IL-22經Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細胞致纖維化作用①

石 城 雷榮娥 胡榜利 張沛玲 覃山羽 姜海行

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科,南寧530021)

IL-22經Wnt/β-catenin通路抑制肝星狀細胞致纖維化作用①

石 城 雷榮娥 胡榜利 張沛玲 覃山羽 姜海行

(廣西醫科大學第一附屬醫院消化內科,南寧530021)

目的：研究IL-22抑制HSC致肝纖維化的作用和機制，探索Wnt/β-catenin通路在肝星狀細胞(HSC)激活過程中的作用。方法：采用TGF-β1激活HSC，熒光定量PCR和Western blot檢測細胞激活過程中β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達變化情況。應用不同濃度和不同時間的重組大鼠IL-22刺激大鼠HSC，CCK8法檢測細胞增殖率，流式細胞術檢測細胞凋亡率。采用TGF-β1預處理HSC，再用最適濃度IL-22干預，對比干預前后HSC增殖情況，并檢測β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達變化情況。結果：TGF-β1激活HSC后，β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)。IL-22以濃度依賴性和時間依賴性抑制HSC增殖(P<0.05)，并降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)，但對HSC凋亡率無顯著影響(P>0.05)。IL-22可以顯著抑制TGF-β1誘導的HSC激活，并顯著降低β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達水平(P<0.05)。結論：Wnt/β-catenin參與了HSC激活和分泌α-SMA過程， IL-22以濃度依賴性和時間依賴性抑制HSC活性，這種作用可能是通過抑制Wnt/β-catenin通路實現的。

肝星狀細胞；白介素-22；Wnt/β-catenin通路

肝硬化是臨床常見重大疾病之一，目前仍未有較好的治療方法。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發展所共有的病理改變和必經途徑，肝星狀細胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活在肝纖維化的發生中起中心環節作用[1]。多種免疫因素通過激活HSC，促使其大量表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)和膠原蛋白，進而形成膠原纖維和細胞外基質，最終導致肝纖維化的發生和發展。

Wnt/β-catenin通路是機體調控器官發育，細胞增殖、遷移、分化、極化等過程中的重要通路之一，其中β-catenin是該通路的關鍵因子[2]。研究表明，異常激活的Wnt/β-catenin通路參與多種疾病發生過程，且Wnt/β-catenin通路的β-catenin在HSC激活過程中也發揮重要作用，抑制β-catenin表達可以降低HSC活性，減少膠原纖維的合成與分泌[3,4]。

IL-22是IL-10家族的成員，多種免疫細胞可以分泌IL-22。有研究表明IL-22通過抑制HSC活性減輕肝纖維化，用IL-22干預小鼠肝纖維化模型可以降低肝纖維化形成以及加速肝纖維降解[5]。然而IL-22抗肝纖維化的機制目前研究甚少。本研究將探索Wnt/β-catenin通路在IL-22抑制HSC的作用機制，為IL-22在抗肝纖維化的應用提供重要實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 大鼠肝星狀細胞株HSC-T6購自ATCC(American Type Culture Collection)公司并液氮保存使用；重組大鼠白介素-22(rrIL-22)、重組大鼠TGF-β1(rrTGF-β1)購買自R&D公司；總RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購買自寶生物工程(大連)有限公司；引物由上海生物工程技術服務公司設計合成；低溫高速離心機(Eppendrof公司)；流式細胞凋亡檢測試劑盒(BD公司)；流式細胞儀FACS Calibur(BD公司)；蛋白裂解液RIPA和BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術研究所)；PMSF蛋白酶抑制劑(Sigma公司)；單克隆β-catenin山羊抗兔一抗、單克隆α-SMA山羊抗兔一抗(Abcam公司)；GAPDH內參抗體(碧云天生物技術研究所)；0.45 μm PVDF膜(Merck Millipore公司)；熒光二抗(Li-COR公司)；Odyssey紅外激光成像系統(Li-COR公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與處理 HSC用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養液培養，37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養，含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化，每2 d傳代一次。

