基于PI3K/AKT/mTOR通路、HIF-1α、ES觀察新風膠囊對佐劑關節炎大鼠滑膜血管新生的影響①

張曉軍 劉 健 萬 磊 黃傳兵

(安徽中醫藥大學,合肥230038)

·中醫中藥與免疫·

基于PI3K/AKT/mTOR通路、HIF-1α、ES觀察新風膠囊對佐劑關節炎大鼠滑膜血管新生的影響①

張曉軍 劉 健②萬 磊②黃傳兵②

(安徽中醫藥大學,合肥230038)

目的：觀察新風膠囊(XFC)對佐劑關節炎(AA)大鼠滑膜PI3K/AKT/mTOR通路的影響。方法：將大鼠隨機分成正常對照組、模型對照組、甲氨蝶呤組、雷公藤多苷組、XFC組。采用免疫組化法檢測滑膜微血管密度(MVD)表達，酶聯免疫吸附法檢測白介素(IL)-6、IL-10、HIF-1α、VEGF-A表達，免疫印跡法檢測PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR、ES蛋白在滑膜血管中表達。結果：模型對照組滑膜組織MVD計數升高，血清IL-6、VEGF、HIF-1α和滑膜PI3K、AKT1、p-AKT1、mTOR、ES表達顯著升高，血清IL-10表達量降低；治療后，XFC組MVD呈高計數量，HIF-1α、 IL-6、VEGF-A表達降低，滑膜PI3K、p-AKT1、mTOR、ES蛋白表達降低，血清IL-10升高。結論：XFC通過調節PI3K/AKT/mTOR信號通路、HIF-1α、ES表達改善AA滑膜血管新生。

佐劑關節炎；血管新生；PI3K/AKT/mTOR通路；新風膠囊

類風濕關節炎(Rheurnatoid arthritis，RA)基本病理變化是滑膜炎[1]。RA長期慢性炎癥和病理變化逐漸導致關節腔出現低氧環境，導致滑膜血管新生形成，從而加重滑膜炎癥的發生。研究發現，磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)通路在RA滑膜血管新生中起重要作用[2]。PI3K/AKT通路可以激活哺乳動物雷帕霉素靶向蛋白(mTOR)表達，而 mTOR可進一步增加缺氧誘導因子1-α(HIF-1α)升高，導致血管內皮生長因子(VEGF-Α)、微血管密度(MVD)及ES表達增強，VEGT-A，ES可以對內皮細胞的直接作用，并增加在滑膜新生血管形成[3-5]。某些細胞因子如白細胞介素1(IL-)-6可上調VEGF的表達；而IL-10等則能抑制VEGF的表達。既往研究發現，中藥新風膠囊能明顯降低RA患者關節腫痛等癥狀，還能改善滑膜血管新生的表達[6-8]。為進一步觀察新風膠囊的作用機制，筆者通過弗氏完全佐劑(FCA)復制AA大鼠模型，通過新風膠囊對AA大鼠滑膜新生血管的療效觀察，并研究對滑膜血管PI3K/AKT/mTOR通路、IL-6、IL-10、HIF-1α、VEGF-Α、ES的影響，分析PI3K/AKT/mTOR信號通路、HIF-1α、VEGF-Α、ES、IL-6、IL-10與滑膜血管新生的關系，探討新風膠囊改善滑膜血管新生的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 50只SD大鼠，由安徽省實驗動物中心提供。實驗動物經安徽中醫學院第一附屬醫院和基礎研究倫理委員會批準審核通過，清潔級標準飼養。

1.1.2 試劑與藥品 FCA：Sigma，USA,批號：116K8706； VEGF-A試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-1045； MVD試劑盒：圣塔克魯茲公司，USA，批號：sc-376975；IL-6、IL-10試劑盒： RD公司，USA,批號：2013012205、2012100204；HIF-1α試劑盒:Bioworld公司，USA,批號：22061046-1；羊抗PI3K、鼠抗AKT1、兔抗p-AKT1、兔抗mTOR抗體：圣塔克魯茲公司，USA，批號： sc-48637、sc-5298、sc-135650、sc-8319；兔抗內皮抑素(Endostatin,ES):Abcam公司，USA,批號：ab01387；新風膠囊：安徽省中醫院制劑中心提供,批號2015021504；甲氨蝶呤：上海信誼生產，批號2015110527；雷公藤多苷片：10 mg/片，上海紅旗制藥廠生產，批號2014100114。

1.1.3 儀器與設備 病理切片機：LEICA，德國,型號：2235；顯微攝像系統：OLYMPUS,日本，型號:BX51T-32000-2；高速冷凍離心機：Sigma，德國，型號：2-16PK。

