香葉木素的檢測方法與生物活性及其機制研究進展

楊蕾磊，陳科力（1.湖北中醫藥大學藥學院2014級，武漢 430065；2.教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室/湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065）

香葉木素的檢測方法與生物活性及其機制研究進展

楊蕾磊1＊，陳科力2#（1.湖北中醫藥大學藥學院2014級，武漢 430065；2.教育部中藥資源和中藥復方重點實驗室/湖北中醫藥大學藥學院，武漢 430065）

目的：為香葉木素的研究與開發提供參考。方法：以“香葉木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等為關鍵詞，組合查詢2000年1月－2016年3月在PubMed、中國知網、萬方、維普等數據庫中的相關文獻，對香葉木素的檢測方法和生物活性及其機制進行綜述。結果與結論：共檢索到相關文獻50篇，其中有效文獻24篇。香葉木素可采用毛細管電泳-電化學法、化學發光法、高效液相色譜法等方法進行檢測，其具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤及雌激素樣作用。在信號通路、基因和相關蛋白酶的調控方面的研究，為香葉木素作為新型高效、低毒的抗癌輔助藥物開發提供了可能。建議加強香葉木素提取工藝、體內藥效學和提高生物利用度的藥劑學研究，并對其用藥安全性進行考察。

香葉木素；黃酮類化合物；生物活性；檢測方法

香葉木素是天然黃酮類化合物的一種，化學名稱為3′，5，7-三羥基-4′-甲氧基黃酮。香葉木素為黃色粉末，熔點為256～258℃，分子式為C16H12O6，分子量為300.26?？扇苡诩状?、乙醇等有機溶劑。結構式中3′，5，7這3個位置的羥基和C2＝C3雙鍵決定了香葉木素獨特的化學性質和生物學活性，其中7位酚羥基可與不同的糖基結合發生糖苷化反應而表現出不同的生物學活性。香葉木素在自然界中分布廣泛，主要以游離型或糖苷型存在，目前發現主要存在于菊花[1-2]、留蘭香[3]、蜘蛛香[4]等天然藥物和檸檬[5]、花生[6]等果實中。由于黃酮類化合物是人們日常飲食的重要組成部分，且近年來飲食中的黃酮類化合物對癌癥的化學預防作用是國內外學者研究的熱點，因此筆者以“香葉木素”“生物活性”“Diosmetin”“Bioactivity”等為關鍵詞，組合查詢2000年1月－2016年3月在PubMed、中國知網、萬方、維普等數據庫中的相關文獻。結果，共檢索到相關文獻50篇，其中有效文獻24篇。現對香葉木素的檢測方法和生物活性及其機制進行綜述，以期為其研究與開發提供參考。

1 香葉木素的檢測方法

香葉木素可采用毛細管電泳-電化學法、化學發光法、高效液相色譜法等方法進行檢測。

1.1 毛細管電泳-電化學法

毛細管電泳具有分析速度快、分離效率高、樣品和試劑用量少、重現性好等優點，是一種高效的分離分析技術。對于電活性物質的檢測，毛細管電泳與電化學檢測聯用，具有更高的靈敏度和選擇性。傅亮等[7]采用毛細管電泳-電化學法分別測定不同產地蜘蛛香根中香葉木素、山柰酚、芹菜素、綠原酸以及咖啡酸等5種多元酚類化合物的含量。采用300 μm的碳圓盤電極為工作電極，檢測電位為+950 mV（vs.SCE），在50 mmol/L的硼砂緩沖溶液（pH＝9.23）中，上述各組分在23 min內能完全分離。

1.2 化學發光法

化學發光是指在化學反應的過程中，物質分子吸收化學能后產生光輻射的現象?；瘜W發光法是利用反應體系中的待測物質與體系的化學發光強度在一定條件下呈線性關系的原理，通過儀器檢測體系的化學發光強度，從而確定待測物含量的一種方法。李麗等[8]研究發現，香葉木素對高錳酸鉀（KMnO4）氧化堿性魯米諾（Luminol）的化學發光反應有非常明顯的增敏作用。除香葉木素外，納米銀（AgNPs）也對Luminol-KMnO4-NaOH體系的發光強度有增敏作用，但在AgNPs和香葉木素共同存在的條件下，此體系的發光強度可增加4倍多且發光速度加快，檢測香葉木素的靈敏度更高[4]。除此之外，香葉木素對鐵氰化鉀{K3[Fe（CN）6]}氧化堿性Luminol的化學反應也有較強的增敏作用。李麗等[9]的試驗結果表明，香葉木素加入K3[Fe（CN）6]和堿性Luminol的混合溶液中之后，在更短的時間內，體系的發光強度增大了1倍多。

