抑制TGF-β1對慢性環孢素腎病小鼠Smad2/3及ILK信號分子的影響①

曾強林 白志勛 王 丹 楊亦彬

(遵義醫學院附屬醫院腎病風濕科,遵義563003)

抑制TGF-β1對慢性環孢素腎病小鼠Smad2/3及ILK信號分子的影響①

曾強林 白志勛 王 丹 楊亦彬

(遵義醫學院附屬醫院腎病風濕科,遵義563003)

目的：特異性抑制TGF-β，觀察Smad2/3、ILK信號蛋白變化，評估TGF-β1/Smad/ILK信號通路在環孢素腎病 (CCN) 模型小鼠小管間質纖維化中的作用。方法：BALB/c小鼠隨機分成：環孢素模型組 (CMG)、干預模型組(IMG)、溶媒對照組(SCG)、低鹽對照組 (LCG)和正常對照組 (NCG)。CMG與IMG組采用低鹽飼養并環孢素60 mg/(kg·d)灌胃，從第28天腹腔給予TGF-β1特異抑制劑SB-431542 10 mg/(kg·2 d)，第38天后采樣，比較各組血清肌酐(Scr)；觀察腎組織羥脯氨酸(Hyp)含量及其病理變化，免疫組化或Western blot觀察TGF-β1、P-Smad2/3、ILK表達，RT-PCR檢測TGF-β1、Smad2/3及ILK mRNA表達。結果：CMG和IMG小鼠SCr顯著升高 (P<0.01)，腎小管結構不同程度損傷，間質炎性細胞增多，藍色膠原染色不同程度增多，腎組織Hyp含量明顯增多(P<0.01)，其中IMG上述指標較CMG明顯改善。CMG和IMG小鼠腎小管間質TGF-β1、P-Smad2/3及ILK基因和蛋白表達明顯增強 (P<0.01)，而IMG上述因子表達明顯低于CMG (P<0.05)。腎臟Hyp含量與Scr、TGF-β1、P-Smad 2/3、ILK水平呈正相關(r=0.860、 0.711、0.776、0.676,均P<0.01)。 結論：TGF-β1/Smads信號通路是CCN模型小鼠腎間質纖維化重要機制之一；ILK參與CCN小管間質纖維化，且可能系TGF-β1/Smads信號通路下游因子參與CCN小管間質纖維化進程。

環孢素腎病;環孢素A;小管間質纖維化;轉化生長因子-β1/Smads；整合素連接激酶

環孢素A(Cyclosporine-A，CsA)是目前廣泛應用于器官移植的免疫抑制劑，但其慢性毒副作用導致的慢性環孢素腎病(Chronic cyclosporine nephro-pathy,CCN)嚴重影響到移植患者和移植物的長期存活[1,2]。CCN發病機制十分復雜，其突出的病理改變為小管間質纖維化(Tubule interstitial fibrosis,TIF)。業已證明TIF是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎臟病的共同途徑，并涉及多種信號傳導通路激活，其中轉化生長因子β1 (Transforming growth factor-β1,TGF-β1)/Smads是公認的組織纖維化重要信號通路之一[3,4]，而近年來發現整合素連接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)可能作為TGF-β1/Smads信號通路下游因子參與纖維化進展[5]。基于前期發現CNN腎臟存在TGF-β1、Smads基因異常表達，并與腎小管間質纖維化程度相關[6]，本研究旨在通過阻斷性實驗以進一步觀察TGF-β1/Smads/ILK在CCN小管間質纖維進程中作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要實驗材料 清潔級雄性BALB/c小鼠50只，6～8周齡，體重約16～18 g(北京華阜康生物科技有限公司)；環孢素口服溶液(中美華東制藥)；SB-431542(Sigma)；羥脯氨酸試劑盒(南京建成)；免抗小鼠TGF-β1、p-Smad2/3、ILK一抗、熒光標記二抗、兔二步法檢測試劑盒(PV-6001)；SP試劑盒(中杉金橋)；RNA逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex TaqTM試劑盒(大連寶生物)。

1.1.2 模型建立及分組 小鼠適應性喂養1周后，隨機分為5組：環孢素模型組[CsA model group,CMG，CsA 60 mg/(kg·d)灌胃]、干預模型組 (Interventional model group，IMG)、溶媒對照組(Solvent control group,SCG)、低鹽對照組(Low salt control group,LCG)和正常對照組(Normal control group,NCG)，10只/組。CsA以橄欖油為溶媒稀釋，按60 mg/(kg·d) 灌胃，干預組于第28天腹腔注射TGF-β特異抑制劑SB-431542 10 mg/(kg·2 d)，共10 d。正常對照組予以標準飼料喂養，其余各組均予以 0.042%低鹽飼料飼養(廣東省醫學實驗動物中心加工)。第38天麻醉后摘眼球取血，分離血清，-20℃保存備用，生理鹽水自腹主動脈灌注后摘除雙側腎臟，置福爾馬林溶液和液氮保存備用。

