響應面法優化瑞士乳桿菌產蛋白酶培養條件

龐豐平，霍乃蕊

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801；2.山西農業大學動物科技學院，山西晉中 030801）

響應面法優化瑞士乳桿菌產蛋白酶培養條件

龐豐平1，霍乃蕊2＊

（1.山西農業大學食品科學與工程學院，山西晉中 030801；2.山西農業大學動物科技學院，山西晉中 030801）

為充分應用乳酸菌的產蛋白酶特性，本研究采用響應面分析法對瑞士乳桿菌產蛋白酶的培養條件進行優化。首先通過Plackett－Burman試驗從7種因素中篩選發酵溫度、發酵時間、起始pH為影響瑞士乳桿菌產蛋白酶的重要因素。進一步通過響應面分析得出最優產酶條件：發酵溫度36℃、發酵時間16h、起始pH 6.65，瑞士乳桿菌的產蛋白酶活力為16.81U／mL和22.59U／mL，提高了34.4%，與預測結果接近，表明培養條件的優化有效，該發酵液為瑞士乳桿菌和所產蛋白酶的同步固定化研究提供了原料，也為瑞士乳桿菌產蛋白酶的應用研究奠定了基礎。

瑞士乳桿菌；培養條件；蛋白酶

乳酸菌是世界公認級和安全級的益生菌，用于食品加工的歷史久遠。蛋白酶是一種催化蛋白質中肽鍵水解的酶，微生物是蛋白酶的主要來源之一，多由細菌和霉菌生產。

不同種屬的乳酸菌菌株所分泌的蛋白酶分子量差異很大，介于30～200kDa，最適溫度范圍一般為40～50℃，最適pH接近中性（pH 5～8）［1，2］。乳酸菌蛋白酶可以分為PrtP（L.lactis和L.paracasei），PrtH（L.helveticus），PrtR（L.rhamnosus），PrtS（St.thermophilus）和PrtB（L.bulgaricus）5種，瑞士乳桿菌蛋白酶屬于PrtH。不同種屬的乳酸菌表達的細胞壁蛋白酶的類型不同，通常乳酸菌只分泌一種細胞壁蛋白酶，而瑞士乳桿菌卻表達兩種［3］。與傳統發酵劑相比，瑞士乳桿菌有較強的蛋白水解活性，可用于制備多種活性肽。

目前提高乳酸菌蛋白酶活力的有效途徑之一便是優化產酶培養條件。單因素試驗或正交試驗對培養條件優化時，得不到整個區域各因素的最佳組合和最優值［4］，而響應面法則可以。嗜酸乳桿菌產細胞壁蛋白酶的培養條件優化時，將單因素試驗結果、正交試驗結果以及響應面法優化結果進行比較，證實響應面法結果是最優的［5］。借助響應面分析軟件能快速、可靠地進行優化實驗安排和統計分析［6］。本研究利用響應面法對瑞士乳桿菌產蛋白酶的液體發酵培養條件進行優化，為瑞士乳桿菌蛋白酶的進一步利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus） 中國菌種保藏中心；MRS肉湯 北京奧博星生物技術有限責任公司；乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸鈉、無水碳酸鈉、三氯醋酸、酪素、L－酪氨酸等其他試劑均為分析純。

722可見光分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；PHS－3C型精密pH計 上海雷磁分析儀器廠；HF160WHeal Force二氧化碳培養箱，臺式高速冷凍離心機 香港力康生物醫療科技控股集團；HFsafe－1200LC 上海力申科學儀器有限公司；Lambda 850紫外可見分光光度計 美國Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 培養方法

將瑞士乳桿菌凍干粉接入MRS液體培養基中，37℃培養24h，連續轉接活化2代，以1%（V／V）接種量接入三角瓶中進行增殖培養，按需將菌體培養液取出。

1.2.2 粗酶液制備

將菌液按3%的接種量接種于新鮮的MRS肉湯培養基中，厭氧培養36h。取8mL發酵液于10mL離心管中，4℃，5000r／min離心10min，取上清液作為測定蛋白酶活力所需粗酶液［7］。

1.2.3 蛋白酶活力的測定

參照GB／T 23527－2009《蛋白酶制劑》中蛋白酶活力的測定，采用福林法，每個樣品做3個平行，取平均值［8］。

1.2.4 優化方法

采用Plackett－Burman設計法從培養時間、溫度等7個影響因素中確定3個最主要因素，然后以響應面分析法（Design Expert）對此3個因素進行優化。

2 結果與分析

2.1 L－酪氨酸標準曲線

圖1 L－酪氨酸標準曲線Fig.1 L－tyrosine standard curve

由圖1可得線性回歸方程為：y＝0.01205x－0.0185，R2＝0.99779，可信度較高，可以應用。

2.2 Plackett－Burman設計法篩選重要因素

結合瑞士乳桿菌發酵特性和已有的研究成果［9］，對影響瑞士乳桿菌產酶的7個因素X1～X7進行兩水平，高水平取低水平的1.25倍，Plackett－Burman試驗因素水平表見表1。X1菌齡（h）的－1和1水平分別為16和20；X2培養溫度（℃）的兩水平分別為30和37.5；X3接種量（%）的兩水平分別為2和2.5；X4培養體積（mL）的兩水平分別為40和50；X5培養時間（h）的兩水平分別為20和25；X6初始pH的兩水平分別為6和7.5；X7生長因子（%）的兩水平分別為5和6.25。以每毫升酶液的蛋白酶活力作為響應值Y，Plackett－Burman試驗設計與結果見表2。

表1 Plackett－Burman試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman experiment