3種反應體系測定香葉木素的線性范圍、檢出限和相對標準偏差（RSD）比較見表1。綜合3種反應體系，Luminol-NaOH-KMnO4-AgNPs體系的抗干擾能力最強，其RSD最小。若待測定樣品中香葉木素的含量較低，可考慮使用Luminol-KMnO4-NaOH體系進行檢測，此體系具有最低的檢出限。

表1 3種化學發光法比較

1.3 高效液相色譜法

鄧斌等[10]的研究表明，對于血漿中香葉木素含量的測定，可以采用高效液相色譜法。大鼠血漿與酶水解液（β-葡萄糖醛酸酶200 U/mL，硫酸酯酶10 U/mL）共同孵育16 h后，采用梯度洗脫方式進行分析，流動相為乙腈（A）-甲醇-0.2%磷酸溶液（50∶50，V/V，B）。結果，香葉木素在質量濃度為0.02～50 μg/mL時與色譜峰面積比之間的線性關系良好，加樣回收率為76.1%～81.9%，精密度RSD為5.8%～11.9%。

植物性食物中的香葉木苷，在體內腸道菌群和消化酶的作用下，可水解為香葉木素。Kanaze FI等[11]采用高效液相色譜法對人血漿中的香葉木素進行分析，取血漿樣品經液-液萃取后，用C8反相色譜柱進行分析，流動相為甲醇-水-醋酸（55∶43∶2，V/V/V）。結果，香葉木素質量濃度在10～300 ng/mL范圍內有良好的線性關系，加樣回收率為89.7%，精密度RSD為1.6%～5.3%。

Campanero MA等[12]使用C18反相色譜柱分析人血漿中的香葉木素。在pH值為2的條件下，用甲基叔丁基醚萃取血漿樣品后注入液相色譜柱進行分析，以甲醇-1%甲酸（58∶42，V/V）為流動相。結果，香葉木素質量濃度在0.25～500 ng/mL范圍內呈良好的線性關系，加樣回收率為89.2%，精密度RSD為2.8%～12.5%。

黃酮苷的水解過程受到酸、堿和酶的影響。為了篩選出從菊花粉末中提取香葉木素、木犀草素和芹菜素的最優水解條件，Li FG等[13]采用4因素3水平的正交試驗法對水解條件進行了優化，提取液中香葉木素、木犀草素和芹菜素的含量采用高效液相色譜法進行測定。以甲醇-0.25%磷酸（51∶49，V/V）為流動相，Zorbax SB-C18液相色譜柱為固定相，二極管陣列檢測器用于檢測。此方法精密度RSD為0.38%～2.0%，回收率為100.04%。

2 香葉木素的主要生物學活性及其機制

香葉木素具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗腫瘤及雌激素樣作用，其機制涉及清除自由基、誘導細胞凋亡以及抑制細胞內信號的傳遞等。

2.1 抗氧化作用

阿爾茨海默病是老年人群中最常見的認知功能障礙疾病，過度產生并積累的β-淀粉樣肽（Aβ）被認為是導致阿爾茨海默病的主要原因。晚期糖基化終末產物（AGEs）與Aβ之間有密切的相互作用，而AGEs及其受體利用細胞內的活性氧傳遞信號。Chandler D等[14]的研究表明，香葉木素具有清除這些活性氧的能力，可延緩AGEs及其受體的產生，因此被認為是一種天然的抗氧化劑。

衛強等[1]通過比較加入香葉木素前后含有1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）的95%乙醇溶液在517 nm波長下吸光度值的變化，對香葉木素的體外抗氧化活性進行考察。結果，加入香葉木素后，溶液吸光度值減小，說明香葉木素與DPPH·的單電子配對，溶液中的DPPH·濃度才降低，證明香葉木素具有清除DPPH·自由基能力，抗氧化活性較強。