1.2.2 CCK8法檢測細胞增殖率 HSC細胞懸液(1×105ml-1)接種至96孔板(100 μl/孔)，不同濃度或不同時間的IL-22處理，每孔加CCK8試劑10 μl，37℃避光孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的OD值，細胞增殖率按公式計算：細胞增殖率(%)=[A(加藥)-A(空白)]/[A(未加藥)-A(空白)]×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 HSC經不同濃度IL-22處理后，使用不含EDTA胰酶消化收集細胞，4℃ 1 000 r/min離心5 min，預冷PBS洗滌細胞3次，1×Binding buffer重懸細胞并調整細胞濃度至1×106ml-1，取100 μl細胞懸液至Falcon流式管中，加5 μl FITC Annexin V和5 μl PI，室溫(25℃)避光孵育15 min后加400 μl 1×Binding buffer，1 h內流式細胞儀檢測，用CellQuest軟件分析1×105個細胞樣品。

1.2.4 q-PCR檢測mRNA表達水平 HSC經不同濃度IL-22處理以及TGF-β1激活后IL-22處理，PBS洗滌細胞2次，按總RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書將mRNA逆轉錄成cDNA，SYBR-Green熒光定量試劑盒檢測目的基因mRNA表達水平，基因引物序列見表1。ABI公司StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測，采用兩步法PCR標準擴增程序：95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個循環。采用2-ΔΔCT計算目的基因與內參基因GAPDH的相對表達量。

1.2.5 Western blot檢測蛋白表達水平 HSC經不同濃度IL-22處理以及TGF-β1激活后再予IL-22處理，含EDTA胰酶消化收集細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS洗滌細胞3次，RIPA裂解液與PMSF蛋白酶抑制劑按100∶1預混，25 cm2貼壁細胞加 300 μl 預混液冰上裂解15 min，4℃ 14 000 r/min離心 15 min 后取上清。BCA法測蛋白濃度，4份蛋白溶液與一份5×蛋白上樣緩沖液混勻后95℃ 10 min。等量蛋白(20 μg)上樣于10%SDS-PAGE膠中電泳90 min 分離，分離后的蛋白轉印至PVDF膜上，室溫下(25℃)5%脫脂牛奶封閉1 h，4℃一抗孵育過夜，TBST溶液洗膜3次，10 min/次。室溫下(25℃)熒光二抗孵育1 h，TBST溶液洗膜3次，10 min/次，熒光信號用Odyssey紅外激光成像系統檢測，蛋白灰度分析用Odyssey軟件進行。

表1 目的基因引物序列

Tab.1 Primers for target gene

TargetgenesForwardReverseβ?catenin5′?CTTACGGCAATCAGGAAAGC?3′5′?GACAGACAGCACCTTCAGCA?3′α?SMA5′?CCGAGATCTCACCGACTACC?3′5′?TCCAGAGCGACATAGCACAG?3′GAPDH5′?ACAGCAACAGGGTGGTGGAC?3′5′?TTTGAGGGTGCAGCGAACTT?3′

2 結果

2.1 HSC激活過程中Wnt/β-catenin通路和α-SMA改變 分別使用0、2.5、5 ng/ml濃度的TGF-β1干預HSC 48 h，檢測干預后細胞內β-catenin和α-SMA的mRNA和蛋白水平變化，結果顯示β-catenin 和α-SMA的mRNA和蛋白水平均隨著TGF-β1濃度增加而升高，見圖1A、B，提示HSC激活過程中伴隨著Wnt/β-catenin通路激活和α-SMA表達改變。

圖1 TGF-β1促進肝星狀細胞β-catenin和α-SMA表達Fig.1 TGF-β1 promotes HSC to secret β-catenin and α-SMANote：A.mRNA levels；B.Protein levels；There was a significant differences of mRNA and protein levels between the 5 ng/ml and 0 ng/ml of TGF-β1 group，*.P<0.05.

圖2 IL-22抑制肝星狀細胞增殖Fig.2 IL-22 inhibits proliferation of HSCNote：A.Concentration dependent manner；B.Time dependent manner；The cell proliferation rates was significantly decreased in 750 pg/ml and 1 000 pg/ml group compared with 0 pg/ml group，and also remarkably decreased in 48 h group compared with 12 h group after IL-22 intervention，*.P<0.05.

