支氣管哮喘患者外周血Th17與Th9細胞的變化及臨床意義①

周 晴 傅 玉 胡良安 李 倩 金 夢 江 娥

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,重慶400016)

支氣管哮喘患者外周血Th17與Th9細胞的變化及臨床意義①

周 晴 傅 玉 胡良安 李 倩 金 夢 江 娥

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科,重慶400016)

目的：探討Th17、Th9細胞水平在支氣管哮喘患者中的表達及其臨床意義。方法：選取67例哮喘患者為研究對象，30例健康體檢者為對照組，根據(jù)全球哮喘防治倡議(GINA)將哮喘患者分為間歇與輕度持續(xù)組20例，中度持續(xù)組25例和重度持續(xù)組22例。收集患者臨床資料，完成哮喘控制測試(ACT)評分、肺功能和呼出氣一氧化氮(FeNO)值測定，流式細胞儀檢測外周血PBMC中CD3+CD8-IL-17+、CD3+CD8-IL-9+細胞水平。結果：與健康對照組相比，哮喘患者Th17、Th9細胞水平均明顯升高(P<0.05)；中重度哮喘患者Th17及Th9細胞水平顯著高于間歇與輕度哮喘組(P<0.05)，而間歇與輕度哮喘組患者與健康對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。哮喘患者外周血Th17及Th9細胞的表達均與FeNO值正相關(r值依次為0.501、0.438；P<0.05)，與ACT評分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF負相關(r值依次為-0.441、-0.362；-0.307、-0.377；-0.419、-0.411；-0.428、-0.324；P<0.05)，同時Th17與Th9細胞在哮喘患者外周血中的表達率正相關(r值為0.443，P<0.05)。結論：Th17、Th9細胞在哮喘患者中高表達，具有協(xié)同致炎作用，且與癥狀嚴重程度相關，提示Th17及Th9細胞對哮喘患者病情評估有潛在的參考價值。

Th17細胞；Th9細胞；哮喘；肺功能

支氣管哮喘是由多種細胞(如氣道上皮細胞、成纖維細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞、肥大細胞和平滑肌細胞等)及其細胞組分參與的一種慢性氣道炎癥性疾病。免疫功能異常是其重要的發(fā)病機制[1]。輔助性T淋巴細胞(T helper cell,Th細胞)在哮喘氣道慢性炎癥中發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。Th2細胞占優(yōu)勢的Th1/Th2 細胞失衡是哮喘發(fā)病的經(jīng)典免疫學機制，被認為是哮喘氣道嗜酸細胞性炎癥形成及發(fā)展的免疫學基礎[2]，但最近研究表明，Th17與Th9細胞也參與了導致哮喘發(fā)病的免疫紊亂過程[3,4]。Th17細胞可能通過募集、活化中性粒細胞到達炎癥部位，發(fā)生炎癥反應；而Th9細胞與過敏、氣道高反應性密切相關。但Th17和Th9細胞是否與哮喘的癥狀嚴重程度相關及兩者在哮喘中是否存在協(xié)同致炎作用，目前尚未闡明。因此，本研究通過檢測哮喘患者外周血Th17、Th9細胞的水平，分析兩者與哮喘控制測試(Asthma control test，ACT)評分、肺功能和呼出氣一氧化氮(Fractional exhaled nitric oxide,FeNO)值的相關性，初步探討Th17和Th9細胞免疫途徑在哮喘發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、試劑 抗人CD3-PEcy5單克隆抗體、抗人CD8-FITC單克隆抗體均購自Biolegend公司；抗人IL-17-PE單克隆抗體、抗人IL-9-eFluor 660單克隆抗體均購自eBioscience公司；RPMI1640培養(yǎng)液、胎牛血清購自Gibco公司；固定劑、破膜劑購自BD公司；刺激劑PMA-Ionomycin和阻斷劑BFA-Monomycin購自杭州聯(lián)科生物技術公司；淋巴細胞分離液購自天津灝洋生物技術公司；Th17、Th9細胞檢測采用美國BD公司FACSVantage流式細胞分析儀及流式結果分析系統(tǒng)；肺功能儀采用德國Jeager肺功能儀；FeNO值測定采用瑞典Aerocrine檢測儀。所有試劑均嚴格按照說明書保存和操作。

