李波+趙文勝++王國柱++馮冠++吳文浩++王丹丹

摘要 單增李斯特菌是一種重要的人獸共患病病原體,其檢測已成為食源性疾病預防與控制的重點內容。單增李斯特菌快速檢測技術的研究對我國食品安全工作具有極其重要的意義。本文對國內外單增李斯特菌的多種快速檢測方法及其檢出限進行對比,探討了快速檢測單增李斯特菌在未來的發展方向。
關鍵詞 李斯特菌;快速檢測;分子檢測
中圖分類號 S852.6 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739(2016)24-0265-03
Research Progress on Rapid Detection and Identification Methods for Listeria Monocytogenes
LI Bo 1,2 ZHAO Wen-sheng 1 WANG Guo-zhu 1 FENG Guan 1 WU Wen-hao 1 WANG Dan-dan 1,2
(1 Yanjiao Office of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Yanjiao Hebei 065201; 2 Yanjiao Branch Center of Hebei Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Inspection and Quarantine Technical Center)
Abstract Listeria monocytogenes is a kind of facultative pathogens of human and animal,its detection and identification has become the focus of prevention and control of food borne diseases.In this paper,rapid detection methods and detection limit of Listeria monocytogenes at home and abroad were compared,and the future development direction of the rapid detection of Listeria monocytogenes was discussed.
Key words Listeria monocytogenes;rapid detection;molecular detection
單增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)是一種重要的人獸共患病病原體,也是一種最為常見的食源性病原菌,WHO將其列為20世紀90年代食品中四大致病菌之一。單增李斯特氏菌廣泛存在于肉制品、乳制品、水產品以及土壤中,4 ℃的環境中仍可生長繁殖,是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一[1]。隨著生活節奏的加快,快餐食品逐漸受到我國人們的歡迎,單增李斯特菌的危害也隨之而來,因此對李斯特菌的檢測工作尤為重要。傳統的李斯特菌檢測方法繁瑣,耗時長,靈敏度低,難以滿足市場需求。發展快速準確、操作簡便的檢測與鑒定單增李斯特氏菌的方法對于提高食品衛生水平、保證食品安全具有重要的意義。
目前,單增李斯特菌的檢測方法中較常用的還是國標法[2]。隨著食品檢測技術的持續發展,高靈敏度的單增李斯特菌的快速檢測方法不斷完善,國內外對李斯特菌的快速檢測技術有了突飛猛進的發展,主要分為免疫學檢測、分子生物學檢測,生物傳感器,自動化檢測及聯合檢測方法。快速檢測方法大大提高了檢測的靈敏度,縮短了檢測時間,成為未來食品檢測主要的發展方向。
1 免疫學檢測
免疫學檢測法是利用抗體與抗原特異性結合的原理進行檢測的方法,抗體與檢測方法的不同,直接影響了單增李斯特菌的檢測限。主要的檢測方法有酶聯免疫吸附測定(ELISA)、酶聯熒光分析法(ELFA)和免疫磁性分析(IMS)等[3]。
1.1 ELISA法
ELISA法是抗原或抗體與酶形成的酶結合物與底物反應,催化生成帶色產物,根據顏色深淺進行定性定量的檢測方法。應用于食品安全檢測的ELISA試驗不斷創新,Bhunia等建立的夾心ELISA法在20~24 h檢出限為8~10 cfu/g(mL)[4]。趙 麗等[5]采用單增李斯特菌液相芯片,利用微球偶聯結合雙抗夾心技術測定偶聯率,檢測限為103 cfu/mL。現在已有德國拜發公司生產的商品化的單增李斯特菌檢測試劑盒可供使用,用ELISA方法操作較簡單,特異性強,反應靈敏度高,但由于單克隆抗體制備昂貴,所以用ELISA盒進行多種食品樣品的檢測費用較高。
