PSMA7對A549細胞中RB途徑的影響①

黃 湘 鐘裕恒 譚家余 吳學威 梁 睿 梁少霞 趙 婧

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院產前診斷中心,中山528403)

PSMA7對A549細胞中RB途徑的影響①

黃 湘 鐘裕恒 譚家余②③吳學威 梁 睿 梁少霞 趙 婧

(南方醫科大學附屬中山博愛醫院產前診斷中心,中山528403)

目的：探究高表達和干擾PSMA7對A549細胞周期以及RB途徑中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響。方法：將pcDNA3.1-PSMA7高表達和pGPU6/Hygro-PSMA7-265干擾載體分別瞬時轉染A549細胞，然后用流式細胞儀檢測PSMA7對細胞周期的影響，再通過Western blot 實驗檢測Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平。結果：和對照組相比，PSMA7高表達時周期時相分布無明顯差異，但Cyclin D1、CDK4的蛋白表達水平明顯降低，P16、Rb的表達明顯增高；和對照組相比，干擾PSMA7后細胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的值增高，均具有差異，而Cyclin D1、CDK4的蛋白表達水平明顯增加，P16、Rb的表達明顯降低，以上結果與對照組相比差異均有統計學意義。結論：PSMA7在A549肺腺癌細胞中能夠影響RB途徑中Cyclin D1、CDK4、P16、Rb的蛋白水平的表達，干擾PSMA7使A549細胞較早進入S期。

HSPC238;RB途徑;細胞周期;免疫印跡

PSMA7基因編碼人類蛋白酶體α7亞基(Proteasome subunit，alpha type 7，PSMA7)，該蛋白是20S蛋白酶體核心復合體的一個α亞基，它參與HBV、HCV和HIV病毒的復制及多種蛋白質的降解[1-3]，并與HIF-1、c-Abl及Arg等多種腫瘤相關的重要蛋白質相互作用[4，5]，但與腫瘤的相關性仍知之甚少。我們的前期研究顯示PSMA7可抑制A549細胞的增殖能力和成瘤性[6]，但具體機制不清楚。RB途徑主要包括Cyclin D1、CDK4、P16、Rb等蛋白，與細胞的增殖存在密切關系。PSMA7抑制腫瘤的作用是否通過RB途徑起作用，還不得而知。本研究通過過表達和敲除A549細胞中的PSMA7，觀察其對A549細胞周期以及對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響，探討PSMA7抑制A549細胞增殖和成瘤性的機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 肺腺癌細胞株A549由本實驗室保存；Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司；RPMI1640粉及新生牛血清均購自Gibco BRL公司；pcDNA3.1和pcDNA3.1-PSMA7由本實驗室保存和構建；pGPU6/Hygro-PSMA7-265和pGPU6/Hygro-SHNC質粒購于GenePharma公司；PSMA7、Cyclin D1、CDK4、P16和Rb抗體和相應二抗購自武漢三鷹生物技術有限公司；碘化丙啶(PI)購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 A549細胞在含10%新生牛血清的1640培養基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的孵箱中培養。

1.2.2 質粒轉染 將處于對數生長期的A549細胞重懸于完全培養基中，以3×105細胞/孔接種于6孔板中，培養24 h，使細胞達到80%～90%融合。按照LipofectamineTM2000說明書，將上述質粒通過脂質體法導入A549細胞系中。

1.2.3 Western blot實驗 0.25%胰酶分別消化轉染質粒細胞并提取其總蛋白，用分光光度計進行蛋白定量，以GAPDH為內參。分別取50 μg細胞總蛋白電泳，然后將電泳后的蛋白轉印至PVDF膜上，加相應一抗(1∶500)反應1.5 h,最后加入用辣根過氧化物酶標記的二抗，發光顯色。實驗重復3次。

1.2.4 將轉染了PSMA7高表達質粒、干擾質粒和對照質粒的細胞按4×105個/孔細胞數接種于6孔板，在合適條件下的孵箱中培養至80%以上的細胞融合度，加入1640培養基繼續培養24 h。用0.25%胰酶消化細胞后收集12 000個上機，DNA周期分析用美國PHEONIX公司的MULTYCYCLE軟件，最后計算出細胞各期的百分數。