1.2 實驗方法

1.2.1 研究對象 選取2015年3月至2016年5月在我院呼吸內(nèi)科就診的哮喘患者67例，所有患者均符合支氣管哮喘診斷標準[5]。根據(jù)全球哮喘防治倡議(Global initiative for asthma,GINA)[6]，將患者分為間歇與輕度持續(xù)組(20例)，中度持續(xù)組(25例)和重度持續(xù)組(22例)。同時選取我院門診健康體檢者30例為正常對照組，所有健康體檢者無抽煙史、過敏性家族史和自身免疫病史。所有研究對象在4周內(nèi)未使用全身激素治療和免疫抑制劑，2周內(nèi)無急性感染；并排除合并其他肺部疾病、妊娠、腫瘤及其他自身免疫性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均知情同意后，收集基本資料及標本。

1.2.2 肺功能及FeNO值測定 對入組患者進行常規(guī)肺功能檢測和FeNO值測定，操作參照中華醫(yī)學會呼吸病學分會規(guī)范進行。肺功能重復測3次，每次數(shù)值變化不超過5%，取最佳值，計算第1秒用力呼氣容積(Forced expiratory volume in 1 second,FEV1)，第1秒用力呼氣容積占用力肺活量比值(FEV1/forced vital capacity,FEV1/FVC)和最大呼氣峰值流速(Peak expiratory flow,PEF)，結果以占正常預計值的百分比表示。檢測FeNO水平時要求患者在平靜狀態(tài)下，將肺內(nèi)氣體吹盡后迅速含住過濾器，用力吸氣5 s后，以平均50 ml/s的呼氣速度勻速呼氣10 s，F(xiàn)eNO值以十億分之一(Parts per billion，PPB)表示。

1.2.3 ACT問卷調(diào)查 ACT問卷主要包括5個方面：活動受限、喘息癥狀、夜間哮喘癥狀、急救藥物(如沙丁胺醇)的使用頻次和患者對哮喘控制情況的自我評估。每一方面包括5個選項，對應1～5分，最后將得分相加計算總分。得分25分為哮喘完全控制，20～24分為哮喘部分控制，低于20分為哮喘未控制。

1.2.4 檢測外周血Th17、Th9細胞 收集哮喘患者和健康對照者靜脈血4 ml，經(jīng)肝素抗凝，采用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞(Perpheral blood mononuclear cell,PBMC)。用RPMI1640培養(yǎng)液重懸PBMC并調(diào)整細胞濃度為2×106ml-1，然后接種于24孔板，加入4 μl/ml PMA-Ionomycin，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱孵育6 h，最后2 h加入4 μl/ml的BFA-Monom-ycin。收集細胞用PBS洗滌2次，加入CD3-PEcy5單克隆抗體和CD8-FITC單克隆抗體，室溫、避光孵育30 min，再依次加入固定劑、破膜劑各100 μl，孵育15 min后，加入IL-17-PE單克隆抗體和IL-9-eFluor 660單克隆抗體，混勻、室溫、避光孵育30 min，對照管加入相應的同型對照。孵育結束后，加入PBS重懸，進行流式細胞儀檢測。由于PMA刺激會誘發(fā)細胞表面CD4分子被內(nèi)吞[7]，所以我們采用CD3+CD8-表面標記法間接定義CD4+T細胞[8,9]，CD3+CD8-IL-17+T細胞標記為Th17細胞，CD3+CD8-IL-9+T細胞標記為Th9細胞。

2 結果

2.1 臨床資料和肺功能比較 研究組在性別、年齡、體重指數(shù)(Body mass index,BMI)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。隨病情嚴重程度增加，哮喘患者的FeNO值明顯升高，并伴隨ACT評分降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。重度哮喘組的肺功能指標FEV1、FEV1/FVC及PEF較間歇與輕度哮喘組均明顯降低(P<0.05)。各組研究對象的基本資料見表1。

2.2 哮喘組與對照組外周血Th17、Th9細胞水平比較 圖1為研究對象代表性流式細胞分析圖。與健康對照組相比，哮喘組患者外周血Th17及Th9細胞水平均顯著高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.3 不同哮喘嚴重程度組間外周血Th17、Th9細胞比較及二者相關性 隨病情嚴重程度的增加，哮喘患者外周血Th17、Th9細胞比例明顯增加。中、重度哮喘患者外周血Th17及Th9細胞水平均顯著高于間歇與輕度持續(xù)組(P<0.05)，而間歇與輕度持續(xù)組患者與健康對照組比較，Th17及Th9細胞水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。同時，Th17和Th9細胞在哮喘患者外周血PBMC中的表達率顯著正相關(r=0.443,P=0.001)，見圖2。

2.4 相關性分析 Spearman相關性分析結果顯示，外周血PBMC中Th17及Th9細胞水平與哮喘患者氣道炎癥指標FeNO值顯著正相關(P<0.05)，與ACT評分、肺功能指標FEV1、FEV1/FVC及PEF均呈顯著負相關(P<0.05)，見表4。

表2 哮喘組和對照組Th17、Th9細胞水平

Tab.2 Levels of Th17 and Th9 cells in asthma patients and healthy controls

GroupsnTh17(%)Th9(%)Control300 51±0 160 55±0 21Asthma671 17±0 551)1 23±0 611)

Note：1)P<0.05 vs control group.

