雷公藤多苷抑制二肽肽酶I活性及其調節機制的研究①

王晶晶 蔣 媛 儲 奕 柳 麗 周曉鷹

(常州大學制藥與生命科學學院，常州213164)

雷公藤多苷抑制二肽肽酶I活性及其調節機制的研究①

王晶晶 蔣 媛 儲 奕 柳 麗 周曉鷹

(常州大學制藥與生命科學學院，常州213164)

目的：二肽肽酶I(DPPI)是一種溶酶體半胱氨酸蛋白酶，高表達于顆粒免疫細胞包括肥大細胞，有激活炎癥介質絲氨酸蛋白酶的功能。本研究用膠原誘導類風濕關節炎(Collagen-induced arthritis，CIA)大鼠模型，探討雷公藤多苷對DPPI的作用以揭示其治療類風濕的藥理機制。方法：Wistar大鼠隨機分為正常組、模型組和雷公藤多苷治療組(低劑量組2.5 mg/100 g 體重，高劑量組5 mg/100 g體重);用牛Ⅱ型膠原加完全弗氏佐劑誘導大鼠類風濕關節炎，兩次免疫后第12天開始灌胃給藥，連續2周后處死，收集血液和滑膜。關節切片HE染色和細胞計數，熒光底物法檢測DPPI在大鼠血清和滑膜中的表達和活性，明膠酶譜法檢測滑膜液中MMP-2/9表達水平，BCA法測定樣品總蛋白含量。結果：和模型組相比，雷公藤多苷能降低CIA大鼠關節滑膜組織中肥大細胞的數量，并抑制滑膜液和血清DPPI的活性；滑膜總蛋白和MMP-2/9活性也有所降低。結論：雷公藤多苷對DPPI活性的抑制作用可能是其治療類風濕藥理學機制之一。

雷公藤多苷；CIA大鼠；二肽肽酶I；類風濕關節；基質金屬蛋白酶

二肽肽酶I是溶酶體內一種半胱氨酸蛋白酶(Dipeptidyl peptidase I，DPPI)，又稱組織蛋白酶C，具有肽鏈外切酶的活性[1]。DPPI高表達于免疫顆粒細胞，如：肥大細胞、中性粒細胞和自然殺死細胞等。DPPI是絲氨酸蛋白酶(Serine proteases)，比如肥大細胞類糜蛋白酶(Chymase)、中性粒細胞彈性酶(Elastase)、自然殺死細胞顆粒酶A和B等炎癥介質的重要激活酶[2,3]。絲氨酸蛋白酶是一個蛋白裂解酶家族，在炎癥、過敏、凝血、損傷等過程中有重要作用。絲氨酸蛋白酶在細胞顆粒裝配之前以酶原存在，需要DPPI在酶原的N端去除二肽之后，絲氨酸蛋白酶才會具有病理作用的酶活性功能[4]。其中肥大細胞釋放專屬性的絲氨酸蛋白酶類糜蛋白酶(Chymase)是前體基質金屬蛋白酶-9(pro-matrix metalloproteinases-9，pro-MMP-9)的關鍵活化酶，在組織炎癥的發展和重塑中發揮重要的作用[5]。

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種慢性，全身性炎性關節疾病，表現滑膜關節損傷，導致關節軟骨和關節的融合和破壞[6]。研究表明RA的關節腔和滑膜組織中，發現肥大細胞，中性粒細胞等顆粒免疫細胞的聚集[7,8]。DPPI基因敲除的老鼠對牛Ⅱ型膠原(Collagen-induced arthritis，CIA)誘導的類風濕關節炎具有抗性作用，并且在膠原誘導的關節炎模型中起到高強度的保護作用[9,10]。DPPI在類風濕疾病發病過程中的作用研究引起了我們的注意。

雷公藤多苷(Triperygium Wilfordii Polyglu-coside,TWP)是從衛矛科植物雷公藤(Tripterygium wilffordii Hook F,TwHF)有效部位去皮根中提取的混合物，是一種具有抗炎和免疫調節作用的活性成分[11]。大量的臨床實驗表明雷公藤多苷在類風濕關節炎臨床治療中具有獨特的療效，可以減輕RA患者癥狀、降低各種炎癥介質表達水平、保護軟骨和骨不被破壞等[12-15]。但是，雷公藤多苷治療類風濕關節炎的藥理機制尚不完全清楚。

