響應面法優化直投式酸奶發酵劑的工藝研究

韓榮偉，于忠娜，劉璐，王軍，*

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109；2.青島農業大學海都學院，山東萊陽265200）

響應面法優化直投式酸奶發酵劑的工藝研究

韓榮偉1，于忠娜2，劉璐1，王軍1，*

（1.青島農業大學食品科學與工程學院，山東青島266109；2.青島農業大學海都學院，山東萊陽265200）

直投式酸奶發酵劑因活性高、穩定性好、使用簡便，已成為酸奶發酵劑的主要發展方向。嗜熱鏈球菌（Streptococcusthermophilus，St）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillusbulgaricus，Lb）經活化和純化后，以存活率為指標，對混合發酵液的菌種混合比例、離心條件、預凍條件進行單因素試驗。試驗結果表明混合發酵液的最佳制備條件為：St∶Lb=1∶1（體積比）、離心速度3000 r/min、離心時間10min、預凍溫度-80℃、預凍時間1 h；采用響應面法對凍干菌懸液的保護劑pH、保護劑和菌泥平衡時間、保護劑和菌泥混合比例進行優化試驗，結果表明凍干菌懸液最佳制備條件為：保護劑pH6.6、平衡時間30min、保護劑和菌泥混合比例2∶1（mL/g），此時St存活率63.77%、Lb存活率66.03%，具有較好的市場前景和應用價值。

嗜熱鏈球菌；保加利亞乳桿菌；直投式酸奶發酵劑；響應面法

酸奶發酵劑是酸奶生產中至關重要的一部分，酸奶發酵劑的發酵性能直接關系到酸奶的品質和質量。酸奶發酵劑一般都是由嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，St）和保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus，Lb）兩種菌組成[1-3]。將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進行組合制備直投式酸奶發酵劑，可以發揮不同優良菌株的發酵性能，從而使得酸奶發酵劑同時具備發酵速率快、發酵產品黏度好、特征風味濃郁、保健功能良好等優良性能[4-7]。我國在凍干發酵劑的研制方面起步較晚，國內現階段使用的酸奶發酵劑大多是從國外進口。基于此，本文研究通過響應面方法研究了直投式保加利亞乳桿菌—嗜熱鏈球菌復合發酵劑制備過程中混合發酵液及凍干菌懸液的制備條件，從而制備出一種高活性的直投式酸奶發酵劑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌：臺灣亞芯生物科技有限公司；奶粉：伊利脫脂奶粉；氯化鈉、葡萄糖、乳糖、檸檬酸二銨、硫酸鎂、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、硫酸錳：萊陽市康德化工有限公司；乙酸鈉：天津市瑞金特化學品有限公司；吐溫-80：天津市富宇精細化工有限公司；胰蛋白胨、牛肉膏酵母浸粉、中性紅：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

Alpha 1-2 LD plus真空冷凍干燥機：德國CHRIST公司；Seven-Multi型pH/電導率/離子綜合測試儀：梅特勒-托利多公司；AR224CN電子天平：奧豪斯儀器上海有限公司；SW-CJ-1F超潔凈工作臺：蘇州智凈凈化設備有限公司；TGL-16C臺式離心機：上海安亭電子儀器廠。

1.3 試劑配制

培養基及緩沖液磷酸緩沖液、10%脫脂乳培養基、MC培養基及MRS培養基均按文獻中配方配制[8-12]。

1.4 方法

菌種活化→制備混合發酵液→離心混合發酵液→加入保護劑→預凍→真空冷凍干燥→獲得發酵劑

1.5 菌種活化

稱取St、Lb菌粉各1 g分別加入盛有9mLMC、MRS無菌液體培養基中，混合均勻后37℃恒溫培養24 h。取MC、MRS菌懸液各0.1mL涂布于MC、MRS固體培養基上，37℃培養48 h，然后挑取St、Lb的單個菌落分別接種于10mLMC、MRS無菌液體培養基中，37℃培養24 h，獲得St、Lb菌懸液，備用。

1.6 混合發酵液處理條件的單因素試驗

1.6.1 混合發酵液的制備

將St和Lb分別按照活菌數1∶1、1∶2、2∶1的比例（體積比）接種于MRS培養基中，37℃培養，10 h后每2 h添加一次緩沖液，添加量均為1%（體積比）[12]，培養至16 h取出，獲得混合發酵液。然后分別進行菌落計數。

1.6.2 混合發酵液離心條件的確定

制備混合發酵液，在2 000、3 000、4 000 r/min條件下分別離心10、15、20min，取上清液和菌泥分別進行活菌計數，計算出菌泥獲得率和離心存活率。

