應用rmIL-18誘導腫瘤特異性CTL治療肝癌的實驗研究①

米旭光 劉 磊 李首慶 魏海峰 許淑芬 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫院腫瘤綜合治療科，長春130021)

·生物治療·

應用rmIL-18誘導腫瘤特異性CTL治療肝癌的實驗研究①

米旭光 劉 磊 李首慶 魏海峰 許淑芬 譚 巖 方艷秋

(吉林省人民醫院腫瘤綜合治療科，長春130021)

目的：研究rmIL-18在體外培養系統(Coculture system in vitro，CCs)誘導腫瘤特異性細胞毒性T淋巴細胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)及在小鼠體內發揮的抗肝癌效果。方法：采用Stem SepTM免疫磁性細胞分離方法分離培養小鼠脾臟NK細胞、T細胞及DCs，建立體外培養系統；采用不同途徑，不同劑量CTL免疫肝細胞癌荷瘤小鼠，研究CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度和生存時間的影響。結果：rmIL-18能夠在體外培養系統中誘導并促進CTL介導的腫瘤特異性殺傷效應；CTL能夠明顯抑制荷肝癌小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)及明顯延長荷瘤小鼠生存時間(P<0.01)，并且這種作用隨rmIL-18濃度的增加而增強(P<0.01)，且腫瘤內注射均優于腹腔內注射(P<0.01)。結論：rmIL-18可以在體外誘導腫瘤特異性CTL并在小鼠體內發揮抗肝癌作用。

體外培養系統；rmIL-18；細胞毒性T淋巴細胞；抗腫瘤

肝癌是一種發病率高、惡性度高、預后較差、嚴重危害生命的惡性腫瘤，在我國惡性腫瘤的發病率中，男性居第三位，女性居第四位。采用手術、放療、化療等綜合治療措施后，肝癌仍居惡性腫瘤死亡率的第一位[1]。近年來，免疫治療愈來愈受到人們的重視，并且已用于各種腫瘤的實驗研究和臨床治療。IL-18具有增強免疫、抗腫瘤、抗感染等重要作用，在腫瘤的生物治療中表現出了廣泛的應用前景[2,3]。本實驗研究重組鼠白細胞介素18(recombinant mouse interleukin-18，rmIL-18)在體外培養系統誘導的腫瘤特異性CTL作用和在小鼠體內發揮的抗肝癌作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 H22細胞株為BALB/c小鼠肝細胞癌，由本室經小鼠腹腔傳代培養。

1.1.2 實驗動物 BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，20～25 g，購自生物制品研究所動物部。

1.1.3 試劑 ①小鼠T細胞富集混合單克隆抗體，含抗CD11b CMac-1、抗CD45R(B220)、抗髓樣分化抗原(Gr-1)、抗紅細胞樣細胞(TER119)，0.2 ml可標記1×109細胞；②小鼠NK細胞富集混合單克隆抗體，含抗紅細胞樣細胞(TER119)、抗CD22、抗F4/80、抗CD5ccy-1、抗髓樣分化抗原(Gr-1)，0.2 ml可標記1×109細胞；③小鼠樹突狀細胞富集混合單克隆抗體，含抗CD2、抗CD3、抗CD45R(B220)、抗髓樣分化抗原(Gr-1)、抗中性粒細胞抗原(7/4)、抗紅細胞樣抗原(TER119)，0.2 ml可標記1×109細胞。均購于StemCell Technologies，美國。重組細胞因子 rmIL-18 本實驗室制備。抗小鼠IFN-γ單抗購于長春博特生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠脾臟純化NK、DCs和T細胞的制備 采用Stem SepTM免疫磁性細胞分離方法分離培養小鼠脾臟NK細胞、T細胞及DCs。

1.2.1.1 小鼠脾臟單核細胞懸液的制備 無菌條件下取出小鼠脾臟，以200目細胞網分離小鼠脾細胞，制備單核細胞懸液，溶解紅細胞，以無血清IMDM培養基洗滌3次，調整細胞濃度至1×108個/ml，以10% FCS IMDM培養液培養備用。

1.2.1.2 分離小鼠脾臟DCs 取含1×109小鼠脾細胞懸液9 ml(含1 mmol/L EDTA無鈣鎂PBS)，加入Stem SepTM小鼠DCs富集混合抗體1 ml。充分混合后，37℃ 5%CO2培養30 min，PBS洗滌3次，再加入四抗體磁珠混合物，37℃ 5%CO2培養30 min，過無菌磁性篩柱，收集未標記的目的細胞，PBS洗滌3次。細胞加入含10 ng/ml GM-CSF、10% FCS的IMDM培養液，培養備用。

1.2.1.3 分離小鼠脾臟NK細胞 取含1×109小鼠脾細胞懸液9 ml(含1 mmol/L EDTA無鈣鎂PBS)，加入Stem SepTM小鼠NK細胞富集混合抗體1 ml。充分混合后，洗滌與磁性分離如1.2.1.2。收集的細胞加入10%FCS的IMDM培養液，培養備用。

