IFN-α通過IFI16抑制人腦血管外膜成纖維細胞增殖并促進細胞凋亡①

黃 晶 宋 方 龍向淑 田茂波 吳 強

(貴州省人民醫院心內科，貴陽550002)

IFN-α通過IFI16抑制人腦血管外膜成纖維細胞增殖并促進細胞凋亡①

黃 晶 宋 方 龍向淑 田茂波 吳 強

(貴州省人民醫院心內科，貴陽550002)

目的：探討干擾素-α(IFN-α)是否通過誘導干擾素誘導蛋白16(IFI16)表達抑制人腦血管外膜成纖維細胞(HBVAFs)增殖與促進細胞凋亡。方法：應用轉染針對IFI16基因的小干擾RNA(siRNA)和/或IFN-α瞬時干預體外培養的HBVAFs。通過蛋白免疫印跡(Western blot)法和Real-time PCR法測定細胞中IFI16、P53、P21蛋白和mRNA表達水平的變化。用MTT法檢測細胞活力，流式細胞術測定細胞周期及凋亡。結果：與未干預組比較，IFN-α(2 000～5 000 kU/L)干預HBVAFs后，IFI16蛋白表達水平明顯上調，但不同濃度IFN-α組之間無統計學差異。使用2 000 kU/L IFN-α可誘導HBVAFs中P53及P21蛋白和mRNA表達水平上調，同時抑制細胞增殖與促進細胞凋亡。但在轉染了IFI16 siRNA的HBVAFs中IFN-α的上述作用受到了抑制。結論：IFN-α抑制HBVAFs增殖與促進其凋亡的作用可能部分與其誘導IFI16表達有關。

干擾素誘導蛋白；干擾素-α；血管外膜成纖維細胞；增殖；凋亡

作為動脈管壁外膜最重要的細胞成分血管外膜成纖維細胞(Vascular adventital fibroblasts，VAFs)，其增殖、參與血管內膜和中膜的形成、分泌胞外基質及遷移等作用，參與了血管增殖性疾病(如高血壓、動脈粥樣硬化、冠狀動脈搭橋術后及支架植入術后再狹窄等)主要的病理生理過程[1-3]。干擾素(Interferon，IFN)通過表達多種IFN誘導蛋白發揮抑制增殖、促進凋亡、干預細胞分化等作用[4]。前期研究發現IFN-α能抑制VAFs及血管內皮細胞、血管平滑肌細胞的增殖，促進VAFs凋亡[5-7]；IFN-β不但能抑制細胞增殖還能抑制動脈粥樣硬化的進程[8]。干擾素誘導蛋白16(Interferon-inducible protein 16，IFI16)是IFN誘導蛋白p200家族的人源蛋白成員之一，研究發現IFI16參與了細胞增殖、凋亡的調控[9]。前期研究發現IFN-α可通過誘導該蛋白家族成員p204(該蛋白結構與IFI16相似)表達抑制大鼠主動脈外膜VAFs增殖，促進大鼠血管平滑肌細胞凋亡[10，11]。但IFN-α對VAFs增殖與凋亡的影響是否與其誘導IFI16表達有關尚未見文獻報道。本研究擬觀察IFN-α對VAFs增殖與凋亡的影響及IFI16表達變化，為研究IFN及其誘導蛋白運用于防治血管增殖性疾病提供更多理論及實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人腦血管外膜成纖維細胞(Human brain vascular adventitial fibroblasts，HBVAFs)細胞株(ScienCell公司)。DMEM高糖培養基和胎牛血清(HyClone公司)。IFN-α(北京三元基因工程有限公司)。噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒、SDS-PAGE凝膠試劑盒、細胞周期與凋亡檢測試劑盒(碧云天公司)。Real-time PCR熒光染料試劑(TaKaRa公司)。人β-actin引物上游：TGGCACCACACCTTCTACAATG，下游：TCATCTTCTCGCGGTT-GGC；人IFI16引物上游：GAAGTGCCAGCGTAAC-TCCTA，下游：TACCTCAAACACCCCATTCAC;人p53引物上游：CTCCTCAGCATCTTATCCGAG，下游：GCTGTTCCGTCCCAGTAGATTA，人p21引物上游ATGTGGACCTGTCACTGTCTTG，下游ATTAGGGCT-CCTCTTGGAGAA(上海生工生物公司)。逆轉錄試劑(Fermentas公司)。P53抗體、P21抗體(EPITOMICS公司)。IFI16 siRNA(h)、Control siRN-A-A、siRNA transfection medium、siRNA transfection reagent、IFI16抗體、β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 HBVAFs的培養 從液氮罐中取出HBVAFs細胞凍存管經37℃水浴，再經10倍體積DEME培養液(含10%胎牛血清)漂洗。1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入1 ml上述培養液吹打重懸細胞，加培養液至4 ml后，置于37℃含5%CO2培養箱內。24 h后更換新培養液。采用復蘇后第3代生長狀態良好的細胞用于實驗。

