芽孢皮層肽聚糖水解物RP-HPLC法分析條件優化

杜文斌，楊建興，師靜，孫靜，章中，*

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川750021；2.寧夏回族自治區食品檢測中心，寧夏銀川750001；3.寧夏出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，寧夏銀川750002）

芽孢皮層肽聚糖水解物RP-HPLC法分析條件優化

杜文斌1，楊建興2，師靜3，孫靜1，章中1，*

（1.寧夏大學農學院，寧夏銀川750021；2.寧夏回族自治區食品檢測中心，寧夏銀川750001；3.寧夏出入境檢驗檢疫局綜合技術中心，寧夏銀川750002）

通過試驗確定RP-HPLC法分析芽孢皮層肽聚糖水解物的最佳條件如下：在Welch Ultimate AQ-C18色譜柱上，柱溫為30℃，流速為1mL/min，檢測波長為206 nm，洗脫時間為120min，以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH= 4.31）做流動相，在0min～5min時使用100%磷酸鹽緩沖溶液，在5min～120min時流動相中的甲醇濃度從0梯度增加到30%。結果表明：用RP-HPLC法分析芽孢皮層肽聚糖水解物是可行的，為研究高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖支架水解機理，并進一步闡明高壓熱處理殺滅細菌芽孢的機理提供了研究方法支撐。

RP-HPLC；芽孢；皮層；肽聚糖；水解物

芽孢是芽孢桿菌屬和梭菌屬細菌在環境脅迫條件下形成的一類微生物休眠體，是影響食品安全和食品保藏的重要原因，是食品殺菌的關鍵目標[1]。超高壓是一種重要的新型食品殺菌技術，超高壓耦合熱處理能有效殺滅芽孢，高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖發生了水解[2]，這是其殺滅芽孢的重要原因，但該處理下芽孢皮層肽聚糖水解的機理尚不明確，而要闡明這一機理，首先必須確定和優化芽孢肽聚糖水解物的分析方法。

芽孢一般由胞外壁、芽孢衣、外膜、皮層、細胞壁、內膜和內核組成。肽聚糖是芽孢皮層的主要成分，在壓力脅迫條件下發揮保護作用，能保持超高壓條件下芽孢結構的完好。單獨使用壓力時，1 600MPa的超高壓處理都不能殺死芽孢[3-4]。肽聚糖由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通過β-1，4糖苷鍵交替連接而成[5]，其四肽尾的氨基酸組成和肽橋因菌種而異[6]。本文使用RP-HPLC法對芽孢皮層肽聚糖水解物進行分析鑒定，為闡明高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解機理，進而為闡明高壓熱處理殺滅細菌芽孢的機理提供研究方法支撐。

RP-HPLC技術發展迅速[7-8]，其柱效高、使用壽命長、重現性好、靈敏度高，幾乎對各種類型的有機化合物都有良好的選擇性，并可用于梯度洗脫[9]。推測高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解物為糖胺、胞壁酸、糖肽和氨基酸等有機物，所以從理論上推測RP-HPLC法應能較好地分析芽孢皮層肽聚糖水解物，選擇合適的檢測條件對各種樣品的分析效果非常重要，本文對RPHPLC法分析肽聚糖水解物的條件進行了優化研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

營養瓊脂：北京奧博星生物技術有限公司；Tris（分析純）：Sigma-Aldrich公司；尿素、三氯乙酸、氯化鈣、磷酸二氫鈉、磷酸二氫鈉（均為分析純）：天津市大茂化學試劑廠；十二烷基硫酸鈉（分析純）、甲醇（色譜純）：Sigma公司；鹽酸（分析純）：天津市北聯精細化學品開發有限公司；磷酸（分析純）：西安化學試劑廠；二硫蘇糖醇（分析純）、胰蛋白酶、溶菌酶：北京博奧拓達科技有限公司；L-丙氨酸（分析純）：上海瑞永生物科技有限公司；菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC），編號As1.433。

1.2 儀器與設備

Agilent1100型HPLC色譜儀及數據處理平臺：美國Agilent公司；色譜柱：Welch Ultimate AQ-C18柱（250mm×4.6mm；5μm）：美國Welch公司；UV-2450型紫外分光光度計：日本島津公司；PHS-3C型pH計：上海雷磁儀器廠；KDC-2046型冷凍離心機：科大創新股份有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 芽孢制備

