Seventy-two clean-grade Wistar rats with a body weight of 260-280 g were randomly divided into 4 groups: group A, group B, the model group and the normal control group, each consisting of 18 animals. For the animals of group A, rehmannia Yinzi liquid was given by gavage at a dose of 36 g/kg following development of the model, and for animals of group B, nimodipine was given also by gavage at a dose of 12.5 mg/kg. The animals of the model group received physiological saline by gavage following development of the model, and the animals of the control group received normal feed. In the animals of the former 3 groups, bilateral common carotid artery was clipped to develop the ischemia model, and then, blood reperfusion was performed to induce ischemic injury. Three weeks after gavage of rehmannia Yinzi, the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondiadehyde(MDA)were detected in the brain tissue. Morris water maze experiment and platform-jump experiment were performed to detect the learning and memory capacity of the rats, and the area of infarction was measured as well.Results SOD level [(93.42±18.78) kU/g prot] in the model group was obviously lower than that of the normal control group [(158.36±22.32) kU/g prot], but MDA level [(6.35±2.04) μmol/g prot] was significantly higher than that of the control group, [(2.63±1.86) μmol/g prot], and statistical significance could be noticed, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The animal model was successfully developed. The SOD levels of group A [(135.34±20.12) kU/g prot] and group B [(132.78±19.56) kU/g prot] were significantly higher than those of the model group, and the MDA levels of group A [ (3.46±1.75) μmol/g prot] and group B [ (3.82±1.82) μmol/g prot] were significantly lower than those of the model group. Statistical significance could also be noted, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The rate of learning and memory errors, as well as latency were all significantly lower than those of the model group, and the latency of group A and group B were significantly shorter than that of the model group. Statistical significance could be found, when comparisons were made between the 2 groups(P<0.05). The areas of cerebral infarction in group A and group B were significantly smaller than that of the model group, and the area of cerebral infarction in group A was significantly smaller than that in group B, also with statistical significance(P<0.05).Conclusion Rehmannia Yinzi liquid could improve blood circulation in the damaged brain tissues, reduce the area of infarction, improve energy metabolism in the damaged brain, enhance suppressed nerve cells, repair nerve function defect, and also help to protect the damaged neurons.

Rehmannia Yinzi; Cerebral ischemia-reperfusion injury; Protective effect

110032 沈陽，遼寧中醫藥大學附屬醫院

Q95-33

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.02.009

2016-04-08)