式中：X為離心存活率，%；N1為初始活菌數，cfu/mL；N2為菌泥活菌數，cfu/mL；N3為上清液活菌數，cfu/mL。

式中：M為菌泥獲得率，%；m1為離心后離心管總重，g；m2為離心管空重，g；m3為終止培養時培養物和離心管總重，g；m4為干離心管空重，g。

1.6.3 保護劑的加入

加入保護劑后可以使保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌保持穩定的活性，減弱真空冷凍干燥過程中對兩種菌的破壞。本試驗選取10%的脫脂乳作為凍干保護劑[8]。

1.6.4 預凍溫度和預凍時間的確定

菌泥均勻混合等量10%脫脂乳，在-20、-80℃條件下預凍不同的時間1、3、5 h后，將完全凍結的樣品取出，采用平板計數法進行菌落計數。檢測預凍前后的活菌數，計算兩種菌的預凍存活率。

式中：Y為預凍存活率，%；N4為預凍后活菌數，cfu/mL；N5為預凍前活菌數，cfu/mL。

1.7 真空冷凍干燥

開啟真空冷凍干燥機待溫度降到-56℃后進行1 h預熱。將經過1.6.4中確定的預凍溫度和預凍時間處理過的完全凍結的菌懸液，進行真空冷凍干燥[13]。

1.8 凍干菌懸液制備條件的單因素試驗

1.8.1 保護劑的pH值的確定

調節凍干保護劑（10%脫脂乳）的pH值為6.0、6.5、7.0、7.5。在室溫下將菌泥與等量的凍干保護劑混合均勻后，平衡30min，進行真空冷凍干燥。

1.8.2 保護劑和菌泥的平衡時間的確定

在室溫下將菌泥與等量的凍干保護劑混合均勻后，在凍干保護劑pH值6.5條件下分別平衡20、30、40、50min，進行真空冷凍干燥。

1.8.3 保護劑與和菌泥混合比例的確定

在室溫下將凍干保護劑與菌泥按1∶1、2∶1、3∶1、4∶1（mL/g）比例混合均勻后，在凍干保護劑pH值6.5條件下平衡30min，進行真空冷凍干燥。

1.9 菌落計數

將真空冷凍干燥后得到的菌粉在無菌條件下，用無菌生理鹽水將其在室溫下進行復水操作。平板計數法檢測真空冷凍干燥前后兩種菌的活菌數，然后計算出兩種菌的凍干存活率。

1.10 響應面設計

依據單因素試驗結果，以保護劑的pH（A）、保護劑和菌泥的平衡時間（B）、保護劑和菌泥的混合比例（C）3個因素作為自變量，以保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的存活率（Y1、Y2）作為響應值進行響應面優化設計試驗。根據Box-Behnken試驗設計原理[14]，通過Design-Expert8.0對試驗數據進行分析，確定凍干菌懸液的最佳制備工藝條件。

2 結果與分析

2.1 離心條件對混合發酵液中菌落存活率的影響

離心轉速和時間對St、Lb存活率的影響見表1。

表1 離心轉速和時間對St、Lb存活率的影響Table1 Effectof centrifugalspeed and timeon survival rateof St&Lb

由表1可知，經過離心后Lb存活率在75%以上的有4、5、6、7，St存活率在75%以上的有3、4、5，為了同時保證兩種菌的高存活率試驗方案4、5較理想，其菌泥獲得率分別為1.23%、1.36%。從節約能源、提高生產效率、降低生產成本方面考慮，選擇3 000 r/min、10min作為該試驗的最佳離心條件。

2.2 預凍溫度和預凍時間對混合發酵液中菌落存活率的影響

預凍溫度和時間對St、Lb存活率的影響見圖1。

圖1 預凍溫度和時間對St、Lb存活率的影響Fig.1 Effectsof p refreezing temperatureand freezing tim eon the survival rateof St&Lb

由圖1可知，-20℃下預凍5 h和-80℃預凍1h條件下兩種菌的存活率都達到75%以上；這可能是因為-80℃條件下，冷凍可以快速通過最大冰晶生成區，可以形成大量小的穩定冰晶體[15]。所以選擇預凍溫度-80℃、預凍時間1 h作為兩種菌的最佳試驗條件。

