傳統豆瓣辣醬發酵過程細菌群落演替與發酵過程的對應關系

于松峰，鄭宇，楊帥，謝曉林，王敏

（天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

傳統豆瓣辣醬發酵過程細菌群落演替與發酵過程的對應關系

于松峰，鄭宇，楊帥，謝曉林，王敏＊

（天津科技大學生物工程學院工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

傳統豆瓣辣醬發酵采用開放式自然發酵工藝，發酵過程微生物群落組成復雜，完成蛋白質、糖類、脂肪等大分子的降解，并代謝產生多種風味物質，賦予豆瓣辣醬醬酯香濃郁、味鮮辣醇和的獨特口感。文章對寧夏豆瓣辣醬發酵過程中細菌群落組成和發酵過程主要參數進行了分析，利用典范對應分析（CCA）的方法對寧夏豆瓣辣醬發酵過程中微生物和發酵過程主要參數的相關性進行了研究。利用變性梯度凝膠電泳（PCR－DGGE）技術分析了豆瓣辣醬長達2年發酵時間細菌群落組成的變化，共檢測出細菌22種，包括乳桿菌屬3種，明串珠菌屬2種，魏斯式菌屬3種，芽孢桿菌屬3種，克雷伯菌屬2種等，細菌多樣性呈先減少后增加的趨勢。

豆瓣辣醬；傳統發酵食品；變性梯度凝膠電泳；微生物群落；典范對應分析

中國傳統豆瓣辣醬是以脫殼的蠶豆瓣、辣椒、食鹽、面粉為主要原料，經制曲、微生物發酵而制成的傳統調味醬，它以色澤油潤紅亮、醬酯香濃郁、味鮮辣醇和、體態粘稠絨實等特點而著稱，能夠增加菜肴的色、香、味、形，從而受到廣大消費者的喜愛［1］。豆瓣辣醬生產普遍采用傳統的開放式發酵工藝，經甜瓣子制作、辣椒胚制作及混合后發酵生香三個重要階段完成豆瓣辣醬的發酵，醬醅顏色逐漸由白色變為深褐色。發酵過程微生物群落消長演替，完成了蛋白質、糖類、脂肪等大分子降解，不僅提高了產品的營養價值，還形成了產品特有的風味和滋味。豆瓣辣醬發酵過程有乳酸菌、芽孢桿菌屬、嗜鹽四聯球菌、魯氏酵母等多種微生物參與其發酵過程［2－5］。傳統豆瓣辣醬微生物菌群主要采用實驗室分離分析的方法，近年來，隨著科學技術的發展，PCR－DGGE等分子生物學技術常應用于傳統發酵食品分析微生物群落組成分析［6，7］。采用DGGE技術不需要對樣品微生物進行培養，具有可靠性高、速度快、重復性強、能夠彌補傳統方法分析微生物群落的不足和局限性等多種優點。

根據GB／T 20560－2006《地理標志產品郫縣豆瓣》要求，pH、總酸、氨基酸態氮和食鹽是其主要理化指標，對產品的品質有較大的影響。鮮、咸是豆瓣辣醬的重要指標，其指標一般用氨基酸態氮和氯化鈉含量表示。寧夏豆瓣辣醬不用達到郫縣豆瓣要求，但其是主要指標。豆瓣辣醬生產過程中的成分變化與微生物菌群的變化密不可分［8］。發酵過程中微生物在所產酶的作用下分解原料生成脂肪酸、有機酸和氨基酸等，并代謝產生乳酸、酒精以及多種風味物質［9］，對醬醅體系pH值和產品風味產生影響。微生物群落組成決定了發酵過程中化合物的組成和變化，反過來鹽度、水分等環境因子對微生物的生長也有重要影響［10］。

本文采用DGGE技術對寧夏豆瓣辣醬發酵過程細菌菌群演替進行分析，在此基礎上首次采用CCA方法分析微生物群落組成與發酵過程主要參數之間的關系，研究結果將為進一步理解傳統豆瓣辣醬發酵機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

從生產車間分別采集豆瓣辣醬發酵7，90，180， 270，390，720天的樣品，自發酵池表面30cm處五點法取樣，混勻裝入無菌瓶中，6個階段的樣品依次標記為＃1，＃2……＃6，每個樣品3個平行。采集后的樣品立即放入冰盒中運回實驗室，保存于4℃冰箱中。