表2 Plackett－Burman試驗設計與結果Table 2Design and test results of Plackett－Burman

對表2中的結果進行t檢驗，分析各因素的主效應，見表3。

表3 各因素影響的主效應分析Table 3 Main effect analysis of various influence factors

由表3可知，7種培養條件對瑞士乳桿菌產蛋白酶影響的顯著性排列為：培養溫度＞培養時間＞起始pH＞菌齡＞培養體積＞接種量＞生長因子。其中，培養溫度、培養時間、起始pH影響最為顯著，故作為響應面優化的因素。

2.3 響應面優化

根據Box－Behnken中心組合設計原理［10］，設計三因素三水平共15個試驗點的響應面分析試驗，其中12個是析因點，3個零點重復，用以估計試驗誤差，以每毫升酶液的蛋白酶活力為響應值Y。培養溫度的3個水平分別為30，37，45℃；培養時間的3個水平分別為12，16，24h；初始pH的3個水平分別為6，7.5，9，試驗設計及結果見表4。

表4 Box－Behnken試驗設計與結果Table 4 Experimental design and results of Box－Behnken

根據表4的試驗結果，通過響應面軟件處理確定回歸方程：Y＝28.39＋1.36X1＋2.12X2＋1.23X3＋0.49X1X2＋0.83X1X3＋2.31X2X3－9.74X12－3.78X22－2.61X32。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis for the variance of regression equation

由表5可知，二次項對響應值的影響極顯著，模型P＜0.05，差異顯著，失擬項反映的是實驗數據與模型不相符的情況，P＝0.5203＞0.05，失擬項不顯著，因此模型選擇正確。

表6 模型的可信度分析Table 6 Reliability analysis of the model

由表6可知，復相關系數R2＝0.9460，說明模型可解釋94.60%，即實驗所得的酶活力變化，表明方程擬合較好。Y的變異系數CV表示實驗的精確度，CV值越高，實驗的可靠性越低，本實驗中CV＝1.9327，較低，說明試驗操作可信。

響應面分析圖見圖2～圖4。

圖2 x1，x2對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y＝（x1，x2）

圖3 x1，x3對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y＝（x1，x3）

圖4 x2，x3對Y值預測響應面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of Y＝（x2，x3）

由圖2～圖4響應面的分析可知，3個因素均有最優值，即培養溫度36℃，發酵時間16h，起始pH 6.65，在此點預測的酶活力為24.73U／mL。在其余培養基成分和培養條件不變的情況下，在初始發酵條件和優化發酵條件下進行驗證實驗，培養1天后，酶活力分別為16.81U／mL和22.59U／mL，條件優化后酶活力提高了34.4%，與預測結果接近，說明培養條件的優化有效。

3 討論

本研究通過二水平設計的Plackett－Burman試驗分析了7種因素對瑞士乳桿菌產蛋白酶活力的影響，利用響應面法對瑞士乳桿菌產蛋白酶的培養條件進行了優化，在該優化培養條件下，酶活力達22.59U／mL，較初始培養條件提高了34.4%，增幅較大。張重陽等［11］僅對瑞士乳桿菌產蛋白酶的培養和提取條件進行了研究，并沒有得出較為準確細致的培養條件。張瑩等［12］利用正交試驗對瑞士乳桿菌的產蛋白酶發酵條件進行了優化研究，優化后的產蛋白酶活力特別低，只有62.136U／mL。響應面法優化瑞士乳桿菌的產蛋白酶培養條件，其產蛋白酶特性進一步提高，為瑞士乳桿菌蛋白酶的開發和研究提供了依據，此發酵液也可用于瑞士乳桿菌及其蛋白酶固定化的研究。由于瑞士乳桿菌有較強的蛋白水解活性，也可研究制備多種活性肽。食源性降血壓多肽具有作用溫和、安全性高及生物功能多樣性等特點，這為通過非藥物治療和緩解高血壓提拱了新途徑，滿足了高血壓人群居高不下且難以治愈的客觀需求，也可以將其制品作為功能因子添加劑添加到食品中。

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Optimization of Culture Conditions of Protease Produced by Lactobacillus helveticus Using Response Surface Methodology

PANG Feng－ping1，HUO Nai－rui2＊
（1.College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China；2.College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

In order to make full application of protease properties of lactic acid bacteria，optimize the culture conditions of Lactobacillus helveticus produced protease using response surface methodology.Firstly，screen seven factors by Plackett－Burman experiment.The fermentation temperature，fermentation time，initial pH are important factors affecting the yield of Lactobacillus helveticus produced protease.Use response surface methodology to obtain the optimum conditions for enzyme production：fermentation temperature of 36℃，fermentation time of 16h，initial pH of 6.65，the protease activity produced by Lactobacillus helveticus is 16.81U／mL and 22.59U／mL，improved by 34.4%，and it is close to the forecasted results，indicating that the optimization of culture conditions is effective，the fermentation broth has provided materials for Lactobacillus helveticus and immobilized and simultaneous research of protease，it has also laid a foundation for the applicaticn of Lactobacillus helveticus produced protease production.

Lactobacillus helveticus；culture conditions；protease

TS201.56

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.002

1000－9973（2017）04－0004－05

2016－10－16 ＊通訊作者

山西省人社廳留學人員科技活動擇優資助項目（2014年度）；山西省回國留學人員項目（2014－042）

龐豐平（1991－），男，山西臨汾人，碩士，研究方向：食品生物技術；霍乃蕊（1972－），女，山西平遙人，教授，博士，主要從事生物技術與食品安全方面的教學與科研工作。