2.3 凍干菌懸液制備條件對St、Lb存活率的影響

2.3.1 St、Lb混合比例對其存活率的影響

St和Lb混合比例對其存活率的影響見表2。

表2 St和Lb混合比例對其存活率的影響Table2 Effectsof St&Lbm ixture ratio on their survival rate

根據表2數據可以看出St與Lb按活菌數為1∶1（體積比）混合時，兩種菌的存活率最高。所以將St：Lb=1∶1（體積比），作為本試驗兩種菌的混合比例。

2.3.2 保護劑pH對St、Lb存活率的影響

保護劑pH對St、Lb存活率的影響見圖2。

圖2 保護劑pH對St、Lb存活率的影響Fig.2 Effectof protectiveagent pH on the survival rateof St&Lb

由圖2可知，兩種菌的存活率隨著保護劑pH的增大先上升后下降，且在pH值為6.5時，兩種菌的存活率達到最高值。這也說明保護劑的pH只是在某個特定范圍值內，才會在真空冷凍干燥過程中對保加利亞桿菌和嗜熱鏈球菌的存活起到保護作用，pH過高或者過低都會使兩種菌的存活率降低。pH值為6.5時為最優條件。

2.3.3 保護劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響

圖3保護劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響見圖3。

圖3 保護劑和菌泥的平衡時間對St、Lb存活率的影響Fig.3 Effectsof thebalance timeof the protectiveagentand the bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根據圖3可以看出，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的存活率都隨著平衡時間的延長先上升后下降，并且在平衡時間為30min時，存活率達到最大值。這可能是因為平衡時間太短，會使保護劑無法充分擴散至兩種菌中，從而導致保護劑無法對兩者菌達到最佳的保護效果；平衡時間過長，護劑不但不會起到保護作用，可能還會對兩種菌的存活起到抑制作用[16]。

2.3.4 保護劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響

保護劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響見圖4。

圖4 保護劑和菌泥混合比例對St、Lb存活率的影響Fig.4 Effectsofm ixed proportion of protectiveagentsand bacterialsludgeon the survival rateof St&Lb

根據圖4可以看出，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌都是隨著保護劑與菌泥混合比例的增加，先上升后下降，在保護劑：菌泥的混合比例為2∶1（mL/g）時，兩種菌的存活率達到最大值。這可能是由于混合比例的增大，使得有足夠的保護劑能夠充分擴散到兩種菌中，確保細胞被充分的保護，達到良好的保護效果。

2.4 響應面優化試驗設計和結果分析

2.4.1 響應面優化試驗設計和結果

根據單因素試驗結果，響應面優化試驗設計及結果見表3、表4。

表3 響應面優化試驗因素水平表Table3 Factorsand levelsused in response surfacedesign

表4 Box-Behnken試驗設計及結果Table4 Box-Behnken design With experimental results for sterilization efficiency

2.4.2 各因素對St存活率的響應面優化試驗和分析

本試驗對保護劑pH值、保護劑和菌泥平衡時間、保護劑和菌泥混合比例3個因素，及3個因素的交叉作用對St存活率的影響進行研究，結果如表5所示。

表5 響應面試驗結果方差分析Table5 Analysisof variance for the fittedmathematicalmodel

續表5 響應面試驗結果方差分析Continue table5 Analysisof variance for the fittedm athematical model

根據表5可以看出，模型的P值＜0.000 1，這說明該模型極顯著，即該試驗方案具有可靠性。失擬項P= 0.187 2＞0.05，說明沒有失擬因素存在，回歸方程具有較好的擬合性，該模型能模擬A、B、C 3個因素對St菌種存活率的影響。B、C的P值均＜0.000 1，A的P= 0.003 8＜0.005，所以B、C對St存活率的影響是極顯著的，A對St存活率是顯著的；AB（P=0.0448）、AC（P= 0.005 1）、BC（P=0.000 5）的P值均＜0.005，所以3組交叉項對St存活率影響顯著；從F值可以看出，3個因素對St存活率的影響為A（保護劑pH）＞C（混合比例）＞B（均衡時間）。模型的R2Adj=0.996 4，說明該模型能很好的描述99.64%的響應值結果，能夠有效地反映各因素對響應值的影響。3個因素的交叉作用對響應值的影響如圖5所示。根據軟件的數據分析可得：保護劑pH值為6.57，平衡時間為29.71min，混合比例為2.05時，對St存活率來說是最佳試驗條件。

2.4.3 各因素對Lb存活率的響應面優化試驗和分析

Lb存活率不但取決于眾多單因素的影響，也會受這些因素的交叉作用的影響。本試驗對保護劑pH值、保護劑和菌泥平衡時間、保護劑和菌泥混合比例3個因素，及3個因素的交叉作用對Lb存貨率的影響進行研究，結果如表6所示。