2 結果

2.1 PSMA7的表達 如圖1和表1，與A549/pcDNA3.1細胞(0.732±0.058)相比，A549/pcDN-A3.1-PSMA7細胞(1.690±0.101)中的PSMA7表達量明顯增加(P<0.05)。如圖1和表2，與轉染shNC細胞(0.765±0.077)相比，轉染shPSMA7細胞(0.287±0.058)的PSMA7表達量明顯減少(P<0.05)。

2.2 PSMA7對RB途徑的影響 如圖2、3，瞬時轉染A549細胞后采用Western blot法分別檢測Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白的表達水平，結果發現：PSMA7高表達時使Cyclin D1、CDK4的表達明顯降低，P16和Rb的表達明顯增高；PSMA7干擾時使Cyclin D1和CDK4的表達明顯增加，P16和Rb的表達明顯降低。

2.3 PSMA7對A549細胞生長周期的影響 使用流式細胞儀檢測發現，與A549/pcDNA3.1(-)組對比，A549/pcDNA3.1(-)/PSMA7組的細胞周期時相分布差異無統計學意義(P均>0.05)，見圖4、表3。和shNC細胞組對比，shPSMA7細胞組的G0/G1、G2/M期細胞比例都降低，而S期的比例較高，差異具有統計學意義(P<0.05)。 表明干擾PSMA7后，A549細胞提早進入S期(圖5，表4)。

圖1 Western blot法檢測敲低或者過表達PSMA7后的蛋白表達量Fig.1 Detection of protein level of downregulated or upregulated PSMA7 by Western blotNote：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

GroupsnDensityratiotPA549/pcDNA3 1(-)30 732±0 058-14 2820 000A549/pcDNA3 1(-)/PSMA731 690±0 101

GroupsnDensityratiotPshNC30 765±0 0778 5990 001shPSMA730 287±0 058

圖2 PSMA7對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響(Western blot法)Fig.2 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb(Western blot)Note：1.shNC；2.shPSMA7；3.A549/pcDNA3.1；4.A549/pcDNA3.1-PSMA7.

圖3 PSMA7對Cyclin D1、CDK4、P16、Rb蛋白水平的影響Fig.3 Effect of PSMA7 on protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb

圖4 PSMA7高表達組A549細胞周期的流式圖Fig.4 Results of cell cycles after PSMA7 overexpress by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSA549/pcDNA3 1(-)351 73±1 428 20±0 2640 06±1 16A549/pcDNA3 1(-)/PSMA7353 63±3 977 73±0 2538 63±3 84t-0 7802 2140 619P0 4790 0910 569

3 討論

PSMA7是20S蛋白酶體核心復合體的一個α亞基，參與組成泛素-蛋白酶體系統，目前，蛋白酶體抑制劑已經成為抗腫瘤藥物研發的新熱點，如環氧酮類藥物卡非佐米、硼酸類藥物硼替佐米和正在臨床研究階段的β-內酯類藥物Marizomib[7-9]。研究20S蛋白酶體核心復合體的結構和功能，對于進一步開發蛋白酶體抑制劑，促進腫瘤疾病的防治具有重要意義。

我們前期研究發現，在肺腺癌中,癌組織胞漿中PSMA7蛋白的表達明顯高于癌旁組織胞漿的表達[10]。通過體外實驗發現PSMA7具有抑制A549肺腺癌細胞增殖和侵襲能力的作用，同時通過裸鼠成瘤實驗發現其在體內具有抑制肺腺癌形成的作用[6]。另外，我們發現高表達PSMA7可引起A549細胞表面黏附分子ICAM-1和VCAM-1 表達量減少，反之，干擾PSMA7可引起ICAM-1和VCAM-1 表達量增加，提示其可能通過此途徑參與肺腺癌細胞的侵襲和轉移[11]，但PSMA7在腫瘤組織中發揮作用的具體機制還不清楚。

圖5 干擾組A549細胞的細胞周期流式圖Fig.5 Results of cell cycles after PSMA7 knocked out by flow cytometer

GroupsnG0/G1G2/MSshNC461 53±2 407 40±0 5831 10±2 08shPSMA7456 33±2 005 80±0 6737 93±1 47t-3 335-3 6085 353P0 0160 0110 002

