液質聯用測定芍藥甘草湯中3種有效成分的含量*

徐 玉 石鎮東 鄭小偉

浙江中醫藥大學基礎醫學院 浙江 杭州 310053

中藥研究

液質聯用測定芍藥甘草湯中3種有效成分的含量*

徐 玉 石鎮東 鄭小偉#

浙江中醫藥大學基礎醫學院 浙江 杭州 310053

目的：采用高效液相色譜聯用三重四級桿質譜(HPLC-MS/MS)測定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸及甘草次酸三種成分的含量。方法：色譜柱采用Eclipse Plus C18(2.1mm×50mm，1.8mm)；流動相為0.1%甲酸乙腈和0.1%甲酸水溶液，流速設定為0.3mL·min-1，柱溫為35℃，進行梯度洗脫。根據待檢測化合物的性質，優化相關定量分析的質譜參數，多重反應監測（MRM），進行數據的采集。結果：芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸及甘草次酸的含量分別為：160.46±3.82mg·ml-1，115.66±3.13mg·ml-1，8.34±0.34mg·ml-1。結論：本實驗精密性良好，重現性高，分析方法準確，定量數據可靠。

HPLC-MS/MS 芍藥甘草湯 芍藥苷 甘草酸 甘草次酸

芍藥甘草湯是《傷寒論》中配伍嚴謹、藥簡效佳的經典方劑，為后世醫家所推崇。本方僅由芍藥、甘草兩味中藥組成，具有柔肝止痙、緩急止痛的功效[1]。對芍藥甘草湯入血原型成分進行測定，發現芍藥甘草湯的藥效物質基礎為芍藥苷、甘草酸、甘草次酸[2]。本文采用高效液相色譜聯用三重四級桿質譜(HPLC-MS/MS)同時測定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸和甘草次酸的含量，為芍藥甘草湯藥效物質研究提供理論基礎。

1 實驗儀器及材料

1.1 實驗儀器：1290 HPLC-6460 QQQ/MS(Agilent，美國)；BS124S電子分析天平(賽利多斯科學儀器有限公司)；Milli-Q Biocel純水儀(美國Millipore公司)；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；RV10旋轉蒸發儀(德國IKA公司)；Freezone 6L冷凍干燥機(英國Labconco公司)。

1.2 實驗材料：甲酸（色譜級）購于阿拉丁公司；甲醇和乙腈（均為色譜級）均購于美國Tedia公司；白芍、炙甘草來自浙江中醫藥大學飲片廠；芍藥苷、甘草酸和甘草次酸標準品均購于中國藥品生物制品檢定所。

2 實驗方法

2.1 供試品制備：將白芍、炙甘草各12g，打碎后，加以500ml水侵泡1h，煎煮2h，重復煎煮2次，合并濾液，濃縮至150ml，－20℃保存備用。

2.2 對照品溶液配制：精密稱取對照品芍藥苷2.42mg、甘草酸1.97mg、甘草次酸2.36mg分別置于2ml容量瓶中，制成對照品母液；所得芍藥苷濃度為1.21mg·ml-1，甘草酸0.985mg·ml-1，甘草次酸1.18mg·ml-1。

2.3 標準曲線繪制：精密吸取不同比例的對照品母液，混合得到對照品混合溶液，然后將對照品混合溶液定容至2ml，得到系列濃度對照品溶液，用于標準曲線繪制，所得對照品濃度見表1。

表1 對照品濃度(g·ml-1)

2.4 供試品前處理：取芍藥甘草湯提取藥液20ml，采用冷凍干燥后，殘留物使用10ml色譜級甲醇超聲溶解0.5h，溶液5000r·min-1×5min離心，取上清液使用0.22μm有機濾膜過濾，濾液可進行液質分析。