1.2 實驗方法

1.2.1 豆瓣辣醬發酵過程主要參數變化

采集傳統豆瓣辣醬樣品，對國標中注明的pH、總酸、氨基酸態氮以及食鹽、水分等參數進行測定，分析其在2年發酵期間的變化。

1.2.2 豆瓣辣醬發酵過程細菌群落組成分析

1.2.2.1 樣品總DNA的提取和細菌16SrDNA V3區的擴增

取豆瓣辣醬樣品10.0g，放入50mL的無菌離心管中，加入一定量的PBS無菌水，漩渦振蕩5～10min，然后用滅過菌的紗布過濾，2000r／min離心2min，取上清液，8000r／min離心15min，棄去上清液，用PBS洗滌沉淀，8000r／min離心15min，棄去上清液，收集菌體［11］。

采用深加工食品DNA提取試劑盒按照說明書提取豆瓣辣醬樣品的基因組。以提取豆瓣辣醬樣品的宏基因組DNA為模板，進行細菌16SrDNA V3區PCR擴增，引物為338f－GC和518r［12］。PCR反應體系（50μL）：上下游引物各0.2μmol／L，0.2mmol／L dNTPs，5μL 10×Ex Taq buffer，0.025UEx Taq HS DNA聚合酶，1μL DNA（＜500ng），補ddH2O至50μL。

PCR擴增條件：94℃預變性5min；20個循環（每個循環退火溫度降0.5℃）：94℃變性1min，62～52℃退火45s，72℃延伸1min；15個循環：94℃變性1min，52℃退火45s，72℃延伸1min；72℃終延伸10min。PCR產物用3%（W／V）的瓊脂糖進行凝膠電泳檢測。

1.2.2.2 細菌群落組成分析

采用Bio－Rad Dcode突變檢測系統，對樣品提取DNA的PCR產物進行DGGE檢測。丙烯酰胺凝膠濃度為8%，細菌16SrDNA片段的變性膠濃度為30%～60%，待膠凝固后，將膠板放入電泳裝置中，加入1×TAE電泳緩沖液，設置電泳溫度為60℃，每個加樣孔點樣30μL，80V電泳11h［13］。

電泳結束后，將膠卸下放入Dugreen染色液中染色30min，用凝膠成像儀觀察DGGE膠，并拍照。

在紫外照射下，用滅菌刀進行切割回收目的條帶，加入50μL無菌水4℃過夜，然后以其為模板進行無GC－發卡的PCR擴增。PCR擴增程序：94℃預變性5min；30個循環：94℃變性1min，55℃退火45s，72℃延伸1min；72℃終延伸10min。將PCR產物送至金唯智生物科技有限公司進行測序。所得序列在GeneBank數據庫中進行檢索和同源性比較。

1.2.2.3 發酵過程細菌多樣性分析

采用軟件Quantity One讀取DGGE圖譜上不同條帶的光密度值，并進行UPMGA（非加權組平均算法）聚類分析。并根據DGGE數字化后的數據計算微生物多樣性指數，包括Berger－Parker指數（d）、Mar galef指數（dMa）、Simpson指數（D）、Shannon指數（H＇）、Pielou指數（Je）。其中Berger－Parker指數（d）用來表示物種的優勢度，Mar galef指數（dMa）用來表示物種的豐富度，Simpson指數（D）用來度量物種多樣性的概率，Shannon指數（H＇）用來說明群落多樣性的高低，而Pielou指數（Je）用來表示群落的均勻程度，其計算公式［14，15］見表1。

表1 多樣性指數計算公式Table 1 The caculation formula of diversity indexes

1.2.3 典范對應分析

建立兩個矩陣，微生物豐度矩陣和主要參數矩陣，矩陣行為發酵時間，列為物種。微生物豐度數據統一使用百分比，不同主要參數之間如果存在單位不同的情況需先將數據標準化處理以消除不同量綱之間的影響，再利用Canoco for Windows 4.5用于典范對應分析，數據標準化采用SPSS 19.0。

1.3 分析方法

稱取約10.0g已研磨均勻的樣品置于100mL小燒杯中，加入50mL水，充分攪拌移入容量瓶中定容至100mL，混勻過濾得到樣品稀釋液備用?？偹帷被鶓B氮和食鹽根據GB／T 5009.40－2003中規定的方法進行測定。

1.3.1 水分含量的測定

采用直接干燥法，參照GB 5009.3－2010規定的方法測定。

1.3.2 pH值的測定

使用pH計測定［16］：稱取1.0g左右樣品于25mL小燒杯中，加入蒸餾水10mL，用玻璃棒充分攪拌，靜置10～15min，測量上清液的pH值，重復3次求平均值。