本研究通過探討PSMA7與RB途徑的關系，發現干擾PSMA7使Cyclin D1和CDK4的表達明顯增加，P16和Rb的表達明顯降低；反之，PSMA7高表達時使Cyclin D1和CDK4的表達明顯降低，P16和Rb的表達明顯增高。提示PSMA7可能通過影響RB通路從而參與細胞周期G1/S期轉換的過程。既往研究表明，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之間通過復雜的反饋調節環路[12]，調控著細胞G1/S期轉換。Cyclin D1的激活是細胞周期調控系統的始動環節，CDK4的活性受Cyclin D1的正向調控，而p16可以通過與Cyclin D1競爭CDK4參與其負向調控。最終CDK4通過影響Rb蛋白磷酸化狀態調控E2F的轉錄活性，從而調控著細胞G1/S期轉換。

由于Cyclin D1是通過泛素-蛋白酶體途徑降解的[13]，PSMA7是20S蛋白酶體核心復合體的一個重要的α亞基，而我們的研究發現和對照組相比，PSMA7高表達時周期時相分布無明顯差異，但Cyclin D1和CDK4的蛋白表達水平明顯降低，P16和Rb的表達明顯增高；與對照組相比，干擾PSMA7后細胞的G0/G1、G2/M期比例均降低，而S期的比例高，均具有差異，而Cyclin D1和CDK4的蛋白表達水平明顯增加，P16和Rb的表達明顯降低。PSMA7高表達時周期時相分布無明顯差異可能是由于啟動了負反饋機制造成的。由以上結果我們猜測，PSMA7很可能通過影響Cyclin D1的降解從而參與調控RB途徑從而影響細胞周期。另外，有報道發現PSMA7可以與HIF-1α結合并抑制其轉錄[14]，而在A549細胞中，HIF-1α可以調節Cyclin D1[15]，故我們推測PSMA7也可能通過調節HIF-1α從而影響Cyclin D1，進而影響RB途徑中的其他周期蛋白的水平。不過，Cyclin D1、CDK4、p16、pRb、E2F之間有著復雜的反饋調節環路，PSMA7影響RB途徑的具體機制還有待探索。我們目前正進一步實驗以驗證這些猜想。

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[收稿2016-03-31 修回2016-07-14]

(編輯 張曉舟)

Effect of PSMA7 on RB pathway in A549 cells

HUANGXiang,ZHONGYu-Heng,TANJia-Yu,XUXue-Wei,LIANGRui,LIANGShao-Xia,ZHAOJing.

PrenatalDiagnosisCenter，BoaiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Zhongshan528403,China

Objective:To investigate the effect of upregulated and downregulated PSMA7 on the cell cycle and Cyclin D1，CDK4，P16，Rb of RB pathway in A549 cells.Methods：Transfected upregulated pcDNA3.1-PSMA7 vecter and downregulated pGPU6/Hygro-PSMA7-265 vecter into A549 cells,and then tested the effect of PSMA7 on the cell cycle of A549 cells by flow cytometry,and detected the protein level of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb by Western blot.Results：Compared with the control group,the cell cycle of the A549 cells did not change significantly,and the expression of Cyclin D1，CDK4 decreased but P16，Rb increased when PSMA7 was upregulated.Compared with the control group,the proportion of phase G0/G1,G2/M of the A549 cells decreased and phase S increased,and the expression of Cyclin D1，CDK4 increased but P16，Rb decreased when PSMA7 was downregulated.There was statistical significance for those results.Conclusion：PSMA7 could affect the expression of Cyclin D1，CDK4，P16，Rb protein level of RB pathway in A549 and promoted the A549 cells into phase S when it′s downregulated.

HSPC238;RB pathway;Cell cycle;Western blot

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.008

①本文受廣東省醫學科研基金項目(A2013875)和國家自然科學基金 (81101534) 資助。

黃 湘(1971年-)，女，博士，主任技師，碩士生導師，主要從事腫瘤免疫及產前診斷研究，E-mail:340382761@qq.com。

R34

A

1000-484X(2017)04-0516-04

②南方醫科大學附屬中山博愛醫院中心ICU,中山528403。

③通訊作者,E-mail:28242174@qq.com。