采用鄰苯三酚自氧化反應測定香葉木素對超氧陰離子自由基的清除作用。在堿性條件下，鄰苯三酚自氧化生成有色中間物和超氧陰離子自由基。超氧陰離子自由基不僅是反應中間產物，還能加快反應進程。當反應體系中有抗氧化劑存在時，超氧陰離子自由基的含量降低，反應也受到抑制，有色中間物含量降低，溶液在322 nm波長處的吸光度值減小。鄒淑君等[15]的試驗結果顯示，加入香葉木素后，在322 nm波長處吸光度值明顯減小，說明香葉木素抑制了反應的進行，對超氧陰離子自由基有顯著的清除能力，具有一定的抗氧化作用。

2.2 雌激素樣作用

絕經婦女體內內源性雌激素分泌不足，將會導致骨質疏松、血液中膽固醇升高、更年期綜合征等一系列疾病。人工合成的雌激素作為代替品對此類疾病有一定的預防和治療效果。人乳腺癌細胞MCF-7是一種對雌激素敏感的乳腺癌細胞，細胞內的雌激素受體與具有雌激素活性的配體結合后，可誘發一系列激素依賴性的細胞內反應，最終反應為對細胞增殖的影響。Yoshikawa M等[16]采用人乳腺癌細胞MCF-7增敏試驗對洋芫荽中分離出的黃酮類成分進行了體外雌激素檢測，試驗結果表明，香葉木素在一定濃度范圍內對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖具有促進作用，半數效應濃度為2.9 μmol/L。

2.3 抗菌作用

肺結核是一種由結核分枝桿菌引起的肺部感染性疾病，全球每年有幾百萬人死于肺結核，并且不斷有新的感染者。如何提高肺結核的治愈率以及研發新的抗結核藥物，已成為全球關注的健康問題。在菲律賓臨床上常用一種名為毛魚臭木的傳統中草藥來治療肺結核。Lirio SB等[17]為了進一步研究毛魚臭木用于治療肺結核的物質基礎，對毛魚臭木甲醇提取物的體外抗菌活性進行了觀察。通過比較香葉木素及其他提取物對結核分枝桿菌H37Rv菌株的最小抑菌濃度，可知毛魚臭木內含有具有抗菌活性的化合物，這為毛魚臭木用于肺結核治療提供了理論依據。

為了研究香葉木素的體外抑菌活性，Meng JC等[18]選擇了大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、黑曲霉和紅色毛癬菌，一共3種細菌和3種真菌作為實驗菌種，進行了體外抑菌實驗。結果表明，香葉木素在一定濃度下可以抑制枯草芽孢桿菌和紅色毛癬菌的增殖，具有一定抗菌活性。

2.4 抗炎作用

許多疾病的形成與發展，都伴隨有炎癥現象的出現，比如動脈粥樣硬化和類風濕性關節炎。Mueller M等[19]為了探究日常飲食中的水果和蔬菜是否有助于降低炎癥反應、起到預防炎癥相關疾病的作用，對幾種常見的從水果和蔬菜中分離得到的化合物進行了體外抗炎活性研究。結果顯示，香葉木素具有降低促炎性白細胞介素6和腫瘤壞死因子α分泌的作用，表明其具有一定的體外抗炎活性。

佛波酯（TPA）誘導的小鼠耳腫脹模型，由于其造模方法簡單、模型穩定，被廣泛用于評價化合物的抗炎活性。TPA是巴豆油的主要活性成分，將其涂抹于小鼠耳朵局部，6 h左右即可出現明顯的炎癥反應。Domínguez M等[20]為探究香葉木素是否具有抗炎活性，將香葉木素用于TPA誘導的小鼠耳腫脹模型。結果，香葉木素對于小鼠耳腫脹具有明顯的抑制作用，其半數有效量為每只耳0.45 mg，表明其具有較好的抗炎活性。

2.5 抗腫瘤作用

2.5.1 乳腺癌 乳腺癌和宮頸癌是婦科最常見的2種惡性腫瘤，其中乳腺癌發病率在我國女性人群中一直居高不下，且隨著人們的健康意識逐漸增強以及我國醫療水平的提高，越來越多的早期乳腺癌患者被確診并進行治療，同時也發現乳腺癌發病人群呈現年輕化趨勢。Wiseman M等[21]研究表明，遺傳因素并不是導致癌癥發生的主要因素，很大一部分癌癥患者并沒有腫瘤相關的家族病史，反而環境因素對腫瘤發病率的影響成為研究人員關注的熱點。這也從另一個方面說明，在理論上，癌癥是可以預防的。