1.2.2 分組 實驗分為7組，正常培養為Negative組；用終濃度2 000～5 000 kU/L IFN-α分別干預24 h 后，即獲2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組。在Negative組中轉染質控siRNA和針對IFI16基因的siRNA 48 h后，用2 000 kU/L IFN-α處理24 h 后分別為Control siRNA組和IFI16 siRNA組。每實驗組均設3個復孔，實驗重復 3 次。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達 按Trizol法提取總RNA后，42℃ 60 min，70℃ 5 min合成cDNA。Real-time PCR采用95℃ 30 s預變性，95℃ 5 s，60℃ 34 s，重復循環40次。95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s進行熔解曲線。計算各組IFI16、P53、P21 mRNA的相對表達量。

1.2.4 Western blot檢測蛋白表達 通過細胞裂解液(RIPA)提取細胞蛋白。蛋白定量后加入SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水5 min變性。濕法轉膜轉移蛋白條帶至NC膜。常溫下5%脫脂奶粉封閉1 h；TBST洗膜；加入一抗工作液4℃過夜孵育(IFI16抗體稀釋度1∶500；P53、P21抗體稀釋度1∶1 000；β-actin抗體稀釋度1∶5 000)；TBST洗膜；37℃孵育二抗1 h；TBST洗膜；ECL化學發光；X光膠片顯影、定影后對膠片進行掃描。BandScan 4.3軟件計算IFI16、P53、P21與β-actin吸光度比值。

1.2.5 MTT 檢測細胞增殖活力 收集對數增殖期細胞，按細胞數4×103個/孔接種于96孔板，各組細胞繼續培養48 h后按噻唑藍(MTT)細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書測定細胞增殖活性。

1.2.6 流式細胞儀檢測細胞周期 按細胞周期與凋亡檢測試劑盒說明書測定DNA含量分析與凋亡。

2 結果

2.1 干預后對IFI16、P53和P21表達的影響 與Negative組比較，2 000、3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組中IFI16蛋白及mRNA表達水平升高(P<0.05)；與2 000 kU/L，3 000、4 000、5 000 kU/L IFN-α組間IFI16蛋白及mRNA表達無統計學意義。與2 000 kU/L IFN-α組比較，IFI16 siRNA組中IFI16、P53、P21蛋白及mRNA表達水平下降(P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α組與Control siRNA組間差異無統計學意義(圖1、2)。

圖1 干預后IFI16蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表達情況Fig.1 Effect of intervention factors on expression of IFI16 protein and mRNA in HBVAFsNote：1.Negative；2.2 000 kU/L IFN-α;3.3 000 kU/L IFN-α;4.4 000 kU/L IFN-α;5.5 000 kU/L IFN-α.*.P<0.05 vs negative.

圖2 干預后IFI16、P53、P21蛋白和mRNA水平在HBVAFs中的表達情況Fig.2 Effect of intervention factors on the expression of IFI16，P53,P21 protein and mRNA in HBVAFsNote：*.P<0.05 vs negative；#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

圖3 干預后對HBVAFs細胞增殖與凋亡影響Fig.3 Effect of intervention factors on cell proliferation and apoptosis of HBVAFsNote：*.P<0.05 vs negative，#.P<0.05 vs 2 000 kU/L IFN-α.

2.2 IFN-α對細胞增殖、凋亡的影響 與Negative組比較，2 000 kU/L IFN-α組MTT吸光度A值減低(P<0.05)，G0/G1期細胞與凋亡細胞數增多，S期細胞數減少 (P<0.05)。與2 000 kU/L IFN-α組比較，IFI16 siRNA組MTT吸光度A值增加(P<0.05)，G0/G1期細胞與凋亡細胞數減少，S期細胞數增多 (P<0.05)。2 000 kU/L IFN-α組與Control siRNA組間差異無統計學意義(圖3)。

3 討論

血管壁內、中、外膜主要由血管內皮細胞、血管平滑肌細胞與VAFs組成。長期以來均將前兩者視為血管增殖性疾病病理改變的關鍵作用靶點，VAFs僅作為“旁觀者”起著營養與支持的作用[1]。然而隨著研究的深入，發現在血管損傷后血管重構過程中，VAFs增殖活性、合成細胞外基質以及轉化為肌成纖維細胞能力明顯增強[12,13]。因此VAFs在血管增殖性疾病的發生、發展過程并非旁觀者而是像“哨兵”一樣起著關鍵的作用[3]，故促進VAFs增殖及其凋亡是防治上述疾病的措施之一。

IFN分為Ⅰ型(IFN-α、β、τ等)、Ⅱ型(IFN-γ)與Ⅲ型(IFN-λ)，是一組具有多種生物學效應(如抗增殖、調節免疫應答、抗病毒等)的活性細胞因子家族。體外實驗證實IFN-α能抑制血管壁細胞增殖[5-7]。動物實驗發現動脈球囊損傷后通過在損傷局部轉染過表達IFN-β或腸外給予IFN-γ能抑制新生內膜的形成與血管平滑肌細胞增殖[14,15]，提示在血管增殖性疾病的治療過程中運用IFN是可行的。本研究結果也同樣顯示IFN-α能抑制HBVAFs增殖與促進其凋亡。