2 結果與分析

2.1 寧夏豆瓣辣醬發酵過程主要參數變化規律

對豆瓣辣醬樣品的pH、總酸、氨基酸態氮、食鹽和水分進行了分析。豆瓣辣醬發酵過程曲線見圖1。

圖1 豆瓣辣醬發酵過程曲線Fig.1 The fermentation process curve of spicy bean paste

由圖1可知，在豆瓣辣醬發酵過程中水分含量呈現逐漸降低的趨勢，與起始發酵相比，發酵結束時水分減少了28.48%。由于水分的揮發，食鹽含量呈現逐漸增加的趨勢。食鹽濃度是豆瓣辣醬發酵過程的重要參數，一定的鹽度可以抑制污染微生物的生長，一些耐鹽微生物能夠生長代謝，完成發酵過程，因此發酵過程需要根據鹽度及水分變化補充一定量的鹽水，從而保證發酵順利進行［17］。發酵過程豆瓣辣醬的總酸含量在前270天逐漸上升，最高達到（1.44±0.05）g／100g，隨后略有下降。pH值在整個豆瓣辣醬發酵過程中維持在4.43～4.61之間，變化趨勢與總酸的變化趨勢一致。氨基酸是豆瓣辣醬最主要的一類風味物質，是評判豆瓣辣醬質量的重要指標［18，19］。在豆瓣辣醬發酵階段，氨基酸態氮含量變化趨勢呈現出先增加后降低的趨勢，在發酵270天時其含量達到最高（0.61±0.09）g／100g，此后維持在0.44～0.46g／100g之間。

2.2 發酵過程細菌群落組成分析

2.2.1 發酵過程細菌群落DGGE分析

對豆瓣辣醬發酵過程不同發酵時期的樣品進行DGGE分析，不同位置的條帶代表不同種屬的細菌，條帶的熒光強度則反映該細菌的豐富度。條帶粗黑，則該種細菌的相對濃度較高，反之則較小，結果見圖2。

圖2 寧夏豆瓣辣醬發酵過程中細菌群落DGGE分析圖譜Fig.2 DGGE profiles of bacterial community during fermentation process of Ningxia spicy bean paste

共檢測到22個條帶，將其切膠回收后擴增測序，PCR產物測序結果比對見表2。

表2 細菌群落組成分析Table 2 Analysis of the bacterial community composition

續 表

2.2.2 細菌DGGE圖譜聚類分析

根據DGGE圖譜數字化后的數據，采用UPMGA算法對豆瓣辣醬發酵過程中微生物群落DGGE指紋圖譜進行聚類分析，結果見圖3。

圖3 基于細菌DGGE圖譜的UPMGA聚類分析Fig.3 Cluster analysis of bacterial community based on DGGE profiles

由圖3可知，隨著豆瓣辣醬發酵的進行，豆瓣辣醬發酵細菌群落相似度分為豆瓣辣醬發酵7天（＃1），豆瓣辣醬發酵90，180，270，390天（＃2，＃3，＃4，＃5），豆瓣辣醬發酵720天（＃6）三類。豆瓣辣醬發酵720天（＃6）和其他發酵階段的樣品相似性為0.53，說明豆瓣辣醬發酵720天微生物組成與其他階段差異較大。隨著發酵的進行，營養物質被微生物大量利用，同時豆瓣辣醬樣品中水分含量低、食鹽含量高，使得大部分微生物不能在此環境生長。豆瓣辣醬發酵中期樣品相似性較高，表明樣品之間的微生物群落結構相似。

2.2.3 細菌群落多樣性分析

結合DGGE圖譜的數據，對寧夏豆瓣辣醬發酵過程中細菌群落多樣性進行了分析，結果見圖4。

圖4 細菌群落組成多樣性分析Fig.4 Diversity analysis of bacterial community composition

由圖4可知，豆瓣辣醬發酵初期（7，90天）的物種優勢度指數（d）和物種豐富度指數（dMa）相比豆瓣辣醬發酵后期較高。分析表明：Shannon指數（H＇）和物種豐富度指數（dMa）變化趨勢相同，豆瓣辣醬發酵過程主要為乳酸菌和芽孢桿菌屬，其種類和數量先減少后增加，多樣性指數（H＇）和豐富度指數（dMa）先降低后升高。物種均勻度指數（Je）在寧夏豆瓣辣醬發酵過程差異不大。