菌種用營養瓊脂培養基活化培養3代以上，接入試管斜面促芽孢生長培養基上劃線培養。在37℃培養7 d后，用接種環和無菌去離子水將試管斜面上的芽孢洗滌收集到離心管中。然后用冷的無菌去離子水離心洗滌3次（離心條件：7 000 r/min、4℃、15min）。離心后將上清液和沉淀上部一起倒掉，純化后的芽孢重懸在無菌去離子水中，濃度調整為1.5×108CFU/mL左右，放在4℃保存，一個月內使用。

1.3.2 芽孢皮層肽聚糖提取

所有提取步驟都在離心管內、在1mL的體積進行，在未指明的情況下，所有離心條件均為（13 000 r/min、3min）。芽孢懸浮液離心后再用芽孢衣脫除劑在37℃處理兩次，每次60min（脫除劑組成為50mmol/L、pH= 8的Tris-Hcl緩沖液，8mol/L尿素，1%（重量/體積）的十二烷基硫酸鈉、50mmol/L二硫蘇糖醇）。脫除芽孢衣后芽孢用水洗滌5次。然后用5%的三氯乙酸在95℃處理6min以鈍化皮層裂解酶，再用1mol/L、pH8的Tris-Hcl洗滌1次，用水洗滌5次。用胰蛋白酶（0.1mg/mL、溶于20mol/L、pH8的Tris-鹽酸緩沖液和10mmol/L的氯化鈣）在37℃下消化處理16 h，將大部分蛋白質除去，離心取沉淀。添加十二烷基硫酸鈉到1%，然后將芽孢樣品在100℃加熱15min。離心后，取沉淀物用水清洗直到上清液中沒有十二烷基硫酸鈉（大約洗滌10次），最后所得沉淀物即為芽孢皮層肽聚糖[10-14]。

1.3.3 肽聚糖水解物制備

將溶菌酶溶于12.5mmol/L、pH=5.5的磷酸鹽緩沖鹽中，活力調整為2 000U。取1.3.2所得的芽孢皮層肽聚糖在37℃的溶菌酶溶液中酶解[15-16]24 h，離心，取上清液，微孔濾膜過濾，待用。

2 結果與討論

2.1 波長的選擇

用分光光度計在190 nm～400 nm波長對芽孢皮層肽聚糖水解物樣品進行全波段掃描[17]，結果如圖1。

圖1 芽孢皮層肽聚糖水解物紫外吸收光譜圖Fig.1 Theultravioletabsorption spectra of spore′s cortical peptidoglycan hydrolysate

由圖1可知，樣品溶液在195 nm處有最大吸收，鑒于RP-HPLC色譜儀紫外檢測器最小檢測波長為200 nm，初步選擇202 nm作為檢測波長。

在202 nm檢測波長下，以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）做流動相，在0min～5 min時使用100%磷酸鹽緩沖溶液，在5min～120min時流動相中的甲醇濃度從0梯度增加到20%。結果如圖2。

圖2 芽孢肽聚糖水解物在202 nm檢測波長的色譜圖Fig.2 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateat detection wavelength 202 nm

由圖2發現基線嚴重漂移，嚴重影響了分析效果。基線漂移可能是甲醇在該波長下吸收大造成的，為了解甲醇在不同波長下的吸收大小，隨后在190 nm～400 nm波長對甲醇進行全波段掃描，結果如圖3，甲醇在194 nm處有最大吸收。對比圖1和圖3，可發現隨著檢測波長增加，甲醇的吸收比肽聚糖水解物的吸收下降得快，因此為減少甲醇吸收造成的干擾，將波長增加到206 nm進行檢測。

圖3 甲醇溶液紫外吸收光譜圖Fig.3 Theultravioletabsorption spectra ofmethanolsolution

2.2 流動相的優化

對于芽孢皮層肽聚糖水解物的RP-HPLC法分析，流動相關系重大，有機溶劑的種類和濃度決定流動相的極性，即洗脫能力[18]。流動相中添加甲醇，可以改善洗脫效果和峰形，通過梯度改變流動相中的甲醇濃度，各物質會隨流動相依次洗脫出來。為選擇最佳的甲醇濃度，在30min內將甲醇濃度從0梯度增加到30%進行肽聚糖水解物洗脫試驗，結果見圖4。