IFI16蛋白作為IFN誘導蛋白p200家族成員在上皮細胞、成纖維細胞、內皮細胞、單核/巨噬細胞、淋巴細胞、部分腫瘤細胞等胞核與胞質中存在表達[16,17]，并能被IFN-α、β、γ等誘導表達[17]。IFI16蛋白氨基端有參與蛋白與蛋白相互作用的PYD構域與核定位序列(Nuclear localization sequences，NLS)，二者通過與凋亡、炎性反應信號通路相關蛋白之間的相互結合參與細胞增殖、凋亡、分化及炎癥反應調控等過程[16]。本研究通過Westem blot表明，IFI16蛋白在HBVAFs中存在基礎表達，并且IFN-α干預HBVAFs 24h后能誘導IFI16蛋白表達，但在2 000～5 000 kU/L濃度范圍內誘導IFI16表達未呈現劑量依賴性。因此推測在HBVAFs中IFI16可能是發揮IFN-α多種生物學功能的重要下游蛋白之一。抑癌基因p53能夠通過下游基因p21抑制細胞周期進程促進細胞凋亡與老化[18]。有研究發現，IFI16蛋白通過p53、p21通路抑制臍靜脈內皮細胞增殖,但在感染人乳頭狀瘤病毒而永生化的HUVEC 中，由于致癌基因E6和E7抑制p53的活性，導致IFI16抑制增殖的作用受到明顯限制[19]。亦有研究發現，在人胚胎腎細胞293中轉染IFI16基因后，IFI16蛋白200A結構域中的MFHATVATIF基序與p53羥基端結合，增加p53的表達，從而抑制細胞增殖[20]。而在乳腺癌細胞中上調IFI16蛋白表達能通過活化p53的bax啟動子激活p53的表達，并增加其下游目的基因p21表達，從而激活p53介導的細胞凋亡與增殖抑制[21]。大量的研究說明IFI16在調控細胞增殖與凋亡過程中與p53/p21等細胞周期調控蛋白存在密切關系。本研究結果顯示，在2 000 kU/L IFN-α干預HBVAFs后更多的細胞停滯在G0/G1期，凋亡細胞數亦有所增加。IFN-α在誘導IFI16表達增加的同時P53與P21的表達也上調了。然后沉默IFI16基因后IFN-α誘導的上述作用受到了限制。無論誘導IFI16過表達還是抑制IFI16表達，P53與P21蛋白及mRNA表達水平均與其呈一致性變化趨勢，這表明IFI16在抑制VAFs增殖與促進凋亡過程中可能與誘導P53和P21表達有關。提示IFN-α抑制HBVAFs增殖，促進其凋亡過程中，P53/P21可能作為IFI16的下游蛋白而發揮其作用。

綜上所述，IFN-α能促進IFI16、P53、P21表達，抑制VAFs增殖，誘導其凋亡，推測IFI16可能參與了IFN-α對VAFs增殖、凋亡的調控，P53/P21途徑可能參與該生物學效應的下游調控。從而為IFN及其誘導蛋白應用于血管增殖性疾病提供更多的理論依據。

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[收稿2016-05-16 修回2016-06-24]

(編輯 許四平)

Interferon alpha suppresses proliferation and induces apoptosis of human brain vascular adventitial fibroblasts via IFI16

HUANGJing，SONGFang,LONGXiang-Shu,TIANMao-Bo,WUQiang.

DepartmentofCardiology,GuiyangProvincePeople′sHospital,Guiyang550002，China

Objective:To study interferon alpha (IFN-α) inhibition of proliferation and apoptosis induction of human brain vascular adventitial fibroblasts(HBVAFs)via IFI16.Methods：Cultured HBVAFs were treated with transfection IFI16 siRNA and/or IFN-α in vitro instantaneously.The protein and mRNA levels of IFI16，P53，P21 were measured by Western blot and Real-time PCR.MTT was used to detect the cell proliferation of the HBVAFs.Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry.Results：IFN-α with terminal concentration of 2 000-5 000 kU/L induce significantly expression of IFI16 in HBVAFs,without any significant difference.Stimulated with 2 000 kU/L IFN-α up-regulated the expression of P53,P21 at protein and mRNA levels，and inhibited the cell proliferation and promote cells apoptosis in HBVAFs.Such effect was restrained by transfection with IFI16 siRNA into HBVAFs.Conclusion：IFN-α inhibits HBVAFs proliferation and induces apoptosis may partly relate to the increased IFI16 expression.

Interferon-inducible protein；IFN-α；Vascular adventitial fibroblasts；Proliferation；Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.003

①本文為國家自然科學基金項目(No. 81260030)。

黃 晶(1988年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事冠心病基礎與臨床方面的研究，E-mail：herenwushui@sohu.com。

及指導教師：吳 強(1969年-)，男，博士，主任醫師，主要從事冠心病基礎與臨床方面的研究，E-mail：gzgywq@126.com。

R363

A

1000-484X(2017)04-0494-04