1.2 方法

1.2.1 模型制備、分組與給藥 將大鼠均分為正常對照組、模型對照組、新風膠囊組、甲氨蝶呤組、雷公藤多苷片組。大鼠右足跖皮內注射 0.1 ml FCA制成 AA模型(除正常對照組外)[9]。注射第12天開始給藥，按照實驗動物與人體體表面積比等效劑量換算比例(相當于臨床成人等效劑量8倍)。新風膠囊組0.24 g/100 g，雷公藤多苷片組1 mg/100 g，每天1次；甲氨蝶呤組0.3 mg/100 g，每周1次；正常對照組、模型對照組予生理鹽水灌胃，0.1 g/100 g，每天1次。各組連續用藥30 d。

1.2.2 血清細胞因子HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10測定 采用ELISA測定血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10的表達。具體步驟依照試劑盒操作。

1.2.3 滑膜MVD測定 將各組大鼠無菌取雙膝關節滑膜，常規制備石蠟包埋切片，行SABC法染色。采用山羊抗鼠MVD多克隆抗體標記血管內皮細胞(一抗濃度稀釋比例1∶200)，結果在顯微鏡下觀察各組血管新生情況[10]。

1.2.4 滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES檢測 制備組織蛋白樣品，蛋白電泳、轉膜，PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES一抗(1∶ 800稀釋)孵育 2 h，分別采用抗羊、小鼠、兔二抗(1∶ 5 000)孵育1 h。用增強化學發光法顯色，條帶用掃描儀對結果攝像；以條帶與各組內參β-actin灰度值的比值作為滑膜PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1 血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6、IL-10變化 與正常對照組比較，模型對照組大鼠血清IL-10降低，HIF-1α、VEGF-A、IL-6升高 (P<0.01或P<0.05)；與模型對照組比較，新風膠囊組IL-10升高，HIF-1α、VEGF-A、IL-6降低 (P<0.01或P<0.05)；新風膠囊組VEGF-A表達低于雷公藤多苷片組 (P<0.05)。見表1。

2.2 大鼠滑膜血管MVD計數比較 模型對照組大鼠血管MVD計數明顯高表達(P<0.01)。治療后，與模型對照組相比，各治療組MVD計數量明顯減少；各治療組間比較， 新風膠囊組MVD計數量低于甲氨蝶呤組(P<0.05)。見圖1。

GroupsHIF?1αVEGF?AIL?6IL?10Normalcontrol32 45±5 38 51 26±9 9744 48±7 1493 47±16 86Modelcontrol82 28±10 982) 93 43±16 492)81 69±10 652) 80 36±12 231)Methotrexate 65 73±11 671)4)5) 66 34±12 341)4)57 17±8 471)4)82 62±12 171)3)5)Tripterygiumglycosides53 65±9 551)4) 74 51±19 941)3)5)53 03±7 311)4)90 75±11 673)XinfengCapsule52 17±7 751)4) 63 60±12 371)4)54 85±6 281)3)95 49±10 433)

Note：Compared with normal control group,1)P<0.05,2)P<0.01;compared with the model control group,3)P<0.05,4)P<0.01;compared with the Xinfeng Capsule group,5)P<0.05.

圖1 滑膜血管MVD計數比較Fig.1 Comparison of MVD in synovial blood vesselsNote：A.Normal control group；B.Model control group；C.Methotrexate group;D.Tripterygium glycosides group;E.Xinfeng Capsule group;F.Expression of MVD in each group.Compared with the normal control group,▲.P<0.05,▲▲.P<0.01;compared with the model group,*.P<0.05,**.P<0.01;compared with the Xinfeng Capsule group，△.P<0.05.

圖2 滑膜血管PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白表達Fig.2 Expression of PI3K,AKT p-AKT,mTOR,ES protein in synovial vascularNote：1.Normal control group；2.Model control group；3.Methotrexate；4.Tripterygium glycosides group；5.Xinfeng Capsule group;A-E is PI3K,AKT,p-AKT,mTOR,ES.

