蛹蟲草富鐵液體深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

李慧英

（南通理工學院，江蘇南通226002）

蛹蟲草富鐵液體深層發(fā)酵條件的優(yōu)化

李慧英

（南通理工學院，江蘇南通226002）

蛹蟲草和鐵元素被證明對人體有著重要的生理作用。通過設計單因素和多因素正交試驗，探討蛹蟲草富鐵液體深層發(fā)酵條件的優(yōu)化。試驗證實，蛹蟲草富鐵液體深層發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基配方為：大豆粉35 g/L、蔗糖30 g/L、KH2PO41.5 g/L、MgSO41.5g/L、硫胺素5×10-5g/L、FeSO4·7H2O 0.3 g/L。最佳培養(yǎng)條件為：pH6，溫度26℃，發(fā)酵3 d，接種量5%，裝液量100mL/250mL三角瓶。在此發(fā)酵條件下，測得富鐵蛹蟲草生物量為18.93 g/L，富集鐵為16.01mg/g。

蛹蟲草；富鐵；液體深層發(fā)酵；優(yōu)化

近年，冬蟲夏草價格高漲，市場資源更加緊缺。由于其規(guī)模化人工培養(yǎng)還未實現(xiàn)，所以尋找冬蟲夏草的替代品成為一種彌補途徑。很多研究顯示[1-2]，蛹蟲草中含有核苷類化合物（蟲草素、腺苷、鳥苷、尿苷、肌苷等）、蟲草多糖、蟲草酸（D-甘露醇）、氨基酸、SOD酶等多種生物活性物質(zhì)，在抗炎、抗癌、抗菌、增強免疫等方面與冬蟲夏草具有相仿的功效。目前，我國市場上已有200多家企業(yè)在開發(fā)和生產(chǎn)蛹蟲草，且不良反應報道不多[3]，所以可用蛹蟲草替代冬蟲夏草。對蛹蟲草的研究文獻較多，但蛹蟲草富鐵的培養(yǎng)還鮮見報道。鐵作為人體最重要的微量元素之一，在體內(nèi)含量最高。一個成人每天需吸收1mg以上的鐵才可以滿足生理需求[4]。本研究通過試驗，優(yōu)化蛹蟲草富鐵液體深層發(fā)酵的營養(yǎng)及培養(yǎng)條件，為其放大培養(yǎng)提供借鑒。

1 材料

1.1 菌種

蛹蟲草菌種來自中國科學院北京微生物研究所菌種保藏中心。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基（g/L）：土豆200 g煮沸15min八層紗布過濾，葡萄糖20，硫胺素5×10-5，MgSO41.5，KH2PO41.5，瓊脂粉20，調(diào)整初始pH6。121℃下滅菌20min。

1.2.2 種子培養(yǎng)基

PDA優(yōu)化培養(yǎng)基（g/L）：土豆200 g煮沸15min八層紗布過濾，葡萄糖20，蛋白胨20，硫胺素5×10-5，KH2PO41.5，MgSO41.5，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3，調(diào)整初始pH6。121℃下滅菌20min。

1.2.3 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

同1.2.2種子培養(yǎng)基。

2 方法

2.1 蛹蟲草培養(yǎng)

母種斜面培養(yǎng)：接種環(huán)劃線接種PDA斜面，26℃培養(yǎng)5 d～7 d。

液體種子培養(yǎng)：接種環(huán)劃線接種PDA平板，26℃培養(yǎng)5 d～7 d。切取平板菌兩小塊（約8mm2）于裝液量100mL/250 mL三角瓶中，26℃、150 r/min搖床培養(yǎng)48 h至菌液清亮（出現(xiàn)稠密且大小均勻的菌絲球）。

發(fā)酵培養(yǎng)：接種量5%，在裝液量100mL/250mL三角瓶中，26℃、150 r/min下，培養(yǎng)3 d。

2.2 富鐵蛹蟲草菌絲生物量的測定及菌絲體粉的制備

據(jù)前期蛹蟲草耐鐵試驗結果，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.3 g/LFeSO4·7H2O進行蛹蟲草液體深層發(fā)酵。發(fā)酵液離心5min（轉速10 000 r/min），傾去上清液，將菌絲球搗碎至泥狀，加去離子水10mL，再離心5min（轉速10 000 r/min），如此反復3次。將收集的菌絲置于干燥箱中烘干至恒重，稱干重即為生物量。粉碎菌絲過60目篩，得到的菌絲體粉用于其他有效成分測定。

