藍莓提取物中功效成分含量測定方法的探討

曾榮華，劉翠紅，羅明琍，李菁，王小妹

（中藥提取分離過程現代化國家工程研究中心，廣州白云山漢方現代藥業有限公司，廣東廣州510240）

藍莓提取物中功效成分含量測定方法的探討

曾榮華，劉翠紅，羅明琍，李菁，王小妹

（中藥提取分離過程現代化國家工程研究中心，廣州白云山漢方現代藥業有限公司，廣東廣州510240）

對藍莓提取物開展原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量測定。以保健食品中原花青素、前花青素含量測定方法及國際商務部標準測定原花青素，前花青素，花青素、花色苷含量。藍莓提取物中測定原花青素含量是127.8%，前花青素含量是226.8%，花青素含量25.4%，花色苷含量未測出，藍莓提取物中以花青素類含量測定方法較合適。

藍莓提取物；原花青素；花青素

藍莓含有大量的花色苷、類黃酮等多酚類生理活性成分，其抗氧化能力很強，具有促進視紅素再合成、抗炎癥、提高免疫力、抗心血管疾病、抗衰老、抗癌等多種生理功效[1]，在食品、醫藥、健康產品等領域中應用已經是熱點和焦點之一。以藍莓為主要原料開發的產品集中于保護視力，但是功效成分報道有以花青素、花色苷、原花青素或前花青素為功效性成分，說法各不一，未有明確功效成分指標。

花青素、花色苷屬于生物類黃酮物質，花色苷是花青素接上各種糖基后的衍生物，而原花青素、前花青素是多酚類聚合物，這幾種功效成分結構截然不同。本研究目的是采用原花青素方法、前花青素、花青素及花色苷方法對藍莓中功效成分進行含量測定，以確定適宜的功效成分含量測定方法，明確藍莓中功效成分標示。同時本研究為其它同類產品選擇功效成分提供一種指標標示的參考。

1 材料

1.1 儀器與試劑

UV-2550型紫外分光光度計：日本島津；2695型高效液相色譜儀：美國Waters公司；藍莓提取物、原花青素對照品（純度＞95%）：尖峰天然產物研究開發有限公司；歐洲越橘提取物對照品（批號：Y0001059）：歐洲藥典；甲醇、鹽酸等分析純。

2 方法與結果

2.1 藍莓提取物中測定原花青素含量

對照品制備方法：取原花青素對照品13.68 mg，至10 mL容量瓶中，吸取該溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，各取1 mL測定。將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混合后，取出6 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.2 mL硫酸鐵銨溶液和1 mL對照品溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，在加熱完畢15 min后，于546 nm波長處測吸光值。

樣品制備方法：取樣品50 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲20 min，放冷到室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，放置澄清后取上清液2 mL，用甲醇定容至25 mL。與對照品測定方法相同，由標準曲線計算原花青素的含量。藍莓提取物中的原花青素含量測定結果見表1。

表1 藍莓提取物中的原花青素含量測定結果Table 1 Determination of proanthocyanidins in blueberry extracts

由表1的測定數據可知：用保健食品中的測定原花青素方法測定藍莓中的原花青素，原花青素是127.8%，遠超過樣品的本身含量，因藍莓提取物溶解于甲醇中，顯紫紅色，而原花青素對照品甲醇溶液沒有顏色，在進行紫外測定吸光值時，導致藍莓中的原花青素測定值偏高，此方法不適合應用于有顏色的原料或產品中原花青素含量測定。

2.2 藍莓提取物中測定前花青素含量

測定方法：保健食品中前花青素的測定[3]。

精密稱定對照品10 mg原花青素標準品（因無前花青素對照品，采用原花青素對照品），用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中。

吸取該溶液0、0.1、0.25、0.5、1.0、1.5 mL置于10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。各取2 mL測定。

將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比混后，取出15 mL置于具塞錐瓶中，再加入0.5 mL硫酸鐵銨溶液和2 mL試樣溶液，混勻，置沸水浴回流，精確加熱40 min后，立即置冰水中冷卻，經0.45 μm濾膜過濾后，待進高效液相色譜分析。

取樣品25 mg置于50 mL容量瓶中，加入30 mL甲醇超聲20 min，放冷到室溫后，加甲醇至刻度，搖勻，取1 mL至10 mL，定容。處理方法同對照品。藍莓提取物中的前花青素含量測定結果見表2。

2.3 術前準備 術前3 d給予流質飲食。手術前晚做好腸道及術區皮膚準備，清潔灌腸、床上擦浴、供皮區及受皮區備皮。術日當天禁食。

圖1 前花青素對照品液相圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of procyanidins standard

表2 藍莓提取物中的前花青素含量測定結果Table 2 Determination of procyanidins in blueberry extracts

前花青素對照品液相圖譜見圖1，藍莓提取物前花青素液相色譜圖見圖2。

由圖1與圖2可知，前花青素對照品與藍莓提取物前花青素對照品色譜圖出峰位置一致，峰形一致，是因為測定方法的原理是依據試樣中前花青素單體或聚合物在加熱的酸性條件和鐵鹽催化作用下，C-C鍵斷裂而生成深紅色花青素離子即氰定的原理，藍莓中以花青素為主，原花青素氰定后也以花青素為存在方式，因此前花青素對照品液相圖譜與藍莓提取物液相圖譜一致。但是采用此方法不能作為藍莓提取物中的前花青素含量，由表2可知，用此方法測得的前花青素含量是226.8%，超過100%，因為藍莓提取物甲醇溶液紫紅色，存在顏色干擾，導致測定值不能反映藍莓提取物中的前花青素含量。

