ATRA對小鼠的急性毒性與抗感染作用研究

任超，郁彪，李如杰，諸葛增玉，李留安，金天明

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ATRA對小鼠的急性毒性與抗感染作用研究

任超，郁彪，李如杰，諸葛增玉，李留安，金天明通信作者

（天津農學院動物科學與動物醫學學院，天津300384）

為研究全反式維甲酸（ATRA）對小鼠的急性毒性與抗感染作用，在ATRA急性毒性試驗中采用最大給藥量，記錄小鼠給藥7 d內的臨床癥狀，然后通過剖檢及病理組織學觀察研究ATRA的急性毒性。將大腸桿菌經口感染小鼠建立感染模型，記錄小鼠感染7 d內的臨床癥狀，通過剖檢和器官指數的測定來研究ATRA對小鼠的抗感染作用。結果表明，ATRA以最大給藥量（人用劑量500倍）灌胃沒有對小鼠造成明顯的異常反應，體重與對照組相比差異不顯著，剖檢和病理組織學觀察無可見病變。同時，口服高劑量ATRA的小鼠在感染后體重恢復效果好于低劑量組，口服ATRA的小鼠肝臟、腎臟、脾臟器官指數與對照組相比差異顯著。說明ATRA對小鼠無急性毒性，同時具有良好的促進肝臟、腎臟、脾臟生長發育，提高機體免疫力和抗感染效果，可應用于獸醫臨床治療以及疾病預防和控制。

ATRA；急性毒性；抗感染作用；小鼠；大腸桿菌

全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）是維生素Ａ的天然衍生物，也是體內一種重要的生物活性物質。研究表明，ATRA在胚胎發育、誘導正常分化、免疫功能的發揮等過程中起到重要調節作用[1]。Kaufman等研究表明，以維生素A缺乏或核視網膜酸受體雙敲除的小鼠為試驗組，免疫腺病毒活載體疫苗，與健康小鼠相比，試驗組小鼠的腸道免疫反應減弱。實際上，維生素A稍有不足就會顯著削弱疫苗在腸黏膜誘導的保護性免疫反應，而短期補充維生素A就可以完全恢復機體的腸道免疫力。可見ATRA在腸黏膜中發揮重要的作用，而且能夠促進效應性體液免疫反應和細胞免疫反應[2]。體內和體外試驗表明，ATRA 可以增強TH2 細胞的分化，抑制TH1 細胞的分化，是維生素A 最強有力的恢復抗體反應的代謝產物[3]。

本研究通過急性毒性試驗和抗感染試驗闡明ATRA對小鼠的急性毒性和抗細菌感染作用，探討其作用機制和保護效果，同時對不同劑量ATRA的抗感染作用展開研究，探討其濃度與抗感染作用效果的相關性，并為臨床應用和深入研究提供參考數據。

1 材料

1.1 試驗動物

昆明系小鼠60只，購自天津醫科大學實驗動物中心，雌雄各半，5～8 周齡，體重為（20±2）g，飼料充足，飲水不限，分籠飼養，室溫、濕度適宜。

1.2 主要試劑

ATRA購自美國Sigma公司。

1.3 菌株

大腸桿菌由天津農學院預防獸醫學實驗室保存。

2 方法

2.1 最大給藥量試驗

2.1.1 試驗動物分組與處理

小鼠適應性喂養3 d，隨機分為2組，每組10只，試驗組按照人用劑量的500倍（最大給藥量為0.75 g/kg）進行灌胃，ATRA以二甲基亞砜（DMSO）溶解，濃度為0.6 g/mL，0.25 mL/只，每隔6 h灌胃1次，共灌胃4次；對照組灌胃等量的DMSO。給藥后觀察7 d，記錄每日各組小鼠的體重及精神狀態、活動情況、皮毛光澤、食欲排泄、死亡等臨床癥狀。

2.1.2 剖檢與病理組織學觀察

7 d后剖檢，觀察各組小鼠的肝、脾、腎、心的病變情況，計算器官指數（各臟器重量與體重之比），采集各組小鼠的肝、脾、腎、心組織，用4%甲醛溶液進行固定。經過7 d的組織固定，將各組小鼠的臟器進行常規病理組織切片的制備與HE染色，光鏡下觀察各臟器的病理變化，“－”表示無病變，“＋”表示輕度損傷。

