芍藥花多酚的純化及其抗氧化活性研究

俞憬，陳冠林，楊璐齊，王煜坤，高永清，傅南琳

（1.廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山528458；2.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；3.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東廣州510008）

芍藥花多酚的純化及其抗氧化活性研究

俞憬1，陳冠林2，楊璐齊1，王煜坤1，高永清1，傅南琳3，*

（1.廣東藥科大學食品科學學院，廣東中山528458；2.佛山市職業病防治所，廣東佛山528000；3.廣東藥科大學附屬第一醫院，廣東廣州510008）

研究大孔吸附樹脂純化芍藥花多酚的條件和純化后多酚的抗氧化能力。采用靜態試驗和動態試驗確定純化條件，計算純化后多酚的含量。在供試的9種大孔吸附樹脂中，HPD100樹脂的吸附和洗脫效果最好。在室溫下，以50%乙醇為洗脫劑，吸附流速和洗脫流速均為10mL/min時，純化的芍藥花多酚含量為721.72mgGAE/gDW，是未純化前的1.57倍。通過DPPH、FRAP和ABTS三種方法測得純化后芍藥花多酚的抗氧化能力是未純化前粗提物的1.35、1.44、1.62倍。

純化；抗氧化；多酚；芍藥花；大孔樹脂

芍藥（Paeonia lactiflora Pall.），為芍藥科（Paenoiaeeae）芍藥屬（Paeonia）的著名草本花卉，在中國、日本以及韓國應用廣泛[1-2]。芍藥具有補虛、鎮痛、解痙、抗炎以及抗氧化等作用[3-8]。芍藥花富含亞麻酸、亞油酸、棕櫚酸、多酚、黃酮、甾體以及蒽醌等有機化合物[9-10]。王愛晶[11]等研究發現，芍藥色素耐熱不耐光，對氧化劑和還原劑敏感；在堿性條件下芍藥花色素不穩定，而在酸性條件下，其色素則較穩定。金英善[10]等研究發現，芍藥花甲醇提取物的總酚含量最高而70%甲醇提取物的總酚含量最低。金英善[10]等應用DPPH法測定了芍藥花提取物的抗氧化活性，結果顯示芍藥花提取物有較強的自由基清除能力，其中芍藥花甲醇和水的提取物對自由基的清除能力較槲皮素強。何玲[12]等對芍藥花色素提取工藝進行了研究，其優化工藝條件為提取溫度75℃，pH2.2的75%乙醇，提取時間70min，在該條件下色素的得率為6.45%。除此之外，還有人對芍藥花提取物的微量元素、黃酮、多糖以及抗氧化活性進行了研究[10，13-15]。從目前掌握的文獻來看，雖有不少文章對芍藥花進行了相關的研究，但應用大孔吸附樹脂對芍藥花多酚的純化以及對純化后芍藥花多酚的抗氧化性進行系統的研究較少。本研究以芍藥花為原料，應用不同型號的大孔吸附樹脂對芍藥花多酚進行純化，并系統地測定純化后芍藥花多酚的抗氧化性，為開發芍藥花多酚提供依據。

1 材料

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

芍藥花購于廣東省佛山市超市，干燥后用粉碎機粉碎，過20目篩，備用。

1.1.2 試劑

乙腈（色譜純）：德國Merck公司；乙醇（色譜純）：上海安譜科學儀器有限公司；水溶性維生素E、2，2'-聯氨-雙-3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸、福林-酚試劑：美國Sigma公司；三吡啶三吖嗪和1，1-二苯基-2-三硝基苯肼：阿拉丁公司；三氯化鐵、鹽酸、乙酸鈉、過硫酸鉀、沒食子酸、乙醇（分析純）：由天津化學試劑廠生產。

1.2 儀器與設備

UV-9600紫外/可見分光光度計：北京瑞利分析儀器有限公司；LEO-150S超聲清洗儀：昆山力波超聲波設備有限公司；ACQUITY UPLCH-CLASS超高效液相色譜儀：美國Waters公司。