本研究通過建立CIA大鼠模型來調查雷公藤多苷對DPPI的作用，從而進一步揭示雷公藤多苷的新的藥理機制。

1 材料與方法

1.1 材料 雷公藤多苷片(TG)(湖南協力藥業有限公司)，牛Ⅱ型膠原蛋白(美國Chondrex),完全弗氏佐劑(CFA)(美國Sigma),Gly-Phe-4MβNA(瑞士Bachen),BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(上海碧云天生物技術有限公司),清潔級健康雌性Wistar大白鼠(常州卡文斯動物實驗有限公司)，250 g，6～8周齡。熒光儀(LS55)(美國PerkinElmer)，微量高速冷凍離心機(美國，Thermofisher)。

1.2 方法

1.2.1 CIA 大鼠模型 動物實驗過程中對動物的飼養和處置符合實驗動物國家標準并得到常州大學生物醫學倫理學學會的準許。參照文獻[16]的方法，Wistar大鼠隨機分為4組：正常組、模型組、雷公藤多苷低劑量治療組和高劑量治療組，每組4只。牛Ⅱ型膠原蛋白(2 mg/ml)與完全弗氏佐劑等體積混合(無菌操作)。對模型組和雷公藤多苷組的大鼠進行免疫，大鼠尾根部2 cm皮下注射膠原蛋白乳劑0.2 ml。初次致敏后第7天按照同樣的方法加強免疫1次。

1.2.2 雷公藤多苷干預 Wistar大鼠2次免疫后第12天，治療組使用雷公藤多苷(低劑量組2.5 mg/100 g 體重；高劑量組5.0 mg/100 g體重)分別與0.5%的羧甲基纖維素鈉混勻灌胃，正常組和模型對照組大鼠每天灌注等量的羧甲基纖維素鈉，持續2周。

1.2.3 大鼠關節切片HE染色和肥大細胞計數 給藥兩周后，取血處死動物，取大鼠后雙肢關節，用40%的福爾馬林溶液固定，脫鈣，常規石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡觀察肥大細胞在關節滑膜中的浸潤情況和細胞計數(單位細胞數平均值，n=5)。

1.2.4 大鼠血清和滑膜液勻漿的制備 分別從正常組、模型組及雷公藤多苷治療組的大鼠(乙醚麻醉后)眼眶抽提靜脈血，室溫靜置2 h后置冷凍離心機4℃，4 000 r/min，15 min離心，取上清液，置于-80℃冰箱中保存備用。參照文獻[17]的方法處死大鼠后，縱行切開后肢膝關節正中皮膚，暴露出膝關節的區域，可見由髕骨下極向下延續的一層平滑光亮呈淺淡黃色的滑膜組織，剝離滑膜組織，無菌冰生理鹽水清洗。將滑膜組織稱重，放入10 ml的小燒杯內。用移液管量取1/4滑膜體積的PBS含蛋白酶抑制劑(1 mmol/L)，剪刀處理為碎塊后勻漿，5 min 后置4℃離心，3 000 r/min，20 min。取上清液，-80℃冰箱保存備用。

1.2.5 血清和滑膜液DPPI活性檢測 96孔板，90 μl 含有0.5 mmol/L底物Gly-Phe-4MβNA的DPPI活性測定緩沖液(25 mmol/L檸檬酸，10 mmol/L NaCl)和10 μl的血清或滑膜液混勻，在激發波長335 nm和發射波長415 nm下檢測熒光強度。

1.2.6 明膠酶譜法檢測滑膜液中MMP-2/9的表達和活性 按照文獻[17]報道的方法進行試驗，將滑膜液與SDS電泳上樣緩沖溶液(0.5 mmol/L Tris-HCl，甘油，10%SDS，0.1%溴酚藍)以體積比1∶1的混勻上樣，用含有1 mg/ml的明膠的8%分離膠進行電泳。電泳終止后凝膠置2.5% Triton X-100液中漂洗20 min，2次。于蛋白水解緩沖液(50 mmol/L Tris，0.2 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2，0.02% Triton X-100)中，并置37℃孵育過夜。第2天，0.5%考馬斯藍R-250染色30 min，然后用水脫色，直至可以看見清晰的白色條帶。使用Bio-Rad凝膠成像儀拍照，ImageLab軟件對膠塊進行光密度分析。

1.2.7 BCA法測定滑膜液和血清總蛋白 用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定提取液中的蛋白濃度，按試劑盒的操作方法進行。以BSA作為標準蛋白并制定標準曲線，進而根據樣品的OD值計算滑液或血清中總蛋白的濃度。