2.1.3 統計與分析

應用SPSS 11.5軟件對實驗數據進行統計分析處理，表格利用Excel軟件制作，以（±）表示。

2.2 抗感染試驗

2.2.1 試驗動物分組與處理

小鼠適應性喂養2 d，隨機分為4組，每組10只。1組、2組分別灌服ATRA溶液1 μmol/kg和5 μmol/kg，連續7 d，同時1、2組分別灌服等量的DMSO，記錄各組每日的體重變化。參考文獻[4]，7 d后，1組、2組、3組分別灌服大腸桿菌0.2 mL/只，1×108CFU/mL，第4組灌服等量的生理鹽水，觀察各組對大腸桿菌感染后的抵抗力和發病情況，記錄各組每日的體重變化。感染后，以3組出現精神沉郁、活動減少、體重下降、腹瀉為臨床檢測指標，在感染7 d后剖檢，觀察各組小鼠的器官病變情況，稱重并計算器官指數。

2.2.2 統計與分析

應用SPSS 11.5軟件對試驗數據進行統計分析處理，圖片利用Graphad Prism軟件繪制。

3 結果與分析

3.1 最大給藥量試驗

3.1.1 小鼠行為及體重變化

以人用劑量的500倍給藥（最大給藥量為0.75 g/kg）后，試驗組小鼠在給藥過程中，活動量減少；在給藥后7 d內，試驗組與對照組小鼠的精神、活動、食欲、排泄、皮毛等臨床癥狀均無異常，也無其他中毒反應。在給藥后7 d內，試驗組與對照組小鼠的體重均有增長，差異不顯著（見表1）。

表1 各組小鼠的體重（SD，n =10） g

表1 各組小鼠的體重（SD，n =10） g

組別第1天第3天第5天第7天 試驗組25.72±1.3427.56±1.9529.47±2.0531.96±2.11 對照組26.23±1.2527.92±2.1229.64±1.9432.32±2.08

3.1.2 病理剖檢觀察

給藥7 d后，剖檢小鼠的肝、脾、腎、心，試驗組與對照組相比，小鼠各臟器的形狀、大小與色澤均正常，未見病變情況。試驗組與對照組相比，小鼠的肝、脾、腎、心的器官指數差異不顯著（見表2）。

表2 各組小鼠的器官指數 %

3.1.3 病理組織學觀察

給藥7 d后試驗組與對照組相比，小鼠的肝、脾、腎、心的病理組織學觀察未見異常，差異不顯著（見表3）。

表3 各組小鼠器官病理學檢查結果

3.2 抗感染試驗

3.2.1 體重變化

由圖1可知，口服ATRA后，各組小鼠的體重呈顯著上升趨勢，各組體重差異不顯著。感染后，即試驗第8天，2組、3組、4組體重顯著下降，之后緩慢上升，其中第2組體重恢復效果好于第1組和3組。

圖1 體重的測定結果

3.2.2 器官指數

由圖2可知，各組肝臟指數1組與2組相比，差異顯著（＜0.05），說明高劑量ATRA能夠促進肝臟的生長發育；各組腎臟指數1組與3組相比，差異顯著（＜0.05），2組與3組相比，差異顯著（＜0.05），說明ATRA能夠促進腎臟的生長發育；各組脾臟指數1組與3組相比，差異極顯著（＜0.01），2組與3組相比，差異極顯著（＜0.01），說明ATRA能夠促進脾臟的生長發育，進而提高機體的免疫力。

圖2 器官指數的測定結果

4 討論

試驗中ATRA在以人用劑量的500倍給藥后未導致小鼠死亡，且小鼠均沒有表現出中毒反應，剖檢與病理組織學觀察顯示，各組小鼠的臟器均正常，表明ATRA的急性毒性較低，使用安全性良好。目前對于ATRA的臨床應用主要是抗腫瘤疾病與發育生物學相關領域[5-6]，與免疫相關的應用還有待進一步深入研究。

本試驗中，經大腸桿菌感染后，口服ATRA的小鼠與未服用的小鼠相比，其脾臟器官指數差異極顯著（見圖2），說明ATRA能夠促進免疫器官的生長發育，進而提高機體對抗大腸桿菌感染的能力；肝臟和腎臟器官指數也說明，ATRA能夠促進相關器官的生長發育，對抗感染免疫有重要調節作用。此外，體重的變化也說明ATRA能夠使機體更快地從細菌感染的情況中恢復。試驗第8天即大腸桿菌感染第一天，1～3組的小鼠體重均明顯下降，說明大腸桿菌經口感染會因胃腸道反應而使體重明顯下降，而從感染第2天開始，1～3組的體重開始緩慢回升，其中體重回升速度2組快于1組，1組快于3組，說明ATRA能夠幫助機體對抗腸道細菌感染，而且使用劑量以5 μmol/kg的效果要優于1 μmol/kg。研究表明，ATRA通過大量表達核視網膜酸受體產生信號，促進多種免疫細胞如先天性、適應性免疫細胞的發育和分化，從而增強系統性免疫應答[7]。ATRA在黏膜免疫反應中也發揮重要作用，促進皮膚和黏膜組織的內皮形成，能夠使歸巢到腸道和皮膚的淋巴細胞發生分化。因此，充足的ATRA對誘導T細胞表達腸歸巢受體十分必要。同時，小鼠和人也需要充足的ATRA來誘導sIgA分泌型細胞的產生。研究發現，維生素A缺乏的小鼠在小腸缺乏T細胞和sIgA分泌型細胞，并且不能誘導嗜腸T細胞的歸巢[8-10]。研究人員利用鼠傷寒沙門氏菌感染小鼠構建胃腸炎疾病模型，檢測體重、腸道重量、促炎性反應因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、IL-17、IFN-γ等），表明ATRA可以減輕鼠傷寒沙門氏菌對小鼠的致病性，增強機體的抗菌能力[11]，這與本次試驗的結果相吻合。綜上所述，ATRA能夠提高機體免疫力，其安全性良好，具有較為明顯的抗細菌感染作用，能夠作為潛在的免疫佐劑或是免疫增強劑，未來可在獸醫臨床治療以及疾病預防和控制中發揮重要作用。