如圖4所示：在206 nm下，隨著甲醇濃度增加，其吸收干擾也增加，經綜合考慮流動相的極性要求和甲醇的吸收情況，最終選擇甲醇濃度在5min～120min內從0梯度增加到30%。

以甲醇和0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）做流動相，在0 min～5 min時采用100%磷酸鹽緩沖液，在5min～120min時甲醇濃度從0梯度增加到30%，對芽孢皮層肽聚糖水解物進行分析檢測，結果如圖5。

圖4 在30m in內流動相中甲醇從0梯度增加到30%的色譜圖Fig.4 Chromatogram when themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%in 0m in-30m in

圖5 調整檢測波長和流動相后芽孢皮層肽聚糖水解物色譜圖Fig.5 Chromatogram of spore′scorticalpeptidoglycan hydrolysateafter adjusting thedetection wavelength andmobile phase

由圖5可知，流動相能將芽孢肽聚糖水解物洗脫開，且由甲醇造成的基線漂移較小，但問題是被檢測物的出峰面積太小，各組分出峰不明顯，因此進一步提高了芽孢肽聚糖水解物濃度后進行RP-HPLC分析試驗，結果如圖6。

圖6 提高濃度后芽孢皮層肽聚糖水解物色譜圖Fig.6 Chromatogram of spore′s corticalpep tidoglycan hydrolysateof increased concentration

如圖6所示：各組分出峰效果良好，峰形尖銳，峰面對稱，幾乎無拖尾現象，基線較穩定，對肽聚糖水解物的分析效果良好。

在肽聚糖水解物的制備過程中，使用了溶菌酶試劑，為排除溶菌酶試劑中各成分對分析結果的干擾，在以上RP-HPLC分析條件下對溶菌酶溶液單獨進行分析檢測，結果如圖7所示：溶菌酶溶液在此條件下基本不出峰。和圖7對比可知：圖6中所見的各個峰確為芽孢皮層肽聚糖水解物中的各種組分。

圖7 溶菌酶溶液色譜圖Fig.7 Chromatogram of lysozyme solution

3 結論

本文通過研究確定枯草芽孢桿菌芽孢皮層肽聚糖水解物的RP-HPLC法最佳分析條件為：設置Welch Ultimate AQ-C18色譜柱溫為30℃，流速為1mL/min，洗脫時間為120min，檢測波長為206 nm，以甲醇和0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=4.31）作流動相，在0～5min時采用100%磷酸鹽緩沖液，在5min～120min時甲醇濃度從0梯度增加到30%。在該條件下對芽孢皮層肽聚糖水解物的分析效果良好，下一步可用質譜對肽聚糖水解物的各種組分做進一步定性分析。本文的研究成果為闡明高壓熱處理下芽孢皮層肽聚糖水解機理，進而闡明高壓熱處理殺滅細菌芽孢的機理提供了研究方法支撐。

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Optim ization of RP-PHLC Analysis Conditions for Spore's Cortical Peptidoglycan Hydrolysate

DUWen-bin1，YANG Jian-xing2，SHIJing3，SUN Jing1，ZHANGZhong1，*
（1.CollegeofAgriculture，Ningxia University，Yinchuan 750021，Ningxia，China；2.Ningxia Food Inspection Center，Yinchuan 750001，Ningxia，China；3.General Technology CenterofNingxia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Yinchuan 750002，Ningxia，China）

By experiment，the optimal RP-HPLC conditions for analyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate were as follows：on Welch Ultimate AQ-C18 chromatographic column，column temperature 30℃，floWspeed 1mL/min，detection wavelength 206 nm，elution time 120min，withmethanoland 0.05mol/L PBS（pH=4.31）asmobile phase，in 0min-5min 100%PBSwasused，in 5min-120min themethanol concentration increased gradually from 0 to 30%.The result indicated that itwas feasible to use RP-HPLC foranalyzing spore's cortical peptidoglycan hydrolysate，which provided researchmethod support for studying the hydrolysis principle of spore's cortical peptidoglycan under HPTS（High Pressure Thermal Sterilization）treatment，and further for clarifying the principleofspore inactivation by HPTS.

RP-HPLC；spores；cortex；peptidoglycan；hydrolysate

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.023

2016-07-08

國家自然科學基金項目（31460410）

杜文斌（1991—），男（漢），碩士研究生，研究方向：新型食品殺菌技術、儀器分析。

*通信作者：章中（1977—），男（漢），副教授，博士。