由于豆瓣辣醬發酵初期是甜瓣子發酵結束與辣椒胚發酵結束的樣品混合后進行發酵，甜瓣子階段和辣椒胚階段的微生物被帶進豆瓣辣醬發酵體系，因此發酵初期的微生物種類較為豐富。導致豆瓣辣椒醬發酵過程中微生物多樣性發生變化的主要原因是豆瓣辣醬發酵過程中水分、食鹽含量及營養物質的變化。發酵初期豆瓣辣醬中含有豐富的淀粉類等營養物質，且食鹽含量較低，隨著發酵的進行，營養物質逐漸被微生物利用，食鹽含量逐漸升高，從而影響了微生物群落的組成及演替。

2.3 CCA對應分析微生物群落與主要參數之間的對應關系

豆瓣辣醬發酵過程中微生物的種類和數量在不斷發生著變化，食鹽、總酸和氨基態氮含量的變化影響著微生物的消長。以細菌群落組成作為物種數據，以發酵過程中主要參數數據作為環境變量，進行了CCA對應分析，從微生物生態學的角度，解析微生物群落與主要參數之間的對應關系。

表3 CCA分析信息Table 3 Analysis information of CCA

由表3可知，排序結果能夠較好地反映微生物組成與主要參數的相互關系。

CCA對應分析微生物群落與主要參數的對應關系圖譜見圖5，微生物隨豆瓣辣醬發酵的進行分為A，B，C，D 4個區域。A區域包括了豆瓣辣醬發酵7天（＃1）的樣品，該區域分布的細菌只出現在發酵初期（7天），且與各主要參數呈負相關關系，主要的細菌為Weissella confusa（b），Klebsiella oxytoca（c），Lactobacillus siliginis（j），Klebsiella quasipneumoniae（m），Bacillus atrophaeus（r），Anaerovibrio lipolyticus（s）。B區域只有豆瓣辣醬發酵90天（＃2）的樣品，分布的細菌為Staphylococcus equorum（i），Vagococcus fluvialis（k），Bacillus amyloliquefaciens（p），Streptococcus pasteurianus（u），Chroococcidiopsis thermalis（v），C區域包括了豆瓣辣醬發酵180天（＃3）、270天（＃4）的樣品，分布的細菌為Leuconostoc mesenteroides（a），Lactobacillus plantarum（d），Weissella diestrammenae（f），Lactobacillus acidifarinae（g），Leuconostoc citreum（h），Rivicola pingtungensis（t），B和C區域分布的細菌是豆瓣辣醬發酵過程中的優勢菌。

圖5 CCA分析微生物群落與主要參數Fig.5 CCA analysis of bacterial community and main parameters

由圖5可知，B和C區域的細菌對氨基態氮、總酸和pH貢獻較大，且B區域的細菌對氨基態氮和總酸貢獻較大，C區域的細菌對pH貢獻較大。總酸和氨基態氮在一定程度上能夠反映豆瓣辣醬的質量，在發酵過程中受到微生物影響較大。D區域分布的細菌與食鹽和水分呈正相關關系，說明水分和食鹽含量的變化對D區域分布的細菌影響較大。D區域的細菌包括豆瓣辣醬發酵390天（＃5）和豆瓣辣醬發酵720天（＃6）的樣品，分布的細菌為Weissella viridescens（e），Tetragenococcus halophilus（l），Bacillus ginsengihumi（n），Proteus mirabilis（o），Lentibacillus salicamp（q）。

3 結論

采用PCR－DGGE方法分析了寧夏豆瓣辣醬在2年發酵期間微生物群落組成及主要參數的變化。在發酵過程中檢測到22種細菌，乳酸菌是主要的優勢菌，其相對豐度高達40.91%。隨著發酵的進行，氨基酸態氮呈先增加后降低的趨勢，CCA對應分析結果表明：發酵過程中對總酸和氨基酸態氮貢獻較大的細菌依次為Leuconostoc mesenteroides，Weissella diestrammenae，Vagococcus fluvialis，Bacillus amyloliquefaciens，Lactobacillus plantarum，Leuconostoc citreum，Lactobacillus acidifarinae。食鹽和水分與Weissella viridescens，Lentibacillus salicampi，Bacillus ginsengihumi，Tetragenococcus halophilus的濃度變化相關。

［1］韓永奇.關于提升郫縣豆瓣品牌力的市場觀察與思考［J］.中國調味品，2009，34（6）：115－117.

［2］Kim T W，Lee J H，Park M H，et al.Analysis of bacterial and fungal communities in Japanese and Chinese fermented soybean pastes using nested PCR－DGGE［J］.Current Microbiology，2010，60（5）：315－320.