2.5 色譜質譜條件優化：經過對色譜條件的優化，最終確定的色譜條件：色譜柱為Eclipse Plus C18(2.1× 50mm，1.8mm)；柱溫為35℃；流動相（A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈）；洗脫梯度（起始為5%B，保持1min，6min內增加至15%B，在11min內增加到22%B，在30min內升高到65%B，在32min內增加至95%B，保持1min，后運行時間設定為3min）；流速設定為0.3ml·min-1；進樣量為5ml。質譜條件為：氮氣干燥氣流速為9L/min，溫度設定為350℃，霧化氣壓力為3.1bar，毛細管電壓設定為3500V。檢測方式為多重反應監測（MRM），數據采集速率為2spectrum/s，優化后的質譜參數見表2。

表2 優化后的化合物質譜參數

3 方法學考察和結果

3.1 色譜質譜條件優化：使用乙腈-水二元系統，使用優化的梯度洗脫程序，良好分離了芍藥甘草湯中復雜成分。質譜條件優化過程中，主要優化了干燥氣流速，毛細管電泳，碎裂電壓以及碰撞能等，對于離子相應有較大影響的質譜參數。以芍藥苷為例說明優化程中，首先是使用全掃面(Scan)模式找到芍藥苷離子峰[M+COOH]-：m/z 525.2，使用負離子選擇離子檢測(SIM)和子離子掃描(PS)優化m/z525.2的碎裂電壓和碰撞能為120V和8eV；再分析子離子掃描得到的二級質譜結果(圖1)，確定芍藥苷的定量碎片離子m/z 449.2和m/z 121.0，并建立最終的多重反應檢測(MRM)的定量方法。甘草酸和甘草次酸的質樸定量方法通過相同過程建立。

圖1 芍藥苷(A)、甘草酸(B)和甘草次酸(C)二級質譜圖

3.2 標準曲線繪制：對照品按“2.3”方法處理，進樣分析，所得標準曲線如表3，相關系數R2均大于0.997，表明標準曲線線性關系良好。

表3 線性方程結果，定量限和檢測限

3.3 精密度、重復性及回收率實驗：吸取一定濃度對照品，按“2.5”條件連續進樣6次，測定3種對照品的濃度，分別計算相對標準偏差（RSD）。其結果均小于4%，表明方法穩定，精密度、重復性及準確度良好。見表4。

表4 有效成分定量結果

3.4 檢測限和定量限：取已知濃度的標樣溶液，按照“2.5”方法進樣分析；以10倍信噪比為定量限，以3倍信噪比為檢測限，得到定量限和檢測限結果見表3。

3.5 樣品含量測定：分別精密吸取芍藥甘草湯供試品，按照“2.4”供試品處理方法處理，進樣測定，平行進樣3次。采用外標法計算芍藥苷、甘草次酸及甘草酸的含量，結果見表4（n=3）。

4 結論

使用現代分析技術建立能被廣泛接受的質量控制方法，可以使傳統中藥的應用變得有理有據[3]。本文采用HPLC/MS-MS同時測定芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸和甘草次酸的含量。優化了毛細管電壓、霧化器壓力、干燥氣溫度和流速等離子源參數；使用全掃描找到目標化合物母離子，然后使用選擇離子監測、自離子掃描分別優化了碎裂電壓和碰撞能等質譜參數，建立了精密性良好、重現性高、準確的分析方法，定量測定了芍藥甘草湯中芍藥苷、甘草酸、甘草次酸的含量，這有助于芍藥甘草湯的質量控制。

[1]高秀飛,胡嬋娟,陳曉潔.芍藥甘草湯加減治療乳腺癌化療期尿路感染療效觀察[J].浙江中醫雜志,2013,48(3)：183.

[2]陳梅.芍藥甘草湯入血成分的研究[D].南京：南京中醫藥大學,2010.

[3]周建良,齊煉文,李萍.色譜指紋圖譜在中藥質量控制中的應用[J].色譜,2008,26(2)：153-159.

2016-07-24

國家自然科學基金項目微小RNAs和長鏈非編碼RNA對胃潰瘍肝郁脾虛證線粒體低氧調控機制的研究，編號:81473596

# 通訊作者：鄭小偉，E-mail：zhxw2103@163.com