Androutsopoulos VP等[22]以人乳腺癌細胞MDAMB-468和人正常乳腺上皮細胞MCF-10A為細胞模型，采用MTT法和流式細胞術檢測香葉木素對乳腺細胞生長的影響。結果，香葉木素能選擇性抑制腫瘤細胞的生長，其對人乳腺癌細胞MDA-MB-468的半數抑制濃度（IC50）為4.5 μmol/L；而對人正常乳腺上皮細胞MCF-10A的影響并不明顯，IC50值為100 μmol/L。流式細胞術的試驗結果也證實了香葉木素對乳腺癌腫瘤細胞的選擇性作用：10 μmol/L的香葉木素作用于人乳腺癌細胞MDA-MB-468 48 h之后，使用流式細胞術對其細胞周期進行檢測，發現與正常對照組比較，有13.5%的細胞被阻滯在G1期；而相同濃度的香葉木素作用于人正常乳腺上皮細胞MCF-10A，并沒有發現明顯的細胞阻滯現象。

Androutsopoulos V等[23]選用人乳腺癌細胞MCF-7為細胞模型，通過MTT法對香葉木素的體外抗腫瘤活性進行研究。結果，香葉木素在一定濃度范圍內可抑制人乳腺癌細胞MCF-7增殖，其IC50值為20 μmol/L。進一步研究發現，香葉木素的抗腫瘤活性與細胞色素P450酶介導的去甲基化反應有關。

2.5.2 肝癌 目前臨床上主要采用化學療法對肝癌患者進行治療，但化療藥物在殺死癌細胞的同時也對宿主體內的正常細胞及免疫系統有一定的損害。癌癥患者在治療之后往往伴隨有免疫力下降從而導致其他感染并發癥。近年來，特異性和有效性已經成為抗腫瘤新藥的研究熱點。

Androutsopoulos VP等[24]研究了香葉木素對人肝癌細胞HepG2生長和增殖的影響，MTT試驗結果表明香葉木素對人肝癌細胞HepG2有一定的生長抑制作用，能誘發細胞凋亡。流式細胞術和蛋白質印跡法的試驗結果表明，加入香葉木素后，人肝癌細胞HepG2被阻滯在G2/M期；且伴隨著細胞外信號調節激酶和c-Jun氨基端激酶蛋白表達量增加，腫瘤相關基因p53和p21表達得以增強。

3 結語

香葉木素是一種具有多種生物活性的黃酮類化合物，廣泛存在于植物界。在信號通路、基因和相關蛋白酶的調控方面的研究，為香葉木素作為新型高效、低毒的抗癌輔助藥物開發提供了可能；同時，現有的各種檢測方法又為其質量控制和藥物代謝的研究提供了技術條件。但目前關于香葉木素的研究尚有以下不足：（1）需要加強提取工藝研究。雖然香葉木素在植物界分布廣泛，且已有文獻報道從植物類中藥的樹皮、葉、花和果實中提取分離出香葉木素，但天然香葉木素提取率并不高，體外合成途徑的安全性也不理想，關于香葉木素工業化生產還處于“瓶頸”期。（2）雖然已有香葉木素抗乳腺癌和肝癌細胞系的基礎實驗，但還缺少香葉木素針對實驗動物模型的在體研究。（3）缺少提高香葉木素生物利用度的藥劑學研究以及相應的藥動學研究。（4）香葉木素的毒性、安全劑量和不良反應等研究也不容忽視。

香葉木素作為日常飲食中容易獲得的黃酮類化合物，具有巨大的生物學潛力和較好的開發前景。但當香葉木素主要以天然化合物的形式入藥時，需要加強其提取工藝、體內藥效學和提高生物利用度的藥劑學研究，并對其用藥安全性進行考察。

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（編輯：余慶華）

R969

A

1001-0408（2017）10-1426-04

2016-04-09

2016-08-02）

＊碩士研究生。研究方向：中藥資源及其品質研究。電話：027-68890106。E-mail：llyangchn@163.com

#通信作者：教授，博士生導師。研究方向：中藥資源及其品質研究。電話：027-68890106。E-mail：kelichen@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.10.35