［3］Wu J R，Zhang J C，Shi P，et al.Bacterial community involved in traditional fermented soybean paste Dajiang made in northeast China［J］.Annals of Microbiology，2013，63（4）：1－5.

［4］Zhao J，Dai X，Liu X，et al.Changes in microbial community during Chinese traditional soybean paste fermentation［J］.International Journal of Food Science ＆Technology，2009，44（12）：2526－2530.

［5］Nam Y D，Lee S Y，Lim S I.Microbial community analysis of Korean soybean pastes by next－generation sequencing［J］.International Journal of Food Microbiology，2012，155（1－2）：36－42.

［6］Park E J，Chun J，Cha C J，et al.Bacterial community analysis during fermentation of ten representative kinds of kimchi with barcoded pyrosequencing［J］.Food Microbiology，2012，30（1）：197－204.

［7］Tanaka Y，Watanabe J，Mogi Y.Monitoring of the microbial communities involved in the soy sauce manufacturing process by PCR－denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Food Microbiology，2012，31（1）：100－106.

［8］趙建新.傳統豆醬發酵過程分析與控制發酵的研究［D］.無錫：江南大學，2011.

［9］康明官.中外著名發酵食品生產工藝手冊［M］.北京：化學工業出版社，2001.

［10］杜宏福，聶志強，劉賢，等.山西老陳醋發酵過程中細菌群落組成與有機酸變化的關系研究［J］.中國調味品，2015，40（7）：26－31.

［11］鄒艷玲.后熟期郫縣豆瓣細菌多樣性分析及產品護色研究［D］.成都：西華大學，2013.

［12］Nie Z，Zheng Y，Wang M，et al.Exploring microbial succession and diversity During solid－state fermentation of Tianjin Duliu mature vinegar［J］.Bioresource Technology，2013，148（8）325－333.

［13］Haruta S，Ueno S，Egawa I，et al.Succession of bacterial and fungal communities during a traditional pot fermentation of rice vinegar assessed by PCR－mediated denaturing gradient gel electrophoresis［J］.Food Microbiol，2006，109（1－2）：79－87.

［14］Shannon C E.A mathematical theory of communication［M］.New York：McGraw－Hill，1974：53－55.

［15］孔凡洲，于仁成，徐子鈞，等.應用Excel軟件計算生物多樣性指數［J］.海洋科學，2012，36（4）：57－62.

［16］劉永琪.豆瓣醬發酵的研究［D］.廣州：華南理工大學，2014.

［17］張忠剛.永豐辣醬自然發酵的菌相與成分分析及人工接種發酵工藝研究［D］.長沙：湖南農業大學，2007.

［18］Jiang J J，Zeng Q X，Zhu Z W，et al.Chemical and sensory changes associated Yu－lu fermentation process－a traditional Chinese fish sauce［J］.Food Chemistry，2007，104（4）：1629－1634.

［19］Hjalmarsson G H，Park J W，Kristbergsson K.Seasonal effects on the physicochemical characteristics of fish sauce made from capelin（Mallotus villosus）［J］.Food Chemistry，2007，103（2）：495－504.

Analysis of the Relationship between Bacterial Community Succession and Fermentation Process of Chinese Traditional Spicy Bean Paste

YU Song－feng，ZHENG Yu，YANG Shuai，XIE Xiao－Lin，WANG Min＊
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China）

Chinese traditional spicy bean paste is produced by traditional spontaneous fermentation technology.The complex micro－organism community completes the degradation of protein，carbohydrate，fat and other substances and produces the unique taste of spicy bean psate.In this research，the relationship between the composition and succession of bacterial community and the parameters during fermentation process of spicy bean paste are analyzed by canonical correspondence analysis（CCA）.22species of bacteria，containing 3 Lactobacillus，2 Leuconostoc，3 Weissella，3 Bacillus，2 Klebsiella，etc.are detected by using the method PCR－DGGE（deformation gradient gel electrophoresis）.The bacterial diversity decreases at the early stage of fermentation，and then increases.

spicy bean paste；traditional fermented food；denaturing gradient gel electrophoresis；microbial community；canonical correspondence analysis

TS201.5

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.012

1000－9973（2017）04－0053－06

2016－10－20 ＊通訊作者

國家高技術研究發展計劃（863計劃）課題（2013AA102106）；國家重點研發計劃（2016YFD0400505）

于松峰（1990－），男，碩士，研究方向：傳統發酵食品發酵技術；王敏（1971－），女，教授，博士生導師，研究方向：食品發酵微生物功能分析與發酵技術。