2.3 菌絲鐵含量測定

用鄰二氮菲比色法測定[5]。

2.4 單因素試驗

2.4.1 碳源種類及濃度對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

在蛹蟲草發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別添加20 g/L的葡萄糖、果糖、乳糖、糊精、蔗糖、麥芽糖、可溶性淀粉替代基礎培養(yǎng)基的碳源，發(fā)酵培養(yǎng)3 d，測定菌絲體的生物量和富集鐵，確定出最優(yōu)碳源。設置最優(yōu)碳源濃度分別為10、20、30、40、50 g/L進行試驗，確定最佳濃度。

2.4.2 氮源種類及濃度對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

菌種液體深層發(fā)酵時添加的氮源分無機氮和有機氮，大多數(shù)菌種在無機氮中長勢沒有有機氮好[5-7]。蛹蟲草培養(yǎng)基中添加最優(yōu)碳源，分別添加大豆粉、蠶蛹粉、蛋白胨、酵母浸膏、玉米漿5種有機氮源，于26℃，轉速150 r/min下發(fā)酵培養(yǎng)3 d，測定菌絲體的生物量和富集鐵，確定最優(yōu)氮源。調(diào)整培養(yǎng)基中最優(yōu)氮源濃度為10、20、30、40、50 g/L進行試驗，確定最佳濃度。

2.4.3 發(fā)酵溫度對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

培養(yǎng)基中添加最優(yōu)碳源、氮源，蛹蟲草培養(yǎng)的初始溫度分別調(diào)整為22、24、26、28、30℃，在150 r/min轉速下發(fā)酵3 d，測定蛹蟲草的生物量和富集鐵，確定最佳培養(yǎng)溫度。

2.4.4 接種量對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

培養(yǎng)基中添加最優(yōu)碳源、氮源，調(diào)整最佳培養(yǎng)溫度，分別在培養(yǎng)基中接入l%、3%、5%、7%、10%的接種量，150 r/min轉速下發(fā)酵3 d，測定不同接種量下富鐵蛹蟲草的生物量和富集鐵，確定富鐵蛹蟲草的最佳接種量。

2.4.5 裝液量對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

在最優(yōu)碳源、氮源、溫度及接種量條件下，分別裝入250mL三角瓶的60、80、100、120、140mL容量的發(fā)酵液，150 r/min轉速下發(fā)酵3 d，測定不同裝液量下富鐵蛹蟲草菌絲體的生物量和富集鐵，確定出富鐵蛹蟲草培養(yǎng)的最佳裝液量。

2.4.6 培養(yǎng)基pH值對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響

在最優(yōu)碳源、氮源、溫度、接種量及裝液量條件下，分別調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，150 r/min轉速下發(fā)酵3 d，測定不同初始pH值培養(yǎng)基的蛹蟲草的生物量和富集鐵，確定出富鐵蛹蟲草培養(yǎng)基的最佳初始pH值。

2.5 多因素正交試驗

根據(jù)單因素試驗結果進一步設計正交試驗以優(yōu)化蛹蟲草的培養(yǎng)。

3 結果與分析

3.1 碳源的影響

分別添加20 g/L的不同碳源培養(yǎng)富鐵蛹蟲草，測定其菌絲生物量和富集鐵結果見圖1和圖2。

圖1 不同碳源對生物量的影響Fig.1 Effectof different carbon sourceson thebiomass

圖2 不同碳源對富集鐵的影響Fig.2 Effectof different carbon sourceson theenrichmentof iron

如圖1和圖2所示，不同碳源對蛹蟲草富集鐵的影響不大，但對其生物量影響較大。以生物量為考察指標時，添加不同碳源富鐵蛹蟲草的生物量大小依次為：蔗糖＞糊精＞可溶性淀粉＞葡萄糖＞乳糖＞果糖。以富集鐵為考察指標時，添加不同碳源富鐵蛹蟲草的富集鐵大小依次為：蔗糖＞糊精＞葡萄糖＞乳糖＞可溶性淀粉＞果糖。