2.3 大鼠滑膜組織PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、ES蛋白表達 與正常對照組比較，mTOR、PI3K、p-AKT、ES在模型對照組明顯增加(P<0.01或P<0.05)。藥物干預后，mTOR、PI3K、p-AKT、ES表達在新風膠囊組降低(P<0.01或P<0.05)；與新風膠囊組比較，甲氨蝶呤組PI3K表達升高；雷公藤多苷片組p-AKT表達升高(P<0.05)。見圖2。

3 討論

PI3K/Akt/mTOR信號通路的激活和HIF-1和VEGF蛋白α、ES表達失衡在滑膜血管生成中發揮重要作用[11-13]。PI3K/Akt通路通過調節HIF-1表達并誘導VEGF、ES產生。PI3K/AKT通路激活可導致低氧環境誘導的滑膜血管的分化、生長，介導細胞生長、發育和血管調節作用。PI3K/AKT通路激活mTOR表達調節細胞增殖,誘發血管形成和血管通透性增加[14,15]。

mTOR上調可引起mTOR通路的激活，從而進一步導致HIF-1α、VEGF-Α、ES表達升高，加重滑膜炎癥和滑膜血管新生的形成。因此，PI3K/AKT通路過度激活也會促使HIF-1α、ES表達增加。PI3K/AKT/mTOR通路激活后首先直接使HIF-1α升高[16,17]。VEGF-Α、ES上調后會誘導RA滑膜血管新生。當組織損傷發生炎癥時，VEGF會被異常表達，而且這種表達會被其他因素所影響。VEGF促血管新生受細胞因子IL-6、IL-10調節，細胞因子IL-6、IL-10對VEGF產生直接或間接的影響，在RA的發病過程中共同促進滑膜血管翳的形成。細胞因子IL-6在RA中呈高表達狀態，IL-10呈低表達。IL-6上調和IL-10下調，可作用于VEGF-A、ES，導致RA血管新生形成。既往研究發現，AA大鼠滑膜PI3K、AKT、mTOR升高，且PI3K、p-AKT、mTOR分別與HIF-1α、VEGF-A、ES呈正相關[18]。說明PI3K/AKT/mTOR通路的過度激活和HIF-1α表達上調可能是促進滑膜血管新生形成原因之一。此結果與Agani等[19]研究結論相似。因此，PI3K/AKT/mTOR通路異常激活后可以提高HIF-1α蛋白合成，進而導致VEGF-A、ES升高，從而通過促進滑膜新生血管生長，參與滑膜炎癥的過程和血管病變[20，21]。

根據以上研究結果，針對RA滑膜血管新生的特點，可以采用抑制滑膜PI3K/AKT/mTOR通路過度激活，降低滑膜血管炎癥反應。本研究結果發現，新風膠囊可降低AA大鼠足趾腫脹度和關節炎指數，滑膜PI3K、p-AKT、mTOR、ES表達降低，血清HIF-1α、VEGF-A、IL-6水平下降，而IL-10表達升高。說明新風膠囊可能是通過降低PI3K/AKT 通路蛋白表達，從而阻止mTOR異常激活，抑制血管內皮細胞增殖，改善滑膜血管新生。新風膠囊由黃芪、薏仁、雷公藤、蜈蚣等藥物組成。黃芪具有益氣、消腫、健脾、除痹之功，薏苡仁具有化濕、除痹之效。黃芪有效成分黃芪皂甙、黃芪多糖具有免疫調節作用，黃芪皂甙能降低關節腫脹、減少關節液和血清炎性細胞因子，黃芪多糖可抑制血管生成作用[22,23]。研究發現，黃芪甲苷可以抑制PI3K/AKT 通路的激活，減低mTOR蛋白表達，降低HIF-1α mRNA表達水平，從而降低VEGF表達[24,25]。薏苡仁含薏苡素，薏苡素具有抗炎、抑制炎性分子分泌作用，薏苡仁有效成分能降低HIF-1α、VEGF的表達[26]。蜈蚣具有抗炎鎮痛作用，蜈蚣多糖蛋白復合物具有可降低VEGF的表達，蜈蚣多糖具有抗血管生成活性。雷公藤含有雷公藤堿等，雷公藤有降低毛細血管通透性、抑制炎性細胞因子IL-6滲出、抗栓塞以及降低HIF-1α、VEGF表達的作用。研究發現，雷公藤甲素能明顯抑制PI3K/AKT 通路激活，還能明顯下調HIF-1α基因和蛋白表達，抑制HIF-1α的轉錄活性[27-30]。

總之，新風膠囊改善滑膜血管新生機制可能是通過下調PI3K、p-AKT、mTOR表達，抑制PI3K/AKT/mTOR通路過度激活，從而降低HIF-1α的轉錄，減少VEGF釋放，從而進一步減少MVD表達，降低滑膜血管新生。

[1] Collison J.Rheumatoid arthritis:Features of synovium in RA remission revealed[J].Nat Rev Rheumatol，2016,12(6):316.

[2] Gao J,Zhou XL,Kong RN,etal.microRNA-126 targeting PIK3R2 promotes rheumatoid arthritis synovial fibro-blasts proliferation and resistance to apoptosis by regulating PI3K/AKT pathway [J].Exp Mol Pathol,2016,100(1):192-198.