2 結果

2.1 雷公藤多苷降低CIA大鼠關節中肥大細胞的數量 組織學觀察關節的炎癥和骨組織的損傷,組織切片HE染色用于觀察肥大細胞的浸潤情況。圖1A為模型組大鼠的HE染色情況，單位面積內的細胞數79.6±4.18。圖1B為給藥組單位面積內的細胞數59.2±3.02。相比之下，圖1C顯示給藥組肥大細胞的數量比模型組減少25.6%(P=0.004)，表明雷公藤多苷減少了關節肥大細胞的局部浸潤。

2.2 雷公藤多苷抑制CIA大鼠滑膜液和血清中DPPI活性 熒光檢測結果如圖2A所示，DPPI在滑膜液中的活性，模型組比正常組高93.9%(P=0.03),雷公藤多苷治療2周后DPPI的活性較模型組降低57.1%(P=0.18)，和正常組比較差異無統計學意義(P=0.23)。圖2B所示，在血清中，與正常組相比較，模型組的DPPI活性升高40.1%(P=0.12)；與模型組比較，雷公藤多苷高劑量組顯著性地抑制DPPI的活性達58.9%(P=0.01)；而低劑量組的DPPI活性稍低于模型組，但差異無統計學意義(P=0.19)。與正常組比較,高、低劑量的雷公藤多苷治療組大鼠DPPI活性差異均無統計學意義(P=0.52，P=0.41)。本實驗中雷公藤多苷顯示了對CIA大鼠滑膜液和血清中的DPPI有較好的抑制作用。

2.3 CIA大鼠滑膜液中MMP-2/9的表達和活性變化 明膠酶譜法結果如圖3所示，滑膜液MMP-9的表達活性模型組的高于正常組59.7%(P=0.001)；和模型組比較，雷公藤多苷治療后，MMP-9的活性降低56.5%(P=0.02)，與正常組相比差異無統計學意義(P=0.74)。MMP-2的表達活性，模型組顯著高于正常組48.7%(P=0.001)。雷公藤多苷給藥后，MMP-2的表達活性降低45.0%，與模型組比較差異有統計學意義(P=0.004)，與正常組比較差異無統計學意義(P=0.58)。MMP-2和MMP-9均恢復到正常水平。

圖1 雷公藤多苷對CIA大鼠關節組織中肥大細胞的影響Fig.1 Effects of TWP on mast cells of CIA rats joint tissueNote: Joint tissue biopsy and mast cell distribution of CIA model group (A) and TWP treated group (B) stained with hematoxylin;C.The mean number of mast cells per reading area(n=5).**.P<0.01.

2.4 雷公藤多苷降低滑膜液中總蛋白的濃度 圖4顯示，在免疫后，CIA大鼠滑膜液中的總蛋白濃度要高于正常組68.1%(P=0.01)。經過雷公藤多苷治療后滑膜液中總蛋白濃度比模型組降低43.5%(P=0.01)，與正常組相比差異無統計學意義(P=0.1)，說明雷公藤多苷可以減輕CIA大鼠滑膜炎癥癥狀。

圖2 雷公藤多苷對CIA大鼠滑膜液(A)和血清(B)中DPPI活性的影響Fig.2 Effect of TWP on DPPI activities in SFs (A) and serum (B) of CIA ratsNote: *.P<0.05.

圖3 明膠色譜法檢測各組滑膜液中MMP-2/9的表達Fig.3 Geletin-Zymography analysis of MMP-2/9 in SFs from different groupsNote：A.Expressions and activities of MMP-2/9 in SFs from different groups(geletin gel);MMP-2 (B) and MMP-9 (C) integrated optical density analysis (Imagelab software,semi-quantitation).*.P<0.05；**.P<0.01.

圖4 各組的大鼠滑膜液中總蛋白濃度Fig.4 Total protein concentration in SFs of rats from different groupsNote: *.P<0.05.

圖5 雷公藤多苷通過抑制DPPI進一步調控下游蛋白酶以治療類風濕的新的藥理機制示意圖Fig.5 Schematic view of a new pharmaceutical mechanism of TWP in RA treatmentNote：A.Pathological role of DPPI in synovial inflammation and RA development;B.The inhibitory effects of TWP on DPPI activity and its downstream regulation.