表1 研究對象的臨床特征和肺功能

Tab.1 Patient characteristics and pulmonary function

CharacteristicsIntermittenttomildpersistentModeratepersistentSeverepersistentHealthycontrolNumber20 25 2230Age(years)49 00±13 9449 67±7 7345 21±14 1644 77±11 44Females(%)50 00 48 00 45 4553 33BMI(kg/m2)23 66±3 5023 95±2 7424 16±3 0722 53±1 57FeNO(PPB)26 43±7 1254 82±14 561)75 89±19 811)2)ACT20 37±2 2016 06±2 691)14 14±3 001)2)FEV1(%)81 54±10 1977 81±12 1072 10±19 361)FEV1/FVC(%)94 29±12 5381 29±13 271)68 95±15 901)2)PEF(%)92 69±14 8079 21±14 101)75 35±19 681)

Note：1)P<0.05 vs intermittent to mild persistent;2)P<0.05 vs moderate persistent.

圖1 流式細胞術檢測兩組間Th17、Th9細胞比例Fig.1 Th17 and Th9 cell levels in two groups were measured by flow cytometryNote：CD3+CD8-IL-17+ T cell was marked for Th17 cell,CD3+CD8-IL-9+ T cell was marked for Th9 cell；A.Th17 cell level of control group；B.Th17 cell level of asthma group；C.Th9 cell level of control group；D.Th9 cell level of asthma group.

表3 哮喘各組Th17及Th9細胞水平

Tab.3 Levels of Th17 and Th9 cells in subgroups of asthma

GroupsIntermittenttomildpersistentModeratepersistentSeverepersistentHealthycontrolTh17(%)0 70±0 271 21±0 461)2)1 61±0 441)2)3)0 51±0 16Th9(%)0 71±0 291 03±0 241)2)1 97±0 321)2)3)0 55±0 21

Note：1)P<0.05 vs healthy control;2)P<0.05 vs intermittent to mild persistent;3)P<0.05 vs moderate persistent.

圖2 哮喘患者PBMC中Th17(%)與Th9(%)細胞的相關性Fig.2 Correlation analysis between percentages of Th17 cells and Th9 cells in PBMC of asthma patients

表4 Th17及Th9細胞水平與臨床指標的相關性分析

Tab.4 Correlations analysis between levels of Th17 or Th9 cells and clinical characteristics

ItemTh17(%)rPTh9(%)rPFeNO0 5010 0000 4380 000ACT-0 4410 000-0 3620 004FEV1(%)-0 3070 017-0 3770 003FEV1/FVC(%)-0 4190 001-0 4110 001PEF(%)-0 4280 001-0 3240 012

3 討論

哮喘的病理本質(zhì)是一種慢性氣道炎癥性疾病，傳統(tǒng)觀點認為Th2及其相關細胞因子介導的嗜酸粒細胞浸潤等病理變化參與并維持過敏性哮喘的發(fā)病，且與癥狀嚴重程度正相關[10]；而Th17、Th9細胞的發(fā)現(xiàn)與研究，完善了Th1/Th2細胞失衡為哮喘發(fā)病機制這一傳統(tǒng)觀點。

作為Th17細胞的特異性因子IL-17，可誘導體內(nèi)單核巨噬細胞等產(chǎn)生多種前炎癥因子，介導機體炎癥反應和自身免疫性疾病的發(fā)生[11]；同時，其募集、活化中性粒細胞的生物學功能，已被證實與中性粒細胞炎癥和氣道重塑相關[12]。相關研究表明，與健康對照組相比，Th17細胞在哮喘患者的痰液、肺組織、支氣管黏膜下組織和外周血中均升高[13，14]。Th17細胞參與的細胞炎癥反應是機體的過繼免疫反應，而后者的特點具有特異性和持久存在，這似乎給哮喘細胞炎癥提供了一個更合理的解釋機制[15]。在本研究中，哮喘患者外周血Th17細胞水平較健康對照組明顯升高，結果與以往研究報道一致。進一步分析表明，隨著病情嚴重程度加重，Th17細胞比例逐漸升高，中、重度哮喘組Th17細胞比例升高較間歇與輕度哮喘組相比有統(tǒng)計學意義。相關性分析顯示，Th17細胞水平與氣道炎癥指標FeNO值顯著正相關，與ACT評分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF顯著負相關，說明Th17細胞參與T細胞介導的系統(tǒng)性炎癥反應并維持氣道炎癥。ACT評分與肺功能是反映患者癥狀控制情況和臨床預后的重要參考指標，表明Th17細胞水平在一定程度上可反映患者病情管理情況。