1.2 ELFA檢測法
ELFA法將熒光標記物添加到抗體上,通過測定熒光強度檢測單增李斯特菌的數量,大大提高了檢測的靈敏度。Jaakohuhta 等[6]利用時間分辨熒光免疫分析法進行污染食品檢測,用時16 h,靈敏度為20 cfu/mL。Shi L等[7]運用測流免疫層析法20 min內檢出限為104 cfu/mL,特異性良好。免疫層析試紙條法方法方便,但存在一定的漏檢率,穩定性有待進一步提高。
1.3 IMS檢測
IMS依據抗原抗體原理,通過磁珠的富集縮短增菌時間,降低單增李斯特菌的檢測限。免疫磁珠檢測方法可快速特異地檢測出食品中單增李斯特菌,具有高靈敏度[8]。免疫磁性分離IMBS與PCR和ICG結合方法15 h測得檢出限為100 cfu/mL[9]。免疫磁珠-選擇性培養基檢測法9 h牛奶樣品檢測限為0.4 cfu/mL[10]。納米磁珠低場磁共振技術的線性檢測范圍為 1~103 cfu/mL[11]。超順磁免疫層析技術現已在臨床診斷、食品檢驗等領域得到廣泛應用,已有104 cfu/mL的靈敏度[12]。目前Matrix生產的Pathatrix快速檢測系統屬于世界最快的檢測方法之一[13]。磁珠的立體結構擴大了反應面,促使IMS受到各檢測領域的廣泛關注,但靈敏度還需進一步提高。
免疫學檢測方法具有良好的特異性和重復性,可同時對多個樣品進行檢測,實現檢測自動化,單一的免疫學檢測方法穩定性較差,與免疫學相結合的檢測方法有待進一步開發研究。
2 分子生物學檢測
由于分子生物學理論和技術的不斷發展與成熟,相關的分子生物學檢測方法如PCR技術、核酸探針雜交技術、實時熒光PCR(Real time-PCR)、多重PCR(M-PCR)及基因芯片等新型技術在單增李斯特菌的檢測研究中得到廣泛應用。
2.1 PCR技術
PCR檢測是較為傳統的分子生物學技術,通過設計特異毒力基因和特異性序列的引物,完成單增李斯特菌的檢測工作。常用的幾種靶基因包括hlyA[14]、iap[15]、inlB[16]、inlA[17],可對多類食品進行單增李斯特菌的檢測工作。
在PCR基礎上運用新的檢測技術,可提高檢測效率,縮短檢測時間。Uyttendaele等[18]以16s rRNA為靶基因設計引物,利用核酸序列擴增(NASBA)技術對李斯特菌屬進行檢測,具有較高的特異性。有研究者利用環介導恒溫擴增(LAMP)檢測技術[19]對肉制品進行檢測。三重LAMP檢測法可在90 min內完成檢測,靈敏度為10 fg/μL[20] 。隨著技術的不斷發展,與PCR結合的新技術在檢測靈敏度上獲得進一步的突破。
2.2 核酸探針雜交技術
核酸探針雜交技術最早作為分子生物技術應用于單增李斯特菌檢測[21],通過設計特異性探針,以同位素標記的方式,根據DNA雜交原理,檢測李斯特菌。Volokhov等以李斯特的6種毒力蛋白基因為靶基因設計多重PCR,研制出了基因芯片檢測單增李斯特菌,可達到種的水平[22]。通過寡核苷酸探針合成[23]、探針標記、微孔板雜交技術[24]等方法,可提高檢測效率,但由于探針制備工作復雜,檢測靈敏度有待提高,在實際工作中未得到廣泛運用。
2.3 Real time-PCR
Real time-PCR是在PCR擴增體系中加入熒光標記,根據熒光強度達到定量檢測的目的,特異性強,靈敏度高,簡單快捷。Real time-PCR技術可在3 h內完成乳制品中單增李斯特菌的檢測,檢測限為660 cfu/mL[25-26]。Rossmanith 等[27]對人工污染的牛奶和三文魚、鵝肝醬、奶酪樣品中單增李斯特菌(prfA)進行Q-PCR檢測,檢測限分別為0.3 cfu/mL和 0.07~0.60 cfu/g。閆 琳等[28]與 Rodriquez-Lazaro 等[29]對肉制品和蔬菜等進行熒光定量PCR檢測,結果相似。許華青等[30]對模擬糞便標本進行雙重Real-time PCR檢測,結果特異性良好,單增李斯特菌檢測下限為2.45 ×103 cfu/g。有不少研究者通過建立多重Real time-PCR方法檢測海產品等樣品中單增李斯特菌含量,可達6.5 cfu/mL靈敏度,穩定性強[31-32]。劉二龍等[33]設計hlyA、inlA 和plcB探針建立的TaqMan-MGB三重Real time-PCR 檢測方法,可將變異系數控制到1.5%以內,靈敏度可達100 cfu/mL。SureTect 實時PCR檢測方法測得相對檢測限在0.02~0.06 cfu/g的樣品,具有較高穩定性和特異性[34]。實時熒光定量PCR對引物和探針有嚴格的要求,需要特定的儀器進行實驗操作,在基層實驗的應用上存在一定的限制。