2.2 IL-22抑制HSC的增殖能力 分別使用0、250、500、750、1 000 pg/ml濃度IL-22干預HSC 48 h后，觀察細胞的增殖情況，結果顯示HSC增殖率隨著IL-22濃度增加呈下降趨勢，到750 pg/ml時的細胞增殖率顯著大于0 pg/ml(P<0.05)，見圖2A；再以1 000 pg/ml濃度IL-22分別干預HSC 12、24、36、48 h，觀察細胞的增殖和凋亡情況，結果顯示HSC增殖率隨IL-22濃度增加呈下降趨勢，在干預后48 h最顯著(P<0.05)，見圖2B。

HSC凋亡率隨著IL-22濃度增加呈升高趨勢，但各個濃度組間差異無統計學意義(P>0.05)，見圖3A；且IL-22干預的各時間段之間細胞凋亡率差異亦無統計學意義(P>0.05)，見圖3B。

2.3 IL-22抑制TGF-β1激活的HSC的增殖 以1 000 pg/ml 濃度IL-22 干預HSC 48 h后，與未干預的HSC相比，干預后HSC增殖率顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)；采用5 ng/ml濃度的TGF-β1預處理HSC 24 h，再給予1 000 pg/ml濃度的IL-22干預HSC 48 h，結果顯示(見圖4)，TGF-β1干預HSC后細胞激活，細胞增殖率明顯升高； 激活后的HSC再予IL-22干預，細胞增殖受到抑制，與未進行IL-22干預的HSC相比，干預后的HSC增殖率被顯著抑制(P<0.05)。

圖3 IL-22不影響肝星狀細胞凋亡Fig.3 IL-22 has no significant effect on apoptosis of HSCNote：A.Different concentration；B.Different time.

圖4 不同TGF-β1/IL-22組合干預HSC后細胞增殖率變化情況Fig.4 Cell proliferation rates of HSC treated with different combination of TGF-β1 and IL-22Note：IL-22 significantly inhibits proliferation of HSC in both TGF-β1 negative and positive group，*.P<0.05.

圖5 不同TGF-β1/IL-22組合干預HSC后β-catenin/α-SMA表達情況Fig.5 Expression levels of β-catenin,α-SMA mRNA and protein of HSC treated with different combination of TGF-β1 and IL-22Note：A.mRNA levels；B.protein levels；C.WB figure；IL-22 significantly inhibits the expression of β-catenin/α-SMA mRNA of HSC both in TGF-β1 negative and positive group,*.P<0.05.

2.4 IL-22抑制HSC和TGF-β1激活后HSC內的β-catenin、α-SMA表達水平 以1 000 pg/ml濃度IL-22 干預HSC 48 h后，細胞內的β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達水平下調，差異有統計學意義(P<0.05)。采用5 ng/ml濃度的TGF-β1預處理HSC 24 h，再給予1 000 pg/ml濃度的IL-22干預HSC 48 h，發現與未干預的HSC相比，干預后HSC的β-catenin、α-SMA mRNA和蛋白表達水平顯著降低(P<0.05)。提示IL-22可以抑制HSC細胞活性，進而抑制α-SMA的表達及Wnt/β-catenin信號通路的激活，并且對于TGF-β1激活后的HSC，IL-22同樣具有抑制細胞活性作用，見圖5。

3 討論

肝臟自身是一個巨大的免疫器官，肝組織內有多種免疫細胞，這些免疫細胞及其分泌的細胞因子參與機體的多種生理、病理過程，且免疫因素在肝纖維化發生發展過程中發揮多種調節作用。IL-22是IL-10家族的成員，多種免疫細胞可以分泌IL-22。IL-22在促進抗微生物免疫及組織修復過程中扮演重要角色，通過與細胞表面受體IL-10R2和IL-22R1結合，進而激活胞漿內的多條信號通路來發揮生物學效應[6]。既往有研究表明，IL-22可以通過激活STAT3信號通路抑制HSC活性，降低HSC分泌細胞外基質，進而改善肝臟纖維化狀態，促進肝纖維的好轉[7]。

Wnt/β-catenin通路屬于新興研究的細胞通路，近年來的研究也表明該通路亦參與到組織器官纖維化過程中，但其參與組織器官纖維化的機制并沒有被明確[8]。目前國內外均有研究證實Wnt/β-catenin通路與HSC的活化、肝纖維化的形成存在著一定關系。有學者使用帶有商陸抗病毒蛋白的質粒，通過尾靜脈注射對CCl4誘導的肝纖維化大鼠進行基因轉染，觀察到商陸抗病毒蛋白可以通過下調β-catenin表達來減輕肝纖維化的發生[9]。最近，研究發現miR-17-5p可以經誘導激活Wnt/β-catenin通路促進HSC激活，促進膠原纖維和α-SMA的合成與分泌，進而促進肝纖維化的發展[10]。