2 方法

2.1 芍藥花多酚的提取

準確稱取1.0g芍藥花粉末，加入50mL 40%乙醇，40℃下超聲10min后抽濾，減壓濃縮后，濾液備用。

2.2 樹脂預處理

參照陳冠林等[16-17]的方法。

2.3 最佳樹脂的選擇

吸附率與解吸率的測定參照CHEN等[18]的方法。

2.4 靜態試驗

最佳吸附與洗脫條件的確定參照陳冠林等[16-17]的方法。

2.5 動態試驗

2.5.1 最佳吸附流速的確定

參考火龍果色素吸附和洗脫流速[16-17]，吸附和洗脫流速為10mL/min。

2.5.2 最佳洗脫劑用量的確定

參照陳冠林等[16-17]的方法。

2.5.3 多酚粗提物及其純化物

按2.1提取后，濾液減壓濃縮至干，得芍藥花多酚粗提物；按2.5.2將純化后的多酚濾液減壓濃縮至干，得芍藥花純化物。將芍藥花多酚粗提物以及純化物溶于50%甲醇中，得待測物。

2.6 總酚含量的測定

參照Singleton等[19]的方法，結果以沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）表示，單位為mg GAE/g DW（dryweight）。

2.7 FRAP法測定抗氧化活性

參照Ozgen以及Benzie等[20-21]的方法。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g。

2.8 DPPH法測定抗氧化活性

參照Cai等[22]的方法，以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用Trolox當量表示，單位為μmol Trolox/g。

2.9 ABTS法測定抗氧化能力

參照Ozgen[20]等方法。以Trolox溶液為標樣作標準曲線，樣品的抗氧化活性用TEAC（trolox equivalent antioxidantcapacity）表示[20]，單位為μmol Trolox/g。

2.10 超高效液相色譜條件（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）

參照Chen等[15]的方法。

3 結果與分析

3.1 樹脂的選擇結果

大孔樹脂對多酚的吸附和解吸能力結果見表1。

表1 大孔樹脂對多酚的吸附和解吸能力Table1 Adsorp tion and desorption propertiesofmacroporous resins for polyphenols

續表1 大孔樹脂對多酚的吸附和解吸能力Continue table1 Adsorption and desorption propertiesofmacroporous resins for polyphenols

由表1可見，在吸附試驗中，ADS-7的吸附量和吸附率最高，其次依次分別是HPD100、HPD400、HPD700和D101，HPD-BTQH的吸附量和吸附率最差。以往的研究發現，大孔樹脂的比表面和平均孔徑對大孔樹脂的吸附力有明顯的影響[23-24]，然而在本研究中，HPD100、HPD400、HPD700以及D101的比表面和平均孔徑不同，但其吸附力是相近的，結果表明大孔樹脂的比表面和平均孔徑對芍藥花多酚的吸附影響不大，這與以往的研究是一致的[25]。在解吸試驗中，HPD100的解吸率和解吸量最高，其次分別是HPD700、D101和HPD450，ADS-7的解吸率和解吸量最低。樹脂的極性對其吸附效率有明顯的影響，極性越高，其解吸效率越差[26]，對于弱極性的化合物則應選用極性弱且比表面大的樹脂進行吸附[27]。綜上所述，HPD100的吸附以及解吸性能高于其他8種樹脂，這與火龍果色素的吸附和解吸結果是一致的[16-17]，因此采用HPD100進行后續試驗。

3.2 吸附條件的確定

3.2.1 pH值對吸附率的影響

pH值對吸附率的影響結果見圖1。

圖1 pH值對吸附率的影響Fig.1 Effectof pH on adsorption rate

從圖1可見，pH值對吸附率的影響較大，在pH2～4的范圍內，pH值的增大吸附率變化不大，pH值為4時吸附率最高，但隨著pH值的增大其吸附率有所下降，這與大孔樹脂吸附牡荊苷（vitexin）和異牡荊苷（isovitexin）是一致的[28]。多酚是酸性和弱極性的分子，因此對pH值敏感。在較低的pH值時，多酚容易被大孔樹脂吸附，與此相反，在較高的pH值時，由于電離反應，多酚以離子形式存在使其更難被吸附[29]，而以往的研究也發現，植物類多酚在pH值在3～5之間是比較穩定的[30]，因此試驗芍藥花多酚溶液確定為pH4。