[1] 王育盛，韓愈，楊劍，等. 全反式維甲酸對大鼠腸系膜動脈的舒張作用及其機制[J]. 中華高血壓雜志， 2013，21（2）：130-134.

[2] Kaufman D R，De Calisto J，Simmons N L，et al. Vitamin A Deficiency Impairs Vaccine-Elicited Gastrointestinal Immunity[J].，2011，187（4）：1877-1883.

[3] 喻三紅，夏明燦，王立新，等. 全反式維甲酸對基因免疫應答的調節作用[J]. 中華微生物學和免疫學雜志，2004，24（5）：337-340.

[4] 韓旭，徐玉，夏新智，等. 不同配比關系的丙酮酸乙酯復方混懸劑在細菌感染模型中的比較研究[J]. 中國畜牧獸醫，2014，41（9）：216-220.

[5] Shah N N， Stonecypher M， Gopal P，et al. Acute promyelocytic leukemia presenting as a paraspinal mass[J].，2016，14（3）：126-129.

[6] Tripathy S，Chapman J D，Han C Y，et al. All-Trans- Retinoic Acid Enhances Mitochondrial Function in Models of Human Liver[J].，2016，89（5）：560-574.

[7] Svensson M，Johansson-Linbom B，Zapata F，et al. Retinoic acid receptor signaling levels and antigen dose regulate gut homing receptor expression on CD8 T cells[J].，2008，1（1）：38-48.

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責任編輯：張愛婷

Acute Toxicity and Anti-infection Effect of ATRA in Mice

REN Chao, YU Biao, LI Ru-jie, ZHUGE Zeng-yu, LI Liu-an, JIN Tian-mingCorresponding Author

（College of Animal Science and Veterinary Medicine, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China）

In order to study the acute toxicity of all-trans retinoic acid（ATRA）and its anti-infection effect in mice, the maximum dosage was used in ATRA acute toxicity experiment, while the clinical symptoms of mice were recorded for 7 days. Then acute toxicity of ATRA was studied by autopsy and histopathology observation. The mice infection model was established by oral infection withto study the anti-infection effect of ATRA by recording the clinical symptoms, autopsy lesions and organ index of infected mice for 7 days. The results showed that the mice had not abnormal response and pathological changes in autopsy and histopathological observation compared to the control group in the maximum dosage of ATRA（500 times of the clinical dosage in human）. The weight was also of insignificant difference compared to the control group. At the same time, the high dose of ATRA in mice to regain the weight was better than the low dose group before infection with. Liver index, kidney index and spleen index by using ATRA were significantly different compared with control groups. ATRA had no acute toxicity in mice and was good for the growth of liver, kidney and spleen to improve the immunity and anti-infection effect, which can be used in clinical veterinary treatment and disease prevention and control.

ATRA; acute toxicity; anti-infection effect; mice;

1008-5394（2017）01-0019-04

S859.82

A

2016-04-03

天津農學院科技發展基金項目“ATRA對家禽免疫調節作用的研究”（2013N09）；天津農學院高校教師教育改革創新引導發展項目“建立創新創業實訓平臺，培養卓越畜牧獸醫人才”（20171003）；天津農學院實驗教學示范中心教學改革項目“基于TCRP教學模式的獸醫學實驗教學改革”（2015SY102）；天津市自然科學基金面上項目“斷奶日齡影響仔豬GH/IGF-I軸功能的分子機制研究”（13JCYBJC25300）

任超（1986-），女，天津市人，實驗師，碩士，研究方向為基礎獸醫學。E-mail：chaoren04050110@163.com。

金天明（1968- ），男，內蒙古通遼人，教授，博士，研究方向為基礎獸醫學。E-mail：jtm680@163.com。