從菌絲球長勢看，蔗糖作為碳源菌絲球最大，菌絲球密度高，發(fā)酵液也比較清澈。而可溶性淀粉和糊精做為碳源時，發(fā)酵液較黏稠，有較多碳源沉淀，影響了蟲草生物量的測定。綜上所述，選蔗糖作為最優(yōu)碳源。

富鐵蛹蟲草培養(yǎng)基中分別設置蔗糖濃度為10、20、30、40、50 g/L進行試驗，測定富鐵蛹蟲草的生物量和富集鐵結果如圖3和圖4。

圖3 不同碳源濃度對生物量的影響Fig.3 Effectof different concentrationsof carbon sourceson the biom ass

圖4 不同碳源濃度對富集鐵的影響Fig.4 Effectof different concentrationsof carbon sourceson the enrichmentof iron

由圖3所知，以生物量為考察指標時，添加不同濃度蔗糖富鐵蛹蟲草的生物量依次為：30 g/L＞40 g/L＞50 g/L＞20 g/L＞10 g/L。由圖4所知，以富集鐵為考察指標時，添加不同濃度蔗糖富鐵蛹蟲草的富集鐵依次為：30 g/L＞40 g/L＞20 g/L＞50 g/L＞10 g/L。由圖判斷，蔗糖濃度的變化對蛹蟲草富集鐵的影響不明顯，對生物量的影響相對明顯。綜合考慮，選擇蛹蟲草富鐵過程中蔗糖濃度添加30 g/L最佳。

3.2 氮源的影響

富鐵蛹蟲草培養(yǎng)基中添加30 g/L不同種類的有機氮源，測得生物量和富集鐵如圖5和圖6所示。

圖5 不同氮源對生物量的影響Fig.5 Effectof differentnitrogen sourceson thebiom ass

圖6 不同氮源對富集鐵的影響Fig.6 Effectof differentnitrogen sourceson theenrichm entof iron

從試驗結果可知，不同的氮源對發(fā)酵蛹蟲草的生物量影響比較大，但對蛹蟲草富集鐵元素的影響相對較小。從圖5來看，不同氮源對生物量的影響依次為：大豆粉＞玉米漿＞蠶蛹粉＞蛋白胨＞酵母浸膏。從圖6來看，不同氮源對富集鐵的影響依次為：大豆粉＞蠶蛹粉＞蛋白胨＞酵母浸膏＞玉米漿。

觀察蛹蟲草的長勢，大豆粉為氮源時長勢最好，玉米漿為氮源時長勢最差。以玉米漿為氮源生物量較高，因為發(fā)酵液較黏稠不能與菌絲球很好的分離造成的。綜合考慮，判定以大豆粉為氮源最優(yōu)。

為了考察大豆粉濃度變化對富鐵蛹蟲草的生物量、富集鐵和生長的影響，本試驗在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別添加濃度為10、20、30、40、50 g/L的大豆粉，測定富鐵蛹蟲草的生物量和富集鐵，結果如圖7和8所示。

圖7 不同氮源濃度對生物量的影響Fig.7 Effectof different concentrationsof nitrogen sourceson the biom ass

由圖7所示，大豆粉濃度為30 g/L時，蛹蟲草的生物量最大。圖8所示，大豆粉濃度為40 g/L時，蛹蟲草富鐵量最高。大豆粉濃度為30 g/L或40 g/L，蛹蟲草的富集鐵相差不大，所以選擇培養(yǎng)基中大豆粉的最佳濃度為30 g/L。

圖8 不同氮源濃度對富集鐵的影響Fig.8 Effectof different concentrationsofnitrogen sourceson the enrichm entof iron

3.3 溫度的影響

發(fā)酵液初始溫度不同，富鐵蛹蟲草的生物量和富集鐵變化不大，結果如圖9和圖10。

圖9 不同溫度對生物量的影響Fig.9 Effectof different tem peratureon thebiomass

圖10 不同溫度對富集鐵的影響Fig.10 Effectof different temperatureon theenrichmentof iron

如圖9和10所示，發(fā)酵溫度改變時，溫度從22℃升高到26℃時，蛹蟲草菌絲的生物量和富集鐵都趨緩升高，繼續(xù)升高溫度，蛹蟲草菌絲生物量和富集鐵值都逐漸下降，26℃時菌絲生物量和富集鐵都達到最大。其中24℃時，平行試驗中有一組數(shù)據(jù)生物量和富集鐵都相對其他兩組數(shù)據(jù)偏小，分析可能是菌種污染影響了蛹蟲草的生長。因此，富鐵蛹蟲草培養(yǎng)確定26℃為最適溫度。