3 討論

我們的研究結果表明，雷公藤多苷使CIA大鼠滑膜中的DPPI活性顯著下降，血清中DPPI的含量及活性亦顯著降低，雷公藤多苷和治療效果呈一定的劑量依賴關系，說明在類風濕關節炎的治療過程中雷公藤多苷的作用機制可能與降低DPPI的活性有關。雷公藤多苷使CIA大鼠關節滑膜中的肥大細胞數量降低，表明雷公藤多苷也可能通過降低肥大細胞在關節滑膜組織的招募或增殖來降低DPPI的總量從而顯示較低的DPPI活性。

細胞外基質(Extracellular matrixc，ECM)是骨組織結構完整的重要組成成分。RA患者關節軟骨和骨組織中的MMPs可降解RA的骨組織和關節軟骨中的黏蛋白，膠原蛋白以及ECM中的其他組成成分，從而加速漿細胞、巨噬細胞及淋巴細胞對軟骨的破壞，形成遍及全身的關節滑膜炎。其中MMP-2和MMP-9屬于明膠酶，可以降解關節軟骨組織中必不可少的多種膠原、蛋白多糖和層黏連蛋白[18]。明膠酶譜法的檢測結果表明雷公藤多苷使MMP-9和MMP-2的表達和活性得以降低，說明雷公藤多苷也許通過調節DPPI的活性和調節肥大細胞的數量進一步影響肥大細胞蛋白酶的活性從而降低了對MMP-9和MMP-2的活性；雷公藤多苷也許通過抑制關節組織細胞的活性從而降低MMP-9和MMP-2細胞分泌。

RA主要的病理變化是關節滑膜的慢性炎癥反應。炎癥發生時，會導致免疫細胞的產生即導致球蛋白的增高；血管壁通透性增加，血液流速變慢，血漿滲出，使血液濃縮即白蛋白以及球蛋白濃度升高。我們的結果表明CIA模型組中總蛋白的濃度明顯高于正常組，而雷公藤多苷可以降低滑膜液中總蛋白濃度，由此可以看出雷公藤多苷可以減緩炎癥的發展。

綜上所述，并如圖5所示，雷公藤多苷對CIA大鼠類風濕疾病的發展具有一定的抑制作用，其藥理作用可以通過抑制血清和滑膜中DPPI活性，從而抑制下游的糜蛋白酶酶原激活，并進一步抑制或降低MMP-2和MMP-9活性，以減輕類風濕關節炎的炎癥表征。同時，雷公藤多苷通過降低局部肥大細胞數量或抑制肥大細胞活性，以降低類風濕關節炎的傷害。本研究結果顯示了雷公藤多苷對血液和滑膜組織DPPI活性的抑制作用以及對肥大細胞數量的調控，揭示了雷公藤多苷對類風濕治療作用的新的藥理機制。

[1] Kalathiya U.Molecular docking studies towards development of Novel Gly-Phe analogs for potential inhibition of cathepsin C(dipeptidyl peptidase I)[J].Int J Comput Biol,2014,3:3-26.

[2] Ruffell B,Affara NI,Cottone L,etal.Cathepsin C is a tissue-specific regulator of squamous carcinogenesis [J].Genes Dev,2013,27(19):2086-2098.

[3] Wolters PJ,Pham CT,Muilenburg DJ,etal.Dipeptidyl peptidase I is essential for activation of mast cell chymases,but not tryptases,in mice [J].J Biol Chem,2001,276(21):18551-18556.

[4] Kai F,Wu X,Fan B,etal.Up-regulation of microglial cathepsin C expression and activity in lipopolysaccharide-induced neuroin-flammation [J].J Neuroinflammation,2012,9(1):88-92.

[5] 郭美霞,張曉華,朱人敏.類糜蛋白酶在肝臟纖維化中的作用[J].中華老年多器官疾病雜志,2011,10(6):560-562.

[6] Fanetgoguet M,Martin S,Fernandez C,etal.Focus on biological agents in arthritis:newer treatments and therapeutic strategies [J].Thérapie,2004,59(4):47-51.

[7] Velden DVD,Lagraauw HM,Wezel A,etal.Mast cell depletion in the preclinical phase of collagen-induced arthritis reduces clinical outcome by lowering the inflammatory cytokine profile [J].Arthritis Res Ther,2016,18(1):1-12.

[8] Headland SE.The role of neutrophil microparticles in rheumatoid arthritis [J].J Eur Acad Dermatol,2014,16(1):74-76.

[9] Hu Y,Pham CTN.Dipeptidyl peptidase I regulates the development of collagen-induced arthritis [J].Arthritis Rheumatol,2005,52(8):2553-2558.