[3] Zhang Y,Zhang B.Trichostatin A,an inhibitor of histone deacetylase,inhibits the viability and invasiveness of hypoxic rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes via PI3K/Akt signaling [J].J Biochem Mol Toxicol,2016,30(4):163-169.

[4] Lv Q,Zhu XY,Xia YF,etal.Tetrandrine inhibits migration and invasion of rheumatoid arthritis fibroblast-like synoviocytes through down-regulating the expressions of Rac1,Cdc42,and RhoA GTPases and activation of the PI3K/Akt and JNK signaling pathways [J].Chin J Nat Med，2015,13(11):831-841.

[5] Hua S,Dias TH.Hypoxia-Inducible factor (HIF) as a target for novel therapies in rheumatoid arthritis [J].Front Pharmacol,2016,7:184.

[6] Liu J,Chen RL.The potential role of chinese medicine in ameliorating extra-articular manifestations of rheumatoid arthritis[J].Chin J Integr Med，2011,17(10):735-737.

[7] 萬 磊,劉 健.新風膠囊對佐劑關節炎大鼠肺功能、Th細胞及調節性T細胞的影響[J].中華中醫藥雜志,2013,28(5):1366-1371.

[8] Wan L,Liu J,Huang C,etal.Effects of xinfeng capsule on pulmonary function based on treg-mediated notch pathway in a rat model of adjuvant arthritis[J].J Tradit Chin Med,2012,32(3):430-436.

[9] 徐叔云,卞如濂,陳 修.藥理實驗方法學[M].第3版.北京:人民衛生出版社,2002:919-921.

[10] 張 育,周 瑋,顧 健,等.沙利度胺及氨甲蝶吟抗CIA大鼠滑膜血管新生及其作用機制的研究[J].實用臨床醫藥雜志,2008,12(5):23-27.

[11] Han W,Xiong Y,Li Y,etal.Anti-arthritic effects of clematichinenoside (AR-6) on PI3K/Akt signaling pathway and TNF-α associated with collagen-induced arthritis[J].Pharm Biol，2013,51(1):13-22.

[12] Cury V,Moretti AI,Assis L,etal.Low level laser therapy increases angiogenesis in a model of ischemic skin flap in rats mediated by VEGF,HIF-1α and MMP-2[J].J Photochem Photobiol B,2013,125:164-170.

[13] Bhattacharya D,Singh MK,Chaudhuri S,etal.T11TS impedes glioma angiogenesis by inhibiting VEGF signaling and pro-survival PI3K/Akt/eNOS pathway with concomitant upregulation of PTEN in brain endothelial cells[J].J Neurooncol,2013,113(1):13-25.

[14] Kishore T KK,Ganugula R,Gade DR,etal.Gedunin abrogates aldose reductase,PI3K/Akt/mToR,and NF-κB signaling pathways to inhibit angiogenesis in a hamster model of oral carcinogenesis [J].Tumour Biol,2016,37(2):2083-2093.

[15] Fujii M,Amanso A,Abrah?o TB,etal.Polymerase delta-interacting protein 2 regulates collagen accumulation via activation of the Akt/mTOR pathway in vascular smooth muscle cells [J].J Mol Cell Cardiol,2016,92:21-29.

[16] Park JH,Lee JY,Shin DH,etal.Loss of Mel-18 induces tumor angiogenesis through enhancing the activity and expression of HIF-1α mediated by the PTEN/PI3K/Akt pathway[J].Oncogene,2011,30(45):4578-4589.

[17] Westra J,Brouwer E,Bos R,etal.Regulation of cytokine-induced HIF-1alpha expression in rheumatoid synovial fibroblasts[J].Ann N Y Acad Sci,2007,1108:340-348.

[18] 張曉軍,劉 健,萬 磊,等.佐劑關節炎大鼠滑膜血管新生與PTEN/PI3K/AKT信號傳導通路的關系[J].中國骨傷，2015,28(1):71-74.

[19] Agani F,Jiang BH.Oxygen-independent regulation of HIF-1:novel involvement of PI3K/AKT/mTOR pathway in cancer[J].Curr Cancer Drug Targets,2013,13(3):245-251.

[20] Sun P,Wei S,Wei X,etal.Anger emotional stress influences VEGF/VEGFR2 and its induced PI3K/AKT/mTOR signaling pathway [J].Neural Plast,2016,2016:4129015.

[21] Yang Y,Cong H,Han C,etal.12-Deoxyphorbol 13-palmitate inhibits the expression of VEGF and HIF-1α in MCF-7 cells by blocking the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway [J].Oncol Rep,2015,34(4):1755-1760.