1.2 方法

1.2.1 腎組織羥脯氨酸測定 堿水解法，嚴格按試劑盒說明操作。

1.2.2 免疫組織化學 取福爾馬林固定腎組織，石蠟包埋，3 μm切片，逐步脫蠟至水，雙氧水除內源性過氧化物酶，PBS沖洗，抗原熱修復后，加入TGF-β1(1∶200)、p-Smad2/3(1∶200)、ILK(1∶100)一抗，4℃孵育過夜。復溫并PBS沖洗后加入相應二抗，DAB顯色，蘇木素復染，封片。采用PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片隨機取5個視野，采用IP-Win32分析染色結果，Image-proplus 6.0讀取積分光密度值(IOD值)進行半定量分析。

1.2.3 Western blot檢測ILK 冰上剪碎腎組織，加入RIPA和PMSF混合液裂解后提取總蛋白，BCA法蛋白定量后，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉運至PVDF膜上，脫脂牛奶封閉1 h，分別加入ILK(1∶500)一抗、熒光標記二抗(1∶10 000)并孵育、洗滌，ECL顯影，Odyssey 近紅外雙色激光成像系統掃描分析，以β-actin作為內參。

1.2.4 RT-PCR 腎組織勻漿后用Trizol試劑盒提取RNA，Nano-Drop 1000測定RNA的純度及濃度。嚴格按試劑盒說明書逆轉錄合成cDNA，PCR擴增目的基因片段，引物由大連寶生物公司設計合成(見表1)。以Ct值為統計參數，按2-ΔΔCt法計算TGF-β1、Smad 2/3和ILK mRNA的相對表達量。

表1 RT-PCR引物序列對

Tab.1 Primer sequences of RT-PCR

2 結果

2.1 小鼠一般情況變化 給CsA 1周后，墊料潮濕逐漸加重，并出現異常酸臭氣味，動物毛色暗淡無光，體型瘦弱，直到實驗終點無小鼠死亡。

2.2 血肌酐水平 兩個CsA模型組 (CMG、IMG) 血肌酐水平明顯升高(P<0.01)，但IMG低于CMG(P<0.01)，見表2。

2.3 病理組織學變化 Masson染色顯示CMG及IMG小鼠腎組織都有不同程度的間質纖維化，部分小管腔縮小、閉塞，其中IMG纖維化程度相對較輕，見圖1。

2.4 腎組織Hyp含量檢測 兩模型組(CMG、IMG)小鼠Hyp含量較三個對照組(SCG、LCG、NCG)顯著增高(P<0.01)，IMG腎臟Hyp含量低于

GroupsScr(μmol/L)CMG 78 000±13 6142)IMG 38 500±4 2431)3)SCG27 200±6 099LCG18 571±8 223NCG20 444±6 386

Note：Compared with three control group,1)P<0.05, 2)P<0.01;compared with CMG, 3)P<0.05.

CMG(P<0.01),見表3。

2.5 各組大鼠腎組織免疫組化結果 CMG及IMG腎組織TGF-β1、P-Smad2/3及ILK表達明顯增多(P<0.01)，突出表現在小管間質，但IMG上述三個指標表達均明顯低于CMG(P<0.01)，見表4、圖 2～4。

GroupsHypcontent(μg/mg)CMG0 395±0 0261)IMG0 280±0 0501)2)SCG0 158±0 025LCG0 162±0 034NCG0 177±0 048

Note：Compared with three control group,1)P<0.01;compared with CMG,2)P<0.01.

GroupsTargetproteinsTGF?β1P?Smad2/3ILKCMG40 593±1 7601)28 339±1 3861)31 687±2 3051)IMG30 366±1 5771)2)18 752±0 3221)2)18 384±1 3331)2)SCG9 278±9 1008 551±0 90210 537±0 263LCG9 100±1 1518 284±0 42210 377±0 784NCG9 321±0 5198 770±0 65310 582±1 221

Note：Compared with three control group,1)P<0.01;compared with CMG,2)P<0.01.