[10] Pham CT,Ivanovich JL,Raptis SZ,etal.Papillon-Lefèvre syndrome:correlating the molecular,cellular,and clinical consequences of cathepsin C/dipeptidyl peptidase I deficiency in humans [J].J Immunol,2004,173(12):7277-7281.

[11] 謝 艷,郭云鵬.雷公藤治療類風濕關節炎的作用機制研究進展[J].風濕病與關節炎,2013,2(4):72-75.

[12] Jiang M,Zha Q,Zhang C,etal.Predicting and verifying outcome of Tripterygiumwilfordii Hook F.based therapy in rheumatoid arthritis:from open to double-blinded randomized trial [J].Sci Rep,2015,5:9700.

[13] 張 磊,周艷麗,劉 維.白芍總苷聯合雷公藤多苷治療類風濕關節炎增效減毒臨床療效觀察[J].天津中醫藥,2005,22(3):207-208.

[14] 劉 維,周艷麗,王玉亮,等.雷公藤多苷治療類風濕關節炎臨床治療方案研究[J].天津中醫藥,2004,21(5):429-429.

[15] 曾貴平.電針配合雷公藤多苷片治療類風濕關節炎37例[J].現代中西醫結合雜志,2008,17(32):5029-5030.

[16] Hu Y,Liu R,Li J,etal.Attenuation of collagen-induced arthritis in rat by nicotinic alpha7 receptor partial agonist GTS-21 [J].Biomed Res Int,2014,2014(7):6-6.

[17] Heussen C,Dowdle EB.Electrophoretic analysis of plas minogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates [J].Anal Bio Chem，1980,102:196-202.

[18] 付 鈺,王光義.中藥大血藤對佐劑性關節炎大鼠滑膜細胞MMP-2、MMP-9的影響[J].貴州醫藥,2009,33(12):1097-1099.

[收稿2016-09-14 修回2016-12-21]

(編輯 張曉舟)

Study on inhibitory effects of Triperygium Wilfordii Polyglucoside on Dipeptidyl peptidase I and regulatory mechanism

WANGJing-Jing,JIANGYuan,CHUYi,LIULi，ZHOUXiao-Ying.

TheSchoolofPharmaceuticalEngineeringandLifeScience,ChangzhouUniversity,Changzhou213164,China

Objective:Dipeptidyl peptidase I(DPPI),a lysosomal cysteine protease for serine proteases activation,highly expressed in granule immune cells.This study used collagen induced arthritis(CIA) rat model to investigate the effects of Triperygium Wilfordii Polyglucoside(TWP) on DPPI activity and the pharmacological mechanism in RA treatment.Methods：Rats were divided into four groups randomly,the blank control group,the CIA model group,the high dose (5.0 mg/100 g body-weight) and low dose(2.5 mg/100 g body-weight)treatment group.Bovine collagen-Ⅱ plus complete Freund′s adjuvant injected twice in rats.Physical assessments were carried out.12 days post-injections,the rats of treatment group were intragastric administered with TWP every day.The rats were killed after two week administrations.Serum and synovial membrane homogenates were collected and DPPI activity was detected by fluorescence substrate.Joint HE staining and cell counting were carried out，Zymography was used to detect the MMP-2/9 activity in synovial fluids.Total protein in synovial membrane homogenates were measured by BCA method.Results：TWP could reduce the number of CIA synovial tissue mast cells，inhibited DPPI activity in the synovial fluids and in serum.The expression levels of MMP-2/9 activity and synovium total protein content were also reduced by TWP.Conclusion：Triperygium Wilfordii Polyglucoside has inhibitory effects on DPPI activity on CIA rats,which might be the one of the pharmacological mechanisms in RA treatment.

Triperygium Wilfordii Polyglucoside;CIA rat;Dipeptidyl peptidase I;Rheumatoid arthritis;Matrix metallo-proteinases

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.012

王晶晶(1990年-)，女，在讀碩士，主要從事免疫藥學研究。

及指導教師：周曉鷹(1957年-)，女，博士，常州大學特聘教授，英國Southampton University 客座教授，博士生導師，主要從事免疫藥學、生物醫學和生物診斷技術的研究，E-mail： xiaoyingzhou@ccu.edu.cn。

R730.5

A

1000-484X(2017)04-0537-05

①本文為常州大學高層次人才引進啟動基金(ZMF14020066)和常州科技局國際交流研究基金(KYJ1520305)。