1.2.2 建立體外培養系統 實驗前，將分離純化的小鼠脾臟NK細胞、T細胞及DCs按一定的細胞比例加入培養系統，其中NK細胞為16.5%、T細胞為82.7%、DCs為0.8%。

1.2.3 CTL殺傷實驗 為觀察rmIL-18在CCs中誘導腫瘤特異性CTL的能力，將絲裂霉素(MMC 100 μg/ml)處理1 h的H22細胞按2%的比例加入CCs，再加入不同濃度的rmIL-18(0、10、50、100 ng/ml)，37℃ 5%CO2培養96 h后收集細胞，以不同的效靶比(1∶6.25、1∶12.5、1∶25、1∶50)分別檢測對125I-UdR標記的H22細胞的特異性殺傷能力。

1.2.4 小鼠肝細胞癌實驗動物模型的建立 將生長良好、源于BALB/c小鼠的肝癌細胞H22經PBS洗滌3次，分別取5×105、1×106、2×106個細胞溶于100 μl生理鹽水中，接種于3組BALB/c小鼠右肋部皮下(day 0)，作為皮下接種肝癌的實驗動物模型。確定建立肝細胞癌荷瘤小鼠的合適H22細胞濃度。

1.2.5 應用腫瘤特異性CTL免疫荷瘤小鼠 采用不同途徑，不同劑量rmIL-18免疫肝細胞癌荷瘤小鼠，研究腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度和生存時間的影響。實驗動物腫瘤直徑的測量方法(皮下荷瘤模型)：腫瘤直徑(mm)=(腫瘤最長直徑+腫瘤最短直徑)/2。

1.3 統計學方法 兩組顯著性差異用t檢驗，生存率用Kaplan-Meier乘積限法估計。

2 結果

2.1 rmIL-18在CCs中誘導腫瘤特異性CTL 以不同濃度的rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL以不同的效靶比(1∶6.25、1∶12.5、1∶25、1∶50)分別檢測對125I-UdR標記的H22細胞的特異性殺傷能力。結果表明(圖1)，在CCs中，rmIL-18能夠促進CTL介導的腫瘤特異性殺傷效應，這種殺傷作用與rmIL-18的含量呈劑量依賴關系，即隨rmIL-18的濃度增高而增加。

2.2 在CCs中IFN-γ對rmIL-18誘導腫瘤特異性CTL的影響 我們觀察了IFN-γ在CCs中對rmIL-18誘導腫瘤特異性CTL的影響，在腫瘤抗原刺激的CCs中，加入不同濃度的rmIL-18，再加入抗IFN-γ單抗(5 μg/ml)，培養96 h，以50∶1的效靶比檢測IFN-γ對rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL產生的影響，結果表明(圖2)，加入抗IFN-γ單抗及對照單抗均對rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL產生過程無明顯影響，證明rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL的過程與IFN-γ的產生無關。

圖1 在體外培養系統中rmIL-18誘導的H22特異性CTL殺傷活性Fig.1 Effect of rmIL-18 on induction of tumor-specific CTL activity in coculture system

圖2 抗IFN-γ抗體對rmIL-18誘導H22特異性CTL的影響(E∶T=50∶1)Fig.2 Effect of anti-IFN-γ on rmIL-18 induced H22 tumor-specific CTL activity in coculture system(E∶T=50∶1)

圖3 不同途徑應用腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響Fig.3 Tumor diameters of mice after administration tumor-specific CTLs with different routes

2.3 不同途徑輸入腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度和生存時間的影響 將30只荷瘤小鼠隨機分成3組，分別在接種腫瘤后第10天開始，經腫瘤內或腹腔內輸入腫瘤特異性CTL，1×106100 μl/只，對照組經腹腔輸入生理鹽水，100 μl/只，隔1 d注射1次，共計10次。每周測量荷瘤小鼠腫瘤直徑，以觀察經不同途徑輸入腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響(圖3)。結果表明，無論是經腹腔或經腫瘤內輸入腫瘤特異性CTL，均能明顯抑制荷瘤小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)，但經腫瘤內輸入腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用明顯高于經腹腔輸入組(P<0.01)。進一步觀察不同途徑應用腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠生存時間的影響(圖4)。結果表明，不同途徑

圖4 不同途徑應用腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠生存時間的影響Fig.4 Survival of mice inoculated into flanks with H22 cells after immunotherapy with tumor-specific CTLs with different routes

圖5 不同劑量腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響Fig.5 Tumor diameters of mice after administration tumor-specific CTLs with different dosage

應用腫瘤特異性CTL均能延長荷瘤小鼠的生存時間(P<0.01)，對照組小鼠在45 d全部死亡。觀察60 d，應用腫瘤特異性CTL治療的荷瘤小鼠有半數以上存活，兩者無差異。

2.4 不同劑量腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響 將30只皮下接種1×106100 μl H22細胞的BALB/c小鼠隨機分成3組，分別在接種腫瘤后第10天開始腹腔內輸入rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL或生理鹽水(1×106/100 μl/只，1×107/100 μl/只，生理鹽水100 μl/只)，隔1 d輸入1次，共計10次。每周測量荷瘤小鼠腫瘤直徑，以觀察rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL對荷瘤小鼠腫瘤生長速度的影響(圖5)。結果表明，與對照組相比，腹腔內輸入rmIL-18誘導的腫瘤特異性CTL能明顯抑制荷瘤小鼠腫瘤生長速度(P<0.01)，并且隨輸入CTL的數量增多，這種抑制作用明顯增強(P<0.01)。