表6 響應面試驗結果方差分析Table6 Analysisof variance for the fittedmathem aticalmodel

續表6 響應面試驗結果方差分析Continue table6 Analysisof variance for the fittedmathem atical m odel

根據表6可以看出，模型的P值＜0.000 1，這說明該模型極顯著，即該試驗方案具有可靠性。失擬項P= 0.839 6＞0.05，說明沒有失擬因素存在，回歸方程具有較好的擬合性，該模型能模擬A、B、C 3個因素對Lb菌種存活率的影響。A、B、C的P值均＜0.000 1，所以A、B、C對存活率的影響是極顯著的；AB（P=0.033 3）、AC（P=0.001 4）、BC（P=0.024 6）的P值均＜0.005，所以3組交叉項對Lb存活率影響顯著；從F值可以看出，3個因素對Lb存活率的影響為C（混合比例）＞A（保護劑pH）＞B（均衡時間）；模型的R2Adj=0.997 1，說明該模型能很好的描述99.71%的響應值結果，能夠有效地反映各因素對響應值的影響。3個因素的交叉作用對響應值的影響如圖6所示。根據軟件的數據分析可得：保護劑pH為6.57，平衡時間為29.97min，混合比例為2.01∶1（mL/g）時，對Lb存活率來說是最佳試驗條件。

綜合考慮，兩種菌的存活率和實際操作等因素，將凍干菌懸液的制備條件修正為：保護劑的pH為6.57，平衡時間為30min，混合比例為2∶1（mL/g）。在此條件下，St和Lb的存活率分別為63.98%、66.21%，兩種菌的存活率均達到最大值。綜上所述，凍干菌懸液的最佳制備條件確定為：保護劑的pH為6.57，平衡時間為30min，混合比例為2∶1（mL/g）。

3 結論

本試驗在單因素試驗的基礎上，進行響應面優化法試驗得出最佳工藝條件為：St與Lb按活菌數1∶1混合（體積比），離心速度3 000 r/min，離心時間10min，預凍溫度-80℃，預凍時間1 h，保護劑pH6.6，平衡時間30min，保護劑和菌泥混合比例為2∶1（mL/g）。在此條件下，可以同時確保St、Lb的高存活率，從而確保最終得到的凍干菌粉具有良好的發酵性能。本試驗僅對凍干菌懸液的制備條件進行了響應面優化，對混合發酵液的制備條件只進行了單因素試驗。混合發酵液制備過程中各因素間的交叉影響也會對St、Lb的存活率產生一定影響，所以在進一步的研究中應對混合發酵液的制備條件也進行響應面法優化，以降低各因素交叉作用對試驗結果的影響。

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Optim ization on Direct Vat SetWith Response Surface M ethod

HANRong-wei1，YU Zhong-na2，LIU Lu1，WANG Jun1，*
（1.Collegeof Food Scienceand Engineering，Qingdao AgriculturalUniversity，Qingdao266109，Shandong，China；2.CollegeofHaidu，Qingdao AgriculturalUniversity，Laiyang265200，Shandong，China）

Directvatset（DVS）hasbecome themain developmentdirection ofyogurt fermentation agentdue to itshigh activity，good stability and easy to use.With the survival rate as the index，the single factor testofmixing ratio，centrifugalcondition and pre-freezing conditionwere conducted after the activation and purification of Streptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus.The results showed that the optimizing fermentation conditionswere：St∶Lb=1∶1（volume ratio），the centrifugal speed of 3 000 r/min，centrifugation time of 10min，pre-freezing temperature of-80℃，pre-freezing time of1h；The pH of protective agent，the protective agent，the bacterialmud balance time，the protective agentand themixed proportion of the bacterialmire were optimized by response surfacemethod and the resultsshowed that the optimizing conditionsof freeze dried suspension were：protective agent pH of 6.6，equilibration time of 30min，themixing ratio of protective agent and bacterialmireof2∶1（mL/g）.Under theoptimized conditions，survival ratesof St&Lbwere63.77%and 66.03%，respectively，which indicated agoodmarket foreground and application value.

Streptococcus thermophilus；Lactobacillusbulgaricus；directvatset；responsesurfacemethod

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.016

2016-12-05

農業部公益性農業行業科研專項（201403071-5）；山東省自然基金青年基金（2015ZRB01095）；山東省重點研發計劃（2016GSF120010）；山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金（BS2014NY011）；青島農業大學高層次人才科研基金（6631115043）

韓榮偉（1981—），男（漢），副教授，博士，主要從事乳品科學方面研究。

*通信作者：王軍（1980—），男，副教授，博士，主要從事食品質量安全控制的研究。