無機錨固膠：采用NK尼高無機錨固膠，相關安全性能指標和工藝性能標準應符合GB 50728—2011《工程結構加固材料安全性鑒定技術規(guī)范》第4.2節(jié)和第4.8節(jié)中Ⅰ類A級膠的規(guī)定，相關技術要求應符合JGJ/T 271—2012《混凝土結構工程無機材料后錨固技術規(guī)程》的相關規(guī)定。

3.4 接種量的影響

圖11和圖12為分別以l%、3%、5%、7%、10%的接種量培養(yǎng)富鐵蛹蟲草時的生物量和富集鐵的變化圖。

圖11 接種量對生物量的影響Fig.11 Effectof inoculum on thebiomass

圖12 接種量對富集鐵的影響Fig.12 Effectof inocu lum on theenrichmentof iron

由圖11和圖12可知，接種量達到5%時，富鐵蛹蟲草的富集鐵和生物量都達到最大值，而隨著接種量的降低或升高，生物量和富集鐵都會不同程度的降低。所以，蛹蟲草富鐵培養(yǎng)時選擇5%的接種量最適合。

3.5 裝液量的影響

在250mL三角瓶中分別裝入60、80、100、120、140mL的培養(yǎng)液培養(yǎng)富鐵蛹蟲草，結果如圖13和圖14。

由圖13和圖14可知，裝液量的多少也會影響蛹蟲草生物量和富集鐵，裝液量100mL/250mL時，生物量和富集鐵達到最大值，所以選擇100mL/250mL的裝液量最適。

3.6 初始pH值的影響

將蛹蟲草的培養(yǎng)基初始pH值分別調(diào)整為4、5、6、7、8時，結果蛹蟲草培養(yǎng)的生物量和富集鐵如圖15和圖16。

圖13 裝液量對生物量的影響Fig.13 Effectof liquid volumeon thebiomass

圖14 裝液量對富集鐵的影響Fig.14 Effectof liquid capacity on theenrichmentof iron

圖15 pH值對生物量的影響Fig.15 Effectof pH on thebiomass

圖16 pH值對富集鐵的影響Fig.16 EffectofpH on theenrichmentof iron

由圖15和圖16可知，當初始pH值在4～6時，蛹蟲草的菌絲體干重和富集鐵含量隨著初始pH的升高而增大；當初始pH值達到6時，蛹蟲草的菌絲體干重和富集鐵量均達到最大；當初始pH值在6～8時，蛹蟲草的菌絲體干重和富集鐵量隨著初始pH值的升高而減小。因此確定pH6為最適pH值。

3.7 多因素正交試驗

蛹蟲草富鐵的單因素試驗結果顯示，大豆粉、蔗糖、接種量、裝液量這4個影響因素對富鐵蛹蟲草的生物量和富集鐵影響較顯著。為了進一步考察4個因素不同水平對蛹蟲草富鐵發(fā)酵的影響，確定出最佳培養(yǎng)基組合，本試驗采用每個因素設置3個水平，其因素水平如表1，設計正交表L9（34）安排正交試驗。

L9（34）正交試驗及其結果如表2，生物量為考察指標的各因素水平趨勢圖如圖17所示，富集鐵為考察指標的各因素水平趨勢圖如圖18所示。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）Table1 The L9（34）tableof factorsand levelsof orthogonal experim ents

表2 L9（34）正交試驗及其結果表Table2 The L9（34）tableof orthogonalexperimentsand its resu lts

蛹蟲草富鐵培養(yǎng)的生物量和富集鐵的極差計算結果見表2，比較各R值大小，可見RA＞RB＞RD＞RC，所以因素對試驗指標影響的主→次順序是ABDC。即大豆粉影響最大，其次是蔗糖，再次是裝液量，而接種量的影響較小。大豆粉、蔗糖、裝液量是富鐵蛹蟲草培養(yǎng)中生物量和富集鐵的主要影響因素，而接種量是次要因素。