3 討論

肝癌嚴重威脅生命，雖然早期診治水平不斷提高，但預后仍然很差。隨著腫瘤生物治療的迅速發展，癌癥的免疫治療法已被認為是繼手術、放療、化療之后第四種療法。腫瘤的細胞因子治療是免疫治療的重要策略之一，越來越受到重視，已經是研究重點和臨床應用的典型療法[4]。

IL-18的抗腫瘤效應初期是由NK細胞介導的，IL-18是通過增強NK細胞的活性來表現其抗腫瘤效果的[5]。有研究發現經IL-18預處理過的荷瘤鼠均可存活，表明IL-18在體內有很強的抗腫瘤活性，且IL-18能相繼誘導NK細胞和CTL細胞的抗腫瘤作用[6，7]。IL-18處理后的荷瘤小鼠表現出免疫記憶功能，對再接種的腫瘤會有明顯的抵抗作用，這種抵抗作用是由細胞毒性CD4+細胞完成的[8]。IL-18亦可以誘導CTL細胞的產生，促進其成熟和增殖，有效殺傷腫瘤細胞，發揮抗腫瘤效果[9，10]。

在本實驗室以往的研究中，證實了IL-18首先通過增加NK細胞的活性作用，誘導快速有效的腫瘤殺傷作用，繼之使DCs成為有效的抗原提呈細胞,然后，引起強的由CD4+CTL 和CD8+CTL介導的特異性的抗腫瘤免疫反應[11-13]。在本文中我們應用rmIL-18和小鼠脾細胞純化的NK細胞、樹突狀細胞、T細胞結合的體外培養系統，在包括2‰經絲裂霉素處理的腫瘤細胞存在的情況下，培養96 h后，成功的誘導出腫瘤特異性CTL，建立了一種在體外快速有效的擴增腫瘤特異性CTL方法。隨后，我們觀察了在CCs中誘導出的H22特異性CTL在體內的抗腫瘤作用。經腫瘤內或腹腔內輸入腫瘤特異性CTL均能夠明顯抑制荷肝癌小鼠的腫瘤生長速度(P<0.01)及明顯延長荷瘤小鼠生存時間(P<0.01)，并且這種作用隨CTL細胞數量的增加而增強(P<0.01)。但腫瘤內輸入腫瘤特異性CTL抑制荷瘤小瘤的腫瘤生長速度優于腹腔內輸入，并且隨輸入CTL的數量增多，這種抑制作用明顯增強，此與CTL殺傷腫瘤細胞方式有關，而在延長荷瘤小鼠的生存時間方面兩者并無統計學意義差異。

綜上所述，通過IL-18在CCs中誘導的腫瘤特異性CTL均可以起到良好的殺傷腫瘤細胞的作用，本研究為腫瘤細胞因子免疫療法提供了實驗依據和研究方向。

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[收稿2016-01-04]

(編輯 許四平)

Experimental study of tumor-specific CTL induced by rmIL-18 treated on hepatocellular carcinoma

MIXu-Guang,LIULei，LIShou-Qing,WEIHai-Feng,XUShu-Fen,TANYan,FANGYan-Qiu.

JilinProvincePeople′sHospital,Changchun130021,China

Objective:To research rmIL-18 in vitro culture system CCs induce tumor-specific cytotoxic T lymphocytes CTL and anti-tumor effect in mice.Methods：Used Stem SepTMimmune magnetic cells separation method to culture mouse spleen NK cells,T cells and DCs,established culture systems in vitro;used of different approaches,different doses rmIL-18 to immunize HCC tumor-bearing mice,researched the effect of rmIL-18 on tumor growth rate and survival time.Results：rmIL-18 could induce and promote tumor-specific CTL-mediated killing effects in vitro culture system;tumor-specific CTL could significantly inhibit tumor growth(P<0.01) of and prolong the survival time of liver cancer tumor-bearing mice(P<0.01),and the effect was increased with rmIL-18 concentration increased(P<0.01),and intratumoral injection was superior to intraperitoneal injection(P<0.01).Conclusion：rmIL-18 can induce tumor-specific CTL in vitro and play a role in anti-liver cancer in mice.

CCs;rmIL-18;CTL;Anti-tumor

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.014

①本文受吉林省科技發展計劃項目(20140519018JH)、吉林省人社廳省人才開發基金(2016年度)和吉林省科技廳重點實驗室項目(20122113)資助。

米旭光(1983年-)，男，博士，助理研究員，主要從事腫瘤靶向治療的科研工作，E-mail:mixg699@163.com。

及指導教師：方艷秋(1968年-)，女，博士，教授，主要從事腫瘤免疫治療相關研究，E-mail:yq.fang@163.com。

R735.7

A

1000-484X(2017)04-0545-04