圖1 小鼠腎組織Masson染色結果(× 400)Fig.1 Representative renal tissue section stained by Masson(×400)

圖2 各組小鼠腎組織TGF-β1 免疫組化圖(×400)Fig.2 Representative TGF-β1 immunostaining in renal tissue of rats(×400)

圖3 各組小鼠腎組織P-Smad 2/3 免疫組化圖(×400)Fig.3 Representative P-Smad2/3 immunostaining in renal tissue of rats(×400)

圖4 各組小鼠腎組織ILK免疫組化圖(×400)Fig.4 Representative ILK immunostaining in renal tissue of rats(×400)

圖5 各組小鼠腎組織ILK蛋白表達Fig.5 Expression of ILK protein in renal tissue of ratsNote：Compared with three control group,△.P<0.01;compared with CMG,*.P<0.01.

2.6 ILK蛋白印跡結果 CMG及IMG小鼠腎組織 ILK表達水平明顯升高(P<0.01)，但IMG表達水平明顯低于CMG(P<0.01)，見圖5。

2.7 腎組織TGF-β1、Smad2/3及 ILK mRNA表達(RT-PCR) CMG以及IMG腎組織TGF-β1、Smad2/3及 ILK mRNA表達明顯上調(P<0.01)，但IMG 上述3個指標表達明顯低于CMG(P<0.05)，見表5。

2.8 指標相關性分析 腎臟Hyp含量與Scr、TGF-β1、P-Smad2/3、ILK水平呈正相關(r=0.860、 0.711、0.776、0.676,均P<0.01)。

3 討論

CsA是神經鈣調蛋白抑制劑，作為抗排斥反應藥物極大促進器官移植領域發展，但卻存在嚴重腎

GroupsTargetgenesTGF?β1Smad2/3ILKCMG17 220±3 2921)9 184±1 9251)10 090±1 4971)IMG5 603±1 5061)3)5 503±1 4941)3)7 017±1 3961)2)SCG1 699±1 3491 609±1 0291 333±0 539LCG1 320±1 5631 251±1 3051 609±0 297NCG1 352±1 0551 099±0 5561 095±0 447

Note：Compared with three control group,1)P<0.01;compared with CMG,2)P<0.05,3)P<0.01.

毒性作用，其急性腎毒性損害多可通過換藥或減量得以改善，而慢性腎毒性導致移植腎CCN受醫學界關注[7,8]。CCN最主要的病理表現是慢性腎纖維化，其發病機制主要涉及腎素血管緊張素系統 (RAS)激活、腎小管上皮細胞-間葉細胞轉分化、氧化應激、纖維化細胞因子表達上調、炎癥反應以及腎臟慢性缺血缺氧等[9,10]。

小管間質纖維化是各種慢性腎臟疾病進展至終末期腎衰竭共同途徑，有效防治和延緩小管間質纖維化已成為研究熱點[11]，其過程涉及多種細胞信號傳導通路的參與，其中TGF-β/Smads被認為在慢性腎纖維化進程中具有重要作用[3,4]。Smads是TGF-β受體作用的最直接底物，可分為通路限制性R-Smad(Smad1/2/3/5/8/9)、共同通路性C-Smads(Smad4)、抑制性I-Smads(Smad6/7)。TGF-β與其受體結合并磷酸化Smad2和Smad3化，發揮促纖維化作用，而Smad7通過競爭性結合TGF-β1受體實現對Smad2/3磷酸化進程的抑制而發揮負性調節[12]。有學者發現CCN大鼠腎臟存在TGF-β1、Smad2/3表達上調，其異常表達與腎小管間質纖維化程度相關，而槲皮素、瑞舒伐他汀、抗氧化劑等可改善相關因子表達及纖維化程度[6，13,14]。為進一步證實TGF-β1/Smad2/3通路在CsA致小管間質纖維化中的作用，本實驗通過BALB/c小鼠灌胃CsA建模，給予TGF-β1特異性抑制劑(SB-431542)，觀察到模型小鼠腎小管間質纖維化、腎功異常的同時，TGF-β1、Smad2/3 mRNA和蛋白表達明顯上調，經TGF-β1特異性抑制劑干預處理后，腎組織TGF-β1、Smad2/3基因和蛋白表達水平較CsA模型組明顯下調，血肌酐下降，腎羥脯氨酸含量及小管間質纖維化程度減輕，說明TGF-β1/Smads信號通路激活參與了CsA致慢性小管間質纖維化進程。

