真空包裝雪菜肉絲的初始菌相分析及優(yōu)勢(shì)菌的鑒定

要志宏，聶相珍，皇甫秋霞，申麗媛

（揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127）

真空包裝雪菜肉絲的初始菌相分析及優(yōu)勢(shì)菌的鑒定

要志宏，聶相珍，皇甫秋霞，申麗媛

（揚(yáng)州大學(xué)旅游烹飪學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225127）

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：真空包裝的雪菜肉絲在常溫儲(chǔ)存下的初始菌相以乳酸菌（30.1%）、假單胞菌（27.7%）、熱殺索絲菌（18.4%）、腸桿菌（14.5%）為主，而葡萄球菌（4.2%）和酵母菌（1.23%）數(shù)量較少；此外，分別在0，3，7，14，21，28天對(duì)常溫儲(chǔ)藏的雪菜肉絲的主要腐敗菌進(jìn)行培養(yǎng)、計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示：在儲(chǔ)藏初期，乳酸菌、假單胞菌、熱殺索絲菌為雪菜肉絲的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，但是在14～21天后，熱殺索絲菌、葡萄球菌、酵母菌有下降趨勢(shì)，而乳酸菌則一直居高不下；腸桿菌數(shù)量雖然少，但一直在穩(wěn)定增長(zhǎng)。

雪菜肉絲；菌相分析；優(yōu)勢(shì)腐敗菌

雪菜肉絲是一道浙江名菜，其肉絲鮮嫩，菜肴酸咸爽口，且營(yíng)養(yǎng)豐富，故而受大眾喜愛(ài)。近些年來(lái)，雪菜肉絲常被開(kāi)發(fā)成方便食品，以罐裝形式較多。雪菜肉絲中腐敗菌的存在，成為影響其貨架期的重要因素。研究常溫下真空包裝的雪菜肉絲的主要菌相構(gòu)成，并對(duì)分離、純化后的優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行初步鑒定，為后繼真空雪菜肉絲的防腐保鮮技術(shù)和貨架期預(yù)測(cè)技術(shù)的工作提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

1.1.1 培養(yǎng)基

平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基、STAA培養(yǎng)基、MRS培養(yǎng)基、假單胞菌培養(yǎng)基、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)基、VRBGA培養(yǎng)基：購(gòu)于揚(yáng)州市廣寧器化玻有限公司。

1.1.2 試劑

革蘭氏染色液、芽孢染色液、鞭毛染色液、3% H2O2溶液、1%對(duì)氨基二甲基苯胺鹽酸鹽溶液、1% 1－萘酚酒精溶液：購(gòu)于揚(yáng)州金斯特公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

BS323S型電子天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；DZQ400／2型真空包裝機(jī) 中國(guó)南通包裝機(jī)械廠；HSX－250B型恒溫恒濕培養(yǎng)箱 上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XSP－4X型顯微鏡 上海光學(xué)儀器廠；SW－CJ－1F型超凈工作臺(tái) 上海締倫光學(xué)儀器有限公司；PHS－3C型pH測(cè)定儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LDZX－50KBS型滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；BCD－195WN型美菱冰箱 合肥美菱冰箱廠；DGF30／7－IA型電熱鼓風(fēng)干燥箱 南京實(shí)驗(yàn)儀器廠；HH－8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.2 樣品

1.2.1 樣品原料

豬瘦肉、玉米油、食用鹽、淀粉、料酒、美極鮮醬油：購(gòu)于汊河蘇果超市；腌雪菜、干辣椒：購(gòu)于揚(yáng)州聯(lián)誼批發(fā)市場(chǎng)；郫縣豆瓣醬：購(gòu)于汊河美錦超市。

1.2.2 樣品的制作

按照表1中的配方制作雪菜肉絲。方法：鍋中加玉米油燒熱，爆香豆瓣醬、辣椒段，接著加豬瘦肉炒制顏色變白后加雪菜翻炒，最后下醬油、食鹽等調(diào)料拌勻。樣品趁熱快速灌裝10袋，每袋重量50g，然后真空包裝后放在室溫（25±1）℃下儲(chǔ)存。

表1 雪菜肉絲制作配方Table 1 Recipe of shredded pork with preserved vegetable g

樣品的操作流程：

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌的培養(yǎng)和優(yōu)勢(shì)菌的分離與純化

1.3.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)

已有多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道：豬肉的腐敗菌主要為假單胞菌、乳酸菌、大腸桿菌、熱殺索絲菌、微球菌和葡萄球菌、酵母菌和霉菌等［1］，其中以假單胞菌和乳酸菌為優(yōu)勢(shì)菌，而雪菜肉絲以豬肉和雪菜為主要原料，其菌相組成應(yīng)和豬肉相差不大，因此選擇假單胞菌、乳酸菌、大腸桿菌、熱殺索絲菌、微球菌和葡萄球菌、酵母菌和霉菌6種細(xì)菌為目標(biāo)菌株，對(duì)雪菜肉絲中的細(xì)菌總數(shù)、假單胞菌、乳酸菌、熱殺索絲菌、葡萄球菌和微球菌、腸桿菌、霉菌和酵母菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。不同細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件見(jiàn)表2。