3.2.2 時間對吸附率的影響

時間對吸附率的影響結果見圖2。

圖2 時間對吸附率的影響Fig.2 Effectof timeon adsorption rate

由圖2可知，在60min內，吸附率上升趨勢明顯，60min時吸附率達97%，溶液中大部分的多酚已被大孔樹脂吸附，因此確定吸附時間為60min。

3.3 解吸條件的確定

3.3.1 乙醇濃度對解吸量的影響

乙醇濃度對解吸量的影響結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對解吸量的影響Fig.3 Effectof ethanol concentration on desorption capacity

從圖3可以看出，乙醇濃度在50%時其洗脫量趨于平衡，乙醇濃度增加其解吸量也不會有明顯的增加，這與以往的研究是一致的[31-32]。因此選擇50%乙醇作為洗脫劑。

3.3.2 pH值對解吸量的影響

pH值對解吸量的影響結果見圖4。

圖4 pH值對解吸量的影響Fig.4 Effectof pH on desorption capacity

從圖4可以看出，在pH值為2～8的范圍內，解吸量呈波浪形，解吸效果最好的是pH值為3時。因此確定試驗多酚解吸溶液的pH值為3。以往的研究發現，解吸液pH值對多酚的解吸有明顯的影響，隨著解吸液pH值的增加，其解吸效果下降，當解吸液pH值超過6時，其解吸率明顯下降[28-29]。

3.3.3 時間對解吸率的影響

時間對解吸率的影響結果見圖5。

圖5 時間對解吸量的影響Fig.5 Effectof timeon desorption capacity

從圖5可以看出，60min時解吸量趨于平衡，增加解吸時間也不能明顯提高解吸量。因此選擇解吸時間為60min。

3.3.4 洗脫曲線

洗脫曲線結果見圖6。

圖6 芍藥花多酚洗脫曲線Fig.6 Desorp tion curvesof polyphenolsobtained from the flower of Paeonia lactiflora Palls

由圖6可知，洗脫劑為200mL時，芍藥花多酚基本上全部被洗脫出來。故洗脫劑的最佳用量為200mL。

3.4 多酚含量及其抗氧化能力

多酚含量及其抗氧化能力結果見表2。

表2 芍藥花的總酚含量及其抗氧化能力Table2 Totalphenolic contentand antioxidant capacity of extracts from the flower of Paeonia lactifora Palls

在優化條件下獲得的純化的多酚為721.72mg GAE/g DW，是未純化的1.57倍，多酚含量明顯增高。從表2可以看出，純化后多酚的抗氧化能力明顯增高，分別是未純化的1.44（FRAP）、1.35（DPPH）以及1.62（ABTS）倍。

3.5 UPLC分析結果

UPLC法測得的每克芍藥花中多酚的質量分數結果見表3，其色譜圖見圖7。

表3 純化以及未純化芍藥花多酚的含量Table3 Concentrationsof phenolic com pounds in purification and unpurified phenolicsof the flower from Paeonia lactiflora Pall μg/g DW

圖7 檢測波長280 nm下多酚的超高效液相色譜圖Fig.7 UPLC chrom atogram sof phenolicsdetected at thewavelength of 280 nm