ILK是一種生物學活性多樣化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，通過多種信號通路介導細胞骨架相關蛋白與整合素的連接、調節細胞表型、細胞外基質積聚等生物學過程。近年來研究顯示上皮細胞向間充質細胞轉分化(Epithelial-mesenchymal transiton,EMT)是腎臟纖維化重要機制之一，而ILK在腎臟纖維化進程中具有重要作用[15],且ILK可能作為TGF-β1/Smads信號通路下游因子參與纖維化進程[5]。有學者發現腎臟間質炎癥和纖維化區域，其調控小管上皮細胞轉分化的相關因子如TGF-β1、p-Smad2/3、ILK、β1-integrin、P38MAPK、Wnt5b、β-catenin等高表達，并認為TGF-β1/Smad、ILK、Wnt/β-catenin是腎臟纖維化重要信號通路[15,16]，但在CCN中尚未見相關報道。本實驗發現CCN模型小鼠腎臟ILK基因和蛋白表達明顯上調，且與TGF-β1、Smad2/3、羥脯氨酸等中正相關，說明ILK激活參與CCN小管間質纖維化進程；給予TGF-β1特異性抑制劑后，其小鼠ILK基因和蛋白表達下調、血肌酐及腎組織羥脯氨酸含量下降，提示ILK可能作為TGF-β1/Smad2/3下游因子參與小管間質纖維化進程。有研究顯示TGF-β1可誘導腎小管上皮細胞細胞上調ILK、α-SMA、pSmad2/3表達，下調E-cadh-erin 和Smad7表達，從而促進細胞EMT[5]；而抑制ILK可明顯改善TGF-β1誘導腎小管上皮細胞、足突細胞轉分化，亦可降低輸尿管梗阻、阿霉素腎病模型腎臟纖維化程度[17,18]，這些結果提示ILK系TGF-β1/Smads信號通路下游分子，抑制或阻斷ILK的表達和功能，對防治CCN具有積極意義。

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[收稿2016-06-12]

(編輯 張曉舟)

Effect of inhibiting TGF-β1 on Smad2/3 and ILK signaling molecules in chronic cyclosporine A nephropathy in mouse

ZENGQiang-Lin,BAIZhi-Xun,WANGDan,YANGYi-Bin.

DepartmentofNephrology&Rheumatology,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563003,China

Objective:To investigate the effect of specific inhibition of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) with SB-431542 on the Smad2/3 and integrin-linked kinase (ILK) signaling molecules in tubule interstitial fibrosis(TIF)-induced cyclosporine A(CsA) in mouse.Methods：50 BALB/c mice were randomly divided into 5 groups (10 mice per group):the CsA model group (CMG),the interventional model group (IMG),the solvent control group (SCG),the low-salt control group (LCG),and the normal control group (NCG).The model mouse was established with low-sodium diet and intragastric administration of cyclosporine A,which was dissolved in olive oil at a dose of 60 mg/(kg·d).After 4 weeks,a specific inhibitor of TGF-β1 (SB-431542 )was administered intraperitoneally with 10 mg/(kg·2 d) for 10 days (every other days).Mice were sacrificed at day 38.Serum creatinine (Scr) was measured,hydroxyp roline (Hyp)level and morphological changes of renal tissue were analyzed,expression levels of TGF-β1,P-Smad 2/3 and ILK were respectively detected by immunohistochemistry or Western blot,mRNA levels of TGF-β1,Smad 2/3 and ILK were respectively detected real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).Results：Compared with three control groups (NCG,LCG and SCG),mice weight was decreased significantly,Scr level was increased significantly in two modeling groups (CMG and IMG) (P<0.01),and these changes in CMG were more obvious than those of IMG (P<0.05).Different levels of tubulointerstitial injury,interstitial infiltration of inflammatory cells and blue collagen staining in two modeling groups were observed,and particularly evident in CMG.TGF-β1,P-Smad2/3 and ILK immunostaining were mainly expressed in tubulointerstitium.The TGF-β1,P-Smad2/3 and ILK mRNA and immunostaining levels in two modeling groups were significantly increased as compared with three control groups (P<0.01),but their levels in IMG were significantly lower than those of CMG (P<0.05).The level of Hyp in renal tissue was positively correlated with Scr,TGF-β1,Smad2/3 and ILK (r=0.860,0.711,0.776,0.676,P<0.01).Conclusion：The activation of the TGF-β1/Smads signaling pathway plays an important role in the development of chronic CsA-induced TIF.The activation of ILK is closely correlated with the development of TIF,and may be used as a downstream factor of TGF-β1/Smads signaling pathway in regulating CsA-induced TIF.

Chronic cyclosporine nephropathy;Cyclosporine-A;Tubuleinterstitial fibrosis;TGF-β1/Smads;Integrin-linked kinase

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.007

①本文為貴州省教育廳自然科學基金項目(黔教科2010044)和遵義市科技計劃項目[遵市科合社字(2012)42號]。

曾強林(1985年-)，男，碩士，住院醫師，主要從事免疫抑制劑腎損害和慢性腎纖維化方面的研究。

及指導教師：楊亦彬(1962年-)，男，博士，教授，主要從事慢性腎臟病、免疫抑制劑腎損害方面的研究，E-mail：yyb1011@sina.com。

R979.5 R692

A

1000-484X(2017)04-0511-05