表2 不同細(xì)菌選擇性培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件Table 2 Selective medium and culture conditions of different bacteria

1.3.1.2 優(yōu)勢(shì)菌的分離與純化

對(duì)室溫儲(chǔ)藏24h的真空包裝雪菜肉絲樣品進(jìn)行有氧平板計(jì)數(shù)。無(wú)菌稱取25g雪菜肉絲樣品放入乳缽磨碎后，放入盛有225mL滅菌生理鹽水的錐形瓶中，充分搖勻30min，制成10－1倍雪菜肉絲樣品的懸菌液，接著用滅菌移液管從10－1的懸菌液中移取1mL菌液放入9mL滅菌生理鹽水中；依次10倍遞增稀釋成所需的濃度梯度；然后選擇3個(gè)梯度合適的菌液1mL分別移入滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，每個(gè)梯度做3個(gè)平行，然后倒入冷卻至50℃左右的選擇培養(yǎng)基15～20mL輕輕搖勻，待凝固后倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件按表2的要求進(jìn)行。培養(yǎng)完成后，選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。從培養(yǎng)好的培養(yǎng)基上選取典型生長(zhǎng)的菌落在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)進(jìn)行劃線分離后進(jìn)行培養(yǎng)，得到純化的單菌落保存于試管的斜面培養(yǎng)基上，放入冰箱保存。

1.3.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌的菌落和個(gè)體形態(tài)特征觀察

對(duì)分離純化后的單個(gè)細(xì)菌的菌落形態(tài)（包括大小、形態(tài)、隆起程度、邊緣結(jié)構(gòu)、光澤度、透明度、表面形態(tài)、質(zhì)地等）進(jìn)行觀察、記錄［2］。此外，為了更好地觀察細(xì)菌的個(gè)體形態(tài)特征，對(duì)培養(yǎng)18～24h長(zhǎng)勢(shì)好的單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色實(shí)驗(yàn)，以更好地觀察菌株的個(gè)體形態(tài)、細(xì)胞間的排列方式、芽孢狀況和著生方式等。

1.3.2.2 優(yōu)勢(shì)腐敗菌的生理生化反應(yīng)

由于優(yōu)勢(shì)菌對(duì)不同的生理生化實(shí)驗(yàn)有不同的反應(yīng)，顯示出不同菌種的酶系，因此參照文獻(xiàn)［3，4］對(duì)各優(yōu)勢(shì)腐敗菌進(jìn)行過(guò)氧化物酶試驗(yàn)、氧化酶試驗(yàn)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)、葡萄糖氧化發(fā)酵試驗(yàn)，以鑒定出優(yōu)勢(shì)腐敗菌的科和屬。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行處理，圖表采用Chem－Window 6.0進(jìn)行制作。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 儲(chǔ)存過(guò)程中細(xì)菌菌落總數(shù)的變化

將真空包裝的雪菜肉絲放置于室溫（25±1）℃下，分別在0，3，7，14，21，28天隨機(jī)抽取一份樣品進(jìn)行菌落總數(shù)測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同儲(chǔ)藏時(shí)間段細(xì)菌菌落總數(shù)的測(cè)定結(jié)果Table 3 Determination results of the total number of bacterial colonies at different storage time

2.2 腐敗菌的確定

根據(jù)推薦的肉制品微生物鑒定圖譜，將各類選擇性培養(yǎng)基純化的菌株進(jìn)行菌落形態(tài)觀察，革蘭氏染色后鏡檢個(gè)體形態(tài)及生理生化試驗(yàn)，各類腐敗菌按照革蘭氏染色情況分成革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，結(jié)果見(jiàn)表4和表5。

表4 革蘭氏陽(yáng)性菌特征Table 4 The properties of gram－positive bacteria

續(xù) 表

表5 革蘭氏陰性菌特征Table 5 The properties of gram－negative bacteria

結(jié)合表4、表5及細(xì)菌的菌落特征、生理生化特征、形態(tài)特征，共分離和初步鑒定出典型菌株13株，可以初步分離鑒定到屬的有乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌各3株，熱殺索絲菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌各1株。

2.3 雪菜肉絲的初始菌相構(gòu)成

通過(guò)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)，雪菜肉絲的初始菌相由乳酸菌（30.1%）、假單胞菌（27.7%）、熱殺索絲菌（18.4%）、腸桿菌（14.5%）、葡萄球菌（4.2%）和酵母菌（1.23%）組成，初始菌相組成見(jiàn)圖1。