未純化前芍藥花中異槲皮苷的含量最高，其含量為9 9811.79μg/g DW；其次是槲皮苷，其含量為73 989.69μg/g DW，芍藥花中未檢測到原兒茶酸、咖啡酸、丁香酸、異鼠李素以及槲皮素。純化后芍藥花多酚中異槲皮苷的含量明顯增高，其含量為242791.14μg/gDW，是未純化的2.43倍。槲皮苷的含量為150 564.44μg/g DW，是未純化的2.03倍。芍藥花中還含有沒食子酸、（+）-兒茶素、香草酸、表兒茶素、對香豆酸、阿魏酸以及蘆丁，其含量也較高。HE等[33]應用DPPH法測定相同濃度下槲皮素-3-O-葡萄糖苷、蘆丁以及槲皮素的抗氧化活性，結果顯示上述物質對自由基的清除能力大致相同，但對DNA的切割活性則有所不同，對DNA切割活性能力強弱的順序為槲皮素、蘆丁、香豆酸、阿魏酸以及槲皮素-3-O-葡萄糖苷。而在促氧化活性研究中，促氧化活性最強的是槲皮素-3-O-葡萄糖苷，其次是對香豆酸、阿魏酸的促氧化活性最弱[33]。WEN等[34]用DPPH法測定了荔枝葉提取物的抗氧化活性，結果顯示原花青素A2和表兒茶素對自由基的清除能力最強；在ORAC試驗中，其抗氧化能力的強弱順序為原花青素A2、槲皮素、表兒茶素、蘆丁、山奈酚-3-O-β-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-α-鼠李糖苷以及木樨草素。木樨草素對蘇云金芽孢桿菌、志賀氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌以及沙門氏菌的抗菌活性較強，而蘆丁、原花青素A2和表兒茶素的抗菌活性較弱[34]。另一項研究發現，蘆丁可抑制人白血病腫瘤的生長[35]。沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、表兒茶素、對香豆酸等對低密度脂蛋白膽固醇的氧化有很好的抑制作用[36-38]，且混合酚類對低密度脂蛋白膽固醇氧化的抑制作用更強[39]。

4 結語

在9種大孔樹脂中，HPD100對芍藥花多酚的分離純化效果較好。室溫下，以50%乙醇為洗脫劑，吸附和洗脫流速為10mL/min，分離純化芍藥花多酚，純化后的多酚含量為（721.72±4.25）GAE/g DW，是未純化前的1.57倍。純化后芍藥花多酚的抗氧化能力是未純化的1.35、1.44和1.62倍。純化后芍藥花中（+）-兒茶素、香草酸、表兒茶素、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、異槲皮苷以及槲皮苷等的含量明顯增高。

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Study on Purification and Antioxidant Activity of Polyphenols from the Flower of Paeonia lactiflora Palla

YU Jing1，CHENGuan-lin2，YANGLu-qi1，WANGYu-kun1，GAOYong-qing1，FUNan-lin3，*
（1.Schoolof Food Science，Guangdong PharmaceuticalUniversity，Zhongshan 528458，Guangdong，China；2.Foshan InstituteofOccupationalDisease Prevention and Control，Foshan 528000，Guangdong，China；3.The FirstAffiliated HospitalofGuangdong PharmaceuticalUniversity，Guangzhou 510008，Guangdong，China）

Using themacroporousadsorptive resins，the purification conditions for totalphenolic content（TPC）from the flowerof Paeonia lactiflora Pallaand theantioxidantcapacity of the TPCwere studied afterpurification. Static and dynamic experimentalmethodswere performed to determine the purification conditions，and the contentsof thepurified TPCwere calculated.Among the9macroporous resins tested，HPD100 resinwas thebest in adsorption effectand desorption effect.At room temperature，when 50%ofethanolwasused as desorption solution，adsorption and desorption floWvelocitieswere both 10mL/min，the content of the TPC purified from the flower of Paeonia lactiflora Pallawas721.72mg GAE/g dryweight，and itwas 1.57 timeshigher compared with thatbefore purification.The antioxidantactivities of purified extractsmeasured by 2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radicalscavenging activity assay（DPPH），ferric reducing antioxidantpower assay（FRAP），and ABTS+radicalscavengingactivity（ABTS）assaywere1.35，1.44，1.62 timeshigher than thoseofcrudeextractsbefore purification，respectively.

purification；antioxidant；polyphenol；Paeonia lactiflora Palla；macroporousresins

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.009

2016-07-26

廣東省醫學科學技術研究基金項目（A2015617）；中醫藥強省建設專項資金第二批名中醫師承項目（粵中醫辦函[2015]93號）

俞憬（1992—），男（漢），在讀碩士，研究方向：營養與健康。

*通信作者：傅南琳（1964—），女（漢），主任醫師，研究方向：中藥天然產物與健康關系的研究。