圖2 藍莓提取物前花青素液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of blueberry extract

2.3 藍莓提取物中測定花色苷含量

測定方法：越橘提取物國際商務標準[4]。

標準品溶液制備：取歐洲越橘提取物對照品125mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加2%鹽酸-甲醇溶液，并稀釋至刻度，搖勻。準確移取2 mL的上述溶液于10 mL量瓶中，用10%磷酸溶液定容，配成標準品溶液。

供試品溶液制備：同標準品制備。

歐洲越橘提取物對照品的花色苷液相圖譜見圖3，藍莓提取物中的花色苷液相圖譜見圖4。

圖3 歐洲越橘提取物對照品的花色苷液相圖譜Fig.3 HPLC chromatogram of bilberry extract standard

圖4 藍莓提取物中的花色苷液相圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of blueberry extract

由圖3及圖4可知，歐洲越橘提取物對照品色譜圖上超過10個色譜峰，藍莓提取物只有兩個色譜峰，且出峰時間與歐洲越橘提取物對照品出峰時間不一致，因藍莓提取物中的花色苷與歐洲越橘提取物中的花色苷結構不一致，因此測定藍莓提取物中的色苷不能采用此方法。

2.4 藍莓提取物中測定花青素含量

測定方法：越橘提取物國際商務標準[4]。

精密稱定供試品50 mg，置50 mL體積棕色容量瓶中，加入2%鹽酸甲醇溶液30 mL，超聲溶解，冷卻至室溫，用2%鹽酸甲醇溶液定容。精密吸取2 mL至25 mL量瓶中，取5 mL到25 mL量瓶中，以2%鹽酸甲醇作空白進行540 nm處測定吸光度A。藍莓提取物中花青素的含量測定結果見表3。

3 討論

越橘、藍莓、黑果枸杞等水果中都有花色苷，但是花色苷種類是否一致，在對產品進行質量檢測時需進一步確定。前花青素與原花青素都是黃烷醇類成分，但是目前并無有資質機構出售相應對照品，因此這兩種檢測方法可操作性不強。盡管現在已經有原花青素B1、B2等單體對照品，但是對照品昂貴，對于生產中實操性還存在一定的問題。花色苷只適應歐洲越橘提取物的測定，花青素測定適合性廣泛，但其檢測方法較粗糙，對于存在多種成分的制劑，采用此方法進行含量測定準確性需進行驗證。在對花青素類產品進行功效成分含量測定時，需廣泛調研文獻、藥典、標準及實驗確證，明確原料中的功效成分衡量指標，再開展功能因子含量分析，為產品質量提供保障。

表3 藍莓提取物中花青素的含量測定結果Table 3 Determination of anthocyanins in blueberry extracts

由表3可知，采用花青素方法，藍莓提取物中的花青素測定結果為25.4%，與市售的25%藍莓提取物規格一致。表明用此方法確定藍莓提取物中花青素含量是可行的，但是此方法無對照品，對于以藍莓提取物為主要原料開發的產品，用此方法衡量產品中花青素含量準確度欠妥。

[1] 陳介甫,李亞東,徐哲.藍莓的主要化學成分及生物活性[J].藥學學報,2010,45(4):422-429

[2]中華人民共和國衛生部.保健食品檢驗與評價技術規范[M].北京:衛生部衛生法制與監督司,2003:274-275

[3] 中華人民共和國衛生部,中國國家標準化管理委員會.GB/T 22244-2008保健食品中前花青素的測定[S].北京:中國標準出版社,2008:1-3

[4]中國醫藥保健品進出口商會.植物提取物國際商務標準集[M].北京:中國商務出版社,2016:182-211

Investigation on Determination of Functional Ingredient in Blueberry Extract

ZENG Rong-hua，LIU Cui-hong，LUO Ming-li，LI Jing，WANG Xiao-mei
（National Engineering Research Center for Modernization of Extraction and Separation Process of TCM，Guangzhou Baiyunshan Hanfang Pharmaceutical Company Limited，Guangzhou 510240，Guangdong，China）

Determination of proanthocyanidins，procyanidins，anthocyanins and anthocyanin in blueberry extract were studied.The determinations were carried out with proanthocyanidins and procyanidins'content methods of function food and National Ministry of commerce standard.Content of proanthocyanidins was 127.8% ，content of procyanidins was 226.8%.Content of anthocyanins was 25.4%.Anthocyanin content was not measured.Determination of anthocyanins was suitable for blueberry extract.

blueberry extract；proanthocyanidins；anthocyanins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.08.029

2016-08-15

廣東省科學技術廳應用型科技研發專項資金項目（2015B020234001）

曾榮華（1978—），女（漢），工程師，碩士，從事健康產品研究。