TGF-β1是較強的HSC激活因子[11]，本研究中，我們使用TGF-β1刺激HSC，發現HSC激活過程中，β-catenin、α-SMA的mRNA和蛋白表達均隨著TGF-β1刺激增大而升高，表明HSC激活可以激活Wnt/β-catenin通路，并分泌大量的致纖維化因子。因此，通過抑制相關通路的激活可以抑制HSC活性，進而減少肝纖維化的進展。我們還發現，IL-22可以以濃度依賴性和時間依賴性抑制HSC增殖，并降低HSC表達α-SMA的水平；此外，IL-22還可以拮抗TGF-β1誘導HSC的激活，降低其活性，提示IL-22是一個較強的抗纖維化因子，深入研究其作用機制可為抗肝纖維化的研究提供新的思路。

在IL-22抑制HSC的作用機制方面，本研究發現IL-22可以降低β-catenin的mRNA和蛋白表達水平，并且抑制TGF-β1誘導HSC中β-catenin的表達，提示IL-22可能經抑制Wnt/β-catenin通路來發揮抗纖維化作用。然而，本研究發現IL-22僅抑制HSC增殖，對其凋亡沒有顯著影響，我們推測這可能與Wnt/β-catenin通路的作用有關。有研究表明，細胞漿內的β-catenin被IL-22抑制后，β-catenin與轉錄因子T細胞因子/淋巴增強因子(T cell factor/Lymphoid enhancer-binging factor,TCF/LEF)結合下降，而TCF/LEF可以調控細胞的增殖過程，對細胞的凋亡并無顯著影響[12]。

總之，本研究表明，Wnt/β-catenin參與了HSC激活和分泌α-SMA過程，而IL-22可以以濃度依賴性和時間依賴性抑制HSC活性，這種抑制作用是通過抑制Wnt/β-catenin通路實現的。本研究結果深化了IL-22抗肝纖維化作用的認識，為今后研發新的抗肝纖維化藥物提供了重要的實驗基礎。

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[收稿2016-08-30 修回2016-11-08]

(編輯 倪 鵬)

IL-22 inhibits liver fibrosis induced by hepatic stellate cells via Wnt/β-catenin signal pathway

SHICheng,LEIRong-E,HUBang-Li,ZHANGPei-Ling,QINShan-Yu,JIANGHai-Xing.

DepartmentofGastroenterology,theFirstAffiliatedHospitalofGuangxiMedicalUniversity,Nanning530021,China

Objective:To investigate the effects and mechanisms of interleukin-22(IL-22) on inhibiting liver fibrosis induced by HSC,and explore the role of Wnt/β-catenin pathway in the activation of hepatic stellate cells(HSC).Methods：Rat HSC was activated by TGF-β1,and the mRNA and protein levels of β-catenin and α-SMA were detected by q-PCR and Western blot,respectively.HSC was treated with different hours and concentration of recombinant rat protein IL-22.The cell proliferation rates were detected by CCK8,cell apoptosis rates were tested by flow cytometry.HSC were treated with optimal concentration of IL-22 after activated by TGF-β1,the cell proliferation rates,mRNA and protein levels of β-catenin and α-SMA were compared of before and after intervention.Results：The mRNA and the protein levels of β-catenin and α-SMA were significantly increased after activated by TGF-β1(P<0.05).IL-22 inhibiting the proliferation of HSC in a dose-and time-dependent manner (P<0.05) and decreased the mRNA and the protein expression level of β-catenin and α-SMA(P<0.05),but had no significant effect on apoptosis rates(P>0.05).IL-22 significantly inhibited the activation of HSC induced by TGF-β1 and remarkably decreased the mRNA and the protein expression level of β-catenin and α-SMA(P<0.05).Conclusion：The Wnt/β-catenin pathway may participates in the process of HSC activation and α-SMA secretion,and IL-22 inhibits biological function of HSC in a dose- and time-dependent manner.This effect probably via inhibited the Wnt/β-catenin signal pathway.

Hepatic stellate cells;Interleukin-22;Wnt/β-catenin signal pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.005

①本文受國家自然基金(81260083)和廣西研究生教育創新計劃項目(YCBZ2015025)資助。

石 城(1990年-)，男，碩士，主要從事肝纖維化免疫方面的研究。

及指導教師：姜海行(1963年-)，男，博士，教授，博士生導師，主要從事肝病臨床與基礎方面的研究， E-mail：gxjianghx@163.com。

R575.2

A

1000-484X(2017)04-0502-05