見因素水平趨勢圖17和圖18，以生物量為考察指標，較優(yōu)水平組合為A3B2C2D2。以富集鐵作為考查指標，較優(yōu)水平組合為A3B3C2D2。正交試驗的主要指標是生物量，次要指標是富集鐵，兩指標都是越大越好。對照表2，最優(yōu)組合A3B2C2D2在已做過的試驗中未有出現(xiàn)，與它比較接近的是第8號和9號試驗。

表3和表4為生物量和富集鐵的方差分析結果。

圖17 生物量為考察指標的因素水平趨勢圖Fig.17 The level factor trend by biomassas index

圖18 富集鐵為考察指標的因素水平趨勢圖Fig.18 The level factor trend by theenrichmentof iron as index

可以看出，大豆粉、蔗糖、裝液量對于蛹蟲草富鐵培養(yǎng)的生物量和富集鐵都有顯著的影響，大小依次為大豆粉＞蔗糖＞裝液量，而接種量對蛹蟲草富鐵培養(yǎng)的生物量和富集鐵影響不大。所以也不能通過方差分析結果判斷第8號試驗和第9號試驗哪個是最優(yōu)方案。為了進一步驗證分析結果，重新安排最優(yōu)方案A3B2C2D2的蛹蟲草富鐵培養(yǎng)試驗，測的其生物量為18.93 g/L，富集鐵為16.01mg/g，高于正交試驗的全部結果。得出，蛹蟲草富鐵培養(yǎng)的最佳組合為：大豆粉35 g/L，蔗糖30 g/L，接種量為5%，裝液量為100mL/250mL。

表3 生物量方差分析表Table3 The varianceanalysising tableof biom ass

表4 富集鐵方差分析表Table4 The varianceanalysising tableof theenrichmentof iron

4 結論

通過設計單因素、多因素試驗，研究了蛹蟲草富鐵液體搖瓶發(fā)酵過程中各營養(yǎng)條件和培養(yǎng)條件對蛹蟲草生物量和富集鐵的影響，確定蛹蟲草富鐵的最佳營養(yǎng)條件為：大豆粉35g/L，蔗糖30 g/L，KH2PO41.5g/L，MgSO41.5 g/L，硫胺素5×10-5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3 g/L。最佳培養(yǎng)條件為：pH 6，培養(yǎng)溫度26℃，培養(yǎng)時間3 d，接種量5%，裝液量每100mL/250mL三角瓶。在此條件下，進行蛹蟲草富鐵的搖瓶發(fā)酵試驗，測得富鐵蛹蟲草的生物量為18.93 g/L，富集鐵為16.01mg/g，高于其他營養(yǎng)和培養(yǎng)條件下發(fā)酵的生物量和富集鐵。為蛹蟲草富鐵大規(guī)模培養(yǎng)提供一定的借鑒。

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The Optim ization of Submerged Fermentation Condition of Iron-riched Cordycepsm ilitaris

LIHui-ying
（Nantong Polytechnic College，Nantong 226002，Jiangsu，China）

As Cordycepsmilitaris and iron elementhave been proved to have importantphysiological functions tohuman body.Through designing the single factorandmulti-factororthogonalexperiments to explore the optimization of submerged fermentation condition of iron-riched Cordycepsmilitaris.The best culturemedium formula of submerged fermentation had been determined by experiments as follows：soybeanmeal 35 g/L，sugar 30 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO41.5 g/L，thiamine 5×10-5g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.3 g/L.The bestculture condition had been achieved as follows：pH6，temperature 26℃，fermentation 3 days，inoculation quantity 5%，fluid volume 100 mL/250 mL of triangle flask.Under the optimal conditions of the submerged fermentation，itwas measured that the biomass of iron-riched Cordycepsmilitaris was 18.93 g/L，and the enrichment of iron was 16.01mg/g.

Cordycepsmilitaris；iron-riched；submerged fermentation；optimization

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.07.034

2016-06-23

李慧英（1982—），女（漢），講師，碩士，研究方向：生物制藥。