Th9細胞是一種新型Th細胞亞群，主要分泌IL-9、IL-10和IL-21，其中IL-9與哮喘發(fā)生的遺傳有關，其編碼基因位于5號染色體(5q31-33)，該區(qū)域的連鎖不平衡與多態(tài)性表明，IL-9與過敏、氣道高反應性、總免疫球蛋白E水平升高密切相關[16]。目前Th9細胞已成為變態(tài)反應疾病的研究熱點，但它在發(fā)病中所起的作用仍然未知。雖然最近研究已證明，哮喘患者的支氣管黏膜組織、肺組織和外周血中的IL-9表達水平均升高，但是不能排除是從其他細胞來源的IL-9起作用[17]。Th9細胞來源的IL-9通過增加呼吸道炎性細胞的浸潤和激活，從而加重過敏性疾病的癥狀[18]。Jones等[19]報道了哮喘患者外周血中Th9細胞比例升高，但缺少其與病情嚴重程度的相關性研究。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)隨著哮喘病情嚴重程度加重，Th9細胞水平升高，且Th9細胞水平與FeNO值顯著正相關，與ACT評分、肺功能FEV1、FEV1/FVC及PEF顯著負相關，說明Th9細胞水平可以反映哮喘病情嚴重程度和氣道炎癥水平。同時本研究還分析了在哮喘患者外周血中，Th17與Th9細胞比例正相關，所以我們推測兩者在介導炎癥病理過程中發(fā)揮協(xié)同致炎作用，但兩者相互作用的確切機制有待進一步研究。

綜上所述，哮喘患者外周血Th17和Th9細胞水平隨著病情嚴重程度的加重而明顯升高，且與氣道炎癥指標正相關，與肺功能、病情控制評分負相關，提示Th17、Th9細胞在哮喘發(fā)病及進展中發(fā)揮不可忽視的作用，對癥狀嚴重程度和預后評估有一定的參考價值。

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[收稿2016-09-19 修回2016-10-28]

(編輯 張曉舟)

Changes and clinical significance of Th17 and Th9 cells in patients with asthma

ZHOUQing,FUYu,HULiang-An,LIQian,JINMeng,JIANGE.

DepartmentofRespiratoryandCriticalCareMedicine,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China

Objective:To explore the expression of Th17 and Th9 cells and their clinical significance in patients with asthma.Methods：67 patients with asthma and 30 healthy subjects were enrolled in this study,according to GINA,the asthmatic patients were classified intermittent to mild persistent asthma(n=20),moderate persistent asthma(n=25)and severe persistent asthma(n=22).The characteristics of patients,Asthma control test(ACT) scores,pulmonary function and fractional exhaled nitric oxide(FeNO)were evaluated,the levels of CD3+CD8-IL-17+,CD3+CD8-IL-9+were determined by flow cytometric analysis.Results：The levels of Th17,Th9 cells were significantly higher in asthma patients compared with control group(P<0.05);moderate to severe persistent group showed a significant increase of Th17 and Th9 proportion compared with intermittent to mild persistent group,while there were no significance between intermittent to mild persistent asthma and control group(P>0.05).The expression of Th17 and Th9 cells were positively correlated with FeNO(r=0.503,0.438;P<0.05) while negatively correlated with ACT,FEV1,FEV1/FVC and PEF in the asthmatic patients(r=-0.441,-0.362;-0.307,-0.377;-0.419,-0.411;-0.428,-0.324;P<0.05).There were positive correlation between the expression of Th17 and Th9 cells(r=0.443;P<0.05).Conclusion：Th17 and Th9 cells highly increased in the patients with asthma have synergy inflammatory effect,which were associated with symptom severity.These results indicate that Th17 and Th9 cells may have a potential value to assess severity of asthma.

Th17 cell;Th9 cell;Asthma;Pulmonary function

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.019

①本文受國家臨床重點專科專項資助(民辦醫(yī)政函[2012]649號)。

周 晴(1991年-)，女，在讀碩士，主要從事呼吸系統(tǒng)疾病研究，E-mail:zhouqingzq163@163.com。

及指導教師：胡良安(1963年-)，男，教授，碩士生導師，主要從事肺癌、肺結核、哮喘方面的研究，E-mail:huliangan9@163.com。

R562.25

A

1000-484X(2017)04-0569-05