2.4 M-PCR檢測
M-PCR可以同時擴增多個靶基因,從而檢測出食品中的多種致病菌。胡冰雪等[35]根據熒光假單胞菌的gyrB基因、沙門氏菌的invA基因和單增李斯特菌的hlyA基因,定量檢測肉制品中3種致病菌情況,M-PCR檢測靈敏度分別為9、5、70 cfu/mL。Germini等[36]使用M-PCR檢測液體狀態蛋樣品中的單增李斯特菌(prfA基因)、沙門氏菌、大腸桿菌,在經過15 h增菌后檢測限為0.4 cfu/g。錢云開等[37]利用單增李斯特菌4個毒力基因(hly、prfA、inlA、inlB)引物,通過多重PCR 擴增,經變性高效液相色譜(DHPLC)進行快速檢測,具有良好的特異性,靈敏度可達到280 cfu/mL。多重PCR檢測技術可同時實現多菌的檢測特點,使得在引物設計工作中難度增大,退火溫度和產物片段等要求需同時顧及,需要多次進行條件優化才能得到實施。
綜上所述,分子生物學檢測方法具有高靈敏度、特異性強、速度快的特點,大大提高了食品檢測效率,在單增李斯特菌的檢測工作中占有重要地位(表1)。但分子生物學檢測技術無法分辨死菌和活菌,引物要求嚴格,反應條件的優化直接影響靈敏度和特異性。
3 全自動微生物檢測
微生物鑒定、酶聯免疫學、分子生物學檢測已出現自動化分析系統,如法國的VITEK系列全自動微生物分析系統、杜邦的BAX系統、美國的GDS系統[38]。陳 敏等[39]通過mini VIDAS 及 VITEK-AMS全自動微生物生化鑒定系統檢測單增李斯特菌,4 d檢測限達10 cfu/mL。杜邦的Ribo Printer系統是現在唯一可以對所有微生物種類進行快速鑒定和分型溯源的全自動微生物基因指紋鑒定系統,檢測工作僅需8 h。隨著食品檢測市場需求的不斷發展,全自動化檢測系統必然成為全球的研究熱點。
4 聯合方法檢測
多種檢測方法聯合檢測致病菌,可彌補單一檢測方法的不足,提高檢測的靈敏度和特異性。IMS與RT-PCR聯用3.5 h測魚中單增李斯特菌檢出限為10~40 cfu/g[40]。張 賽等[41]通過免疫磁珠與熒光免疫層析相結合的方法,檢測人工污染樣品和純培養的單增李斯特菌,檢測限為1~4×104 cfu/mL,相對于熒光免疫層析試紙條靈敏度提高了10倍。聯合檢測體系具有較高穩定性和特異性,免疫磁珠與PCR技術相結合,為菌體富集和致病菌檢測提供新思路。
5 生物傳感器
生物傳感器是通過待測物與分子識別元件結合后產生的復合物輸出的電和光信號進行分析檢測。信號轉換器的不同,可將生物傳感器分為電化學式生物傳感器、光學式生物傳感器等。Radhakrishnan 等[42]用交流阻抗法結合單抗檢出番茄樣品中單增李斯特菌檢測限為4 cfu/mL。BIAcore-3000 生物傳感器[43] 可在30 min 內完成單增李斯特菌檢測工作。Davis 等[44]用絲網印刷碳電極條作一次性安培傳感器,1 h 內檢測出藍莓樣品中的單增李斯特菌,檢測限為 102 cfu/g。石英晶體微天平[45]快速檢測李斯特菌檢測限為107 cells/mL,可多次重復使用。懸臂梁壓電生物傳感器結合單增李斯特菌多克隆抗體[46]進行牛奶樣品檢測,1 h內可測得樣品檢測限為102 cells/mL。劉金華等[47]應用光纖倏逝波生物傳感器檢測單增李斯特菌,靈敏度達30 cfu/mL。Paul 等制備的表面等離子體免疫傳感器,檢測食品中的單增李斯特菌檢測限為 105 cfu/mL[48]。生物傳感器檢測方法可將檢測時間縮短到24 h 以內,但是測得的樣品檢測限較高,具有高靈敏度的生物傳感器有待開發研究。
6 結語
食品工業的快速發展要求食品檢測技術與時俱進,但目前應用于食品工業檢測的方法并不多,且存在很多不足,無法滿足市場需求。致病菌的檢測技術主要圍繞檢測時間、檢出限、特異性進行評價,目前免疫學方法和分子生物學方法是李斯特菌檢測的重要發展方向,但不同的檢測方法存在一定的缺陷,如何在保證特異性和穩定性的基礎上加快檢測時間,提高靈敏度,降低檢測限應成為所有研究人員重點考慮的問題。在免疫檢測或PCR技術的基礎上,運用其他檢測技術,可明顯提高檢測靈敏度,降低檢測限,縮短檢測時間,增強特異性。因此,聯合檢測技術將成為單增李斯特菌的重要發展方向。基于食品行業發展現狀,快速檢測技術還需標準化之后進行廣泛推廣應用,才能促進食品檢測行業的平穩發展[49-54]。
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