圖1 真空包裝雪菜肉絲的初始菌相分析Fig.1 Original bacteria flora analysis of vacuum－packed shredded pork with preserved vegetable

2.4 雪菜肉絲在室溫儲(chǔ)存過(guò)程中腐敗菌數(shù)量的變化儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)雪菜肉絲菌相的影響見(jiàn)圖2。

圖2 儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)雪菜肉絲菌相的影響Fig.2 Effects of storage time on shredded pork with preserved vegetable＇s bacteria flora

儲(chǔ)藏前期，熱殺索絲菌、乳酸菌、假單胞菌為主要的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，且乳酸菌、假單胞菌一直呈增長(zhǎng)態(tài)勢(shì)，而熱殺索絲菌、葡萄球菌、酵母菌在儲(chǔ)存14～21天后菌量開(kāi)始下降；腸桿菌雖然數(shù)量不多，但一直在穩(wěn)定增長(zhǎng)，原因是室溫條件比較適合腸桿菌的生長(zhǎng)。乳酸菌一直是雪菜肉絲的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，可能是因?yàn)檎婵瞻b環(huán)境和適宜的溫度為其生長(zhǎng)提供了較好的環(huán)境條件；此外，在儲(chǔ)藏過(guò)程中雪菜肉絲內(nèi)部不斷產(chǎn)生的乳酸和其他有機(jī)酸，降低了其pH值，抑制了其他腐敗菌的生長(zhǎng)。

3 總結(jié)

雪菜肉絲的初始菌相由乳酸菌（30.1%）、假單胞菌（27.7%）、熱殺索絲菌（18.4%）、腸桿菌（14.5%）、葡萄球菌（4.2%）和酵母菌（1.23%）組成。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：乳酸菌一直是雪菜肉絲的主要腐敗菌，一方面可能是因?yàn)檎婵瞻b的雪菜肉絲在儲(chǔ)藏過(guò)程中產(chǎn)生的酸和CO2抑制了其他好氧或兼性厭氧的微生物生長(zhǎng)；假單胞菌屬于革蘭氏陰性需氧嗜冷菌，不適應(yīng)真空低氧的環(huán)境，所以后期其生長(zhǎng)受到抑制；葡萄球菌的生長(zhǎng)在后期幾乎接近停滯狀態(tài)，這和真空低氧的環(huán)境分不開(kāi)。此外，通過(guò)對(duì)雪菜肉絲的主要優(yōu)勢(shì)腐敗菌群進(jìn)行分離、鑒定，初步分離鑒定到屬的有乳酸菌、假單胞菌、腸桿菌各3株，熱殺索絲菌、微球菌、葡萄球菌和酵母菌各1株，共13株。

研究雪菜肉絲的菌相組成可以為后繼的防腐工作提供理論基礎(chǔ)，為雪菜肉絲方便菜的生產(chǎn)企業(yè)提供理論參考，以達(dá)到延長(zhǎng)貨架期的目的。

［1］韓衍青，徐寶才，徐幸蓮，等.真空包裝熟肉制品中的特定腐敗微生物及其控制［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（7）：148－156.

［2］劉慧等.現(xiàn)代食品微生物學(xué)試驗(yàn)技術(shù)［M］.北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009.

［3］Brown M H.Meat microbiology［M］.London：Applied Science Publishers，1982：474－475.

［4］東秀珠，蔡妙英，王寶玲，等.常見(jiàn)的細(xì)菌鑒定手冊(cè)［M］.北京：科學(xué)出版社，2001：216－234.

Bacteria Flora Analysis and Preliminary Identification of Dominant Spoilage Bacteria in Vacuum－packed Shredded Pork with Preserved Vegetable

YAO Zhi－h(huán)ong，NIE Xiang－zhen，HUANGFU Qiu－xia，SHEN Li－yuan
（Food Science and Engineering College，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China）

Experimental results show that the preliminary dominant spoilage bacteria are composed of Lactobacillus（30.1%），Pseudomonas（27.7%），Brochothrix thermosphacta（18.4%），Enterobacterium（14.5%）at room temperature，the content of Staphylococcus（4.2%）and Saccharomycetes（1.23%）is small.In addition，cultivate and count the dominant spoilage bacteria of shredded pork with preserved vegetable at day 0，3，7，14，21，28respectively.The result shows that Lactobacillus，Pseudomonas and Brochothrix thermosphactaare the dominant spoilage bacteria in initial storage.However，after 14～21days，the content of Brochothrix thermosphacta，Staphylococcus and Saccharomycetes is decreasing，and the content of Lactobacillus has a rising trend.Though the number of Enterobacteriumis small at the early period，it maintains steady growth in the whole storage.

shredded pork with preserved vegetable；bacteria flora analysis；dominant spoilage bacteria

TS207.4

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.001

1000－9973（2017）04－0001－03

2016－10－15

要志宏（1993－），女，山西晉中人，碩士，主要從事食物成分與人體健康方面的研究。