[22] Shin JM,Jeong YJ,Cho HJ,etal.Melittin suppresses HIF-1α/VEGF expression through inhibition of ERK and mTOR/p70S6K pathway in human cervical carcinoma cells[J].PLoS One,2013,8(7):e69380.

[23] Wang D,Zhuang Y,Tian Y,etal.Study of the effects of total flavonoids of Astragalus on atherosclerosis formation and potential mechanisms[J].Oxid Med Cell Longev,2012,2012:282383.

[24] Qu ZH,Yang ZC,Chen L,etal.Inhibition airway remodeling and transforming growth factor-β1/Smad signaling pathway by astragalus extract in asthmatic mice[J].Int J Mol Med,2012,29(4):564-568.

[25] Auyeung KK,Mok NL,Wong CM,etal.Astragalus saponins modulate mTOR and ERK signaling to promote apoptosis through the extrinsic pathway in HT-29 colon cancer cells[J].Int J Mol Med,2010,26(3):341-349.

[26] Zhang L,Liu Q,Lu L,etal.Astragaloside IV stimulates angiogenesis and increases hypoxia-inducible factor-1α accumulation via phosphatidylinositol 3-kinase/Akt pathway[J].J Pharmacol Exp Ther,2011,338(2):485-491.

[27] Wang L,Sun J,Yi Q,etal.Protective effect of polyphenols extract of adlay (Coix lachryma-jobi L.var.ma-yuen Stapf) on hypercholesterolemia-induced oxidative stress in rats[J].Molecules,2012,17(8):8886-8897.

[28] Lu N,Liu J,Liu J,etal.Antagonist effect of triptolide on AKT activation by truncated retinoid X receptor-alpha[J].PLoS One,2012,7(4):e35722.

[29] Chen F,Liu Y,Wang S,etal.Triptolide,a Chinese herbal extract,enhances drug sensitivity of resistant myeloid leukemia cell lines through downregulation of HIF-1α and Nrf2[J].Pharmacogenomics,2013,14(11):1305-1317.

[30] Zhou ZL,Luo ZG,Yu B,etal.Increased accumulation of hypoxia-inducible factor-1α with reduced transcriptional activity mediates the antitumor effect of triptolide[J].Mol Cancer,2010,9:268.

[收稿2016-08-07 修回2016-10-25]

(編輯 張曉舟)

Effects of Xinfeng Capsule on synovial angiogenesis based PI3K/AKT/mTOR pathway,HIF-1α,ES in rats model of adjuvant arthritis

ZHANGXiao-Jun,LIUJian,WANLei,HUANGChuan-Bing.

AnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei230038,China

Objective:To observe the effect of Xinfeng Capsule (XFC) on synovial membrane PI3K/AKT/mTOR pathway in adjuvant arthritis (AA) rats.Methods：Rats were randomly divided into normal control group,model control group,methotrexate group,tripterygium glycoside group and XFC group.The expressions of IL-6,IL-10,HIF-1α and VEGF-A were detected by immunohistochemical method,and the expressions of PI3K,AKT1 and p-AKT1 were detected by immunoblotting.Results：Expression of AKT1,mTOR and ES proteins in synovial blood vessels.The expression of IL-6,VEGF,HIF-1α and synovial membrane PI3K,AKT1,p-AKT1,mTOR,ES in the model group were significantly higher than those in the control group The expression of PI3K,p-AKT1,mTOR,ES in synovial membrane decreased,and IL-10 in serum increased in XFC group,and the expression of HIF-1α,IL-6 and VEGF-A were decreased.Conclusion：XFC can improve angiogenesis in AA synovium by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling pathway,HIF-1α and ES expression.

Adjuvant arthritis;Angiogenesis;PI3K/AKT/mTOR pathway;Xinfeng Capsule

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.011

①本文為安徽省科技廳項目(1604f0804030)、國家自然科學基金青年項目(81403388)、安徽省自然基金項目(1508085QH159)、安徽省重點實驗室:現代中醫內科應用基礎與開發研究(1606c08238)和安徽中醫藥大學校級基金(2014qn025)資助項目。

張曉軍(1976年-)，男，博士，副教授，主要從事中醫藥防治風濕、類風濕疾病研究，E-mail：zhecho223@sohu.com。

及指導教師：劉 健(1964年-),男,教授,博士生導師,主要從事中醫藥防治風濕病研究,E-mail:liujianahzy@126.com。

R593.2

A

1000-484X(2017)04-0533-05

②安徽中醫藥大學第一附屬醫院,合肥230038。