不同預處理方法對玉米秸稈酶解性能的影響

田慶文，房桂干,3*，沈葵忠,3，劉雯雯，梁龍

(1.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室，南京210042； 2.南京林業大學林業資源高效加工利用協同創新中心，南京210037； 3.中國林業科學研究院林業新技術研究所，北京100091)

不同預處理方法對玉米秸稈酶解性能的影響

田慶文1,2，房桂干1,2,3*，沈葵忠1,2,3，劉雯雯1,2，梁龍1,2

(1.中國林業科學研究院林產化學工業研究所，國家林業局林產化學工程重點開放性實驗室，南京210042； 2.南京林業大學林業資源高效加工利用協同創新中心，南京210037； 3.中國林業科學研究院林業新技術研究所，北京100091)

研究了NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3等4種化學聯合盤磨預處理方法對玉米秸稈酶解性能的影響，考察了不同預處理方法對物料得率、木質素脫除率、還原糖得率、聚糖轉化率和結晶度的影響。結果表明，預處理后，玉米秸稈的結晶度均降低。機械盤磨可以減小纖維長度和顆粒尺寸，增大比表面積，暴露出更多的纖維素活性位點，增加纖維素和纖維素酶的反應活性，提高其酶解性能。確定了酶解適宜的條件：纖維素酶用量30 U/g，β-葡萄糖苷酶用量10 U/g，酶解溫度50℃和時間72 h，在此條件下NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3聯合盤磨預處理后玉米秸稈的還原糖得率分別為41.00%，23.02%，65.77%和22.22%，聚糖轉化率分別為39.04%，18.53%，70.49%和21.33% 。在最優條件下，NH3·H2O聯合盤磨預處理玉米秸稈的還原糖得率和聚糖轉化率最高，是一種具有前景的預處理方法。

預處理；玉米秸稈；酶解；還原糖得率；聚糖轉化率

當今社會，人類面臨嚴峻的環境污染、能源匱乏和資源短缺等問題。越來越多的國家積極探索新能源，來替代日益枯竭的化石燃料等能源[1-2]。木質纖維素生物質資源儲量豐富，通過適當預處理方法轉化為低聚糖或可發酵糖，制備燃料乙醇或平臺化學品等高附加值產品，可以減少人類對化石資源的依賴，減輕對環境的污染破壞[3-6]。在我國，玉米秸稈作為一類可再生資料，含量豐富，來源廣泛且價格低廉，因此將其轉變成高附加值的糖類和相關化學品十分必要[7]。然而，玉米秸稈中纖維素結晶度比較高，且木質素和半纖維素填充在纖維和細微纖維之間，使得纖維素和纖維素酶的接觸困難，從而導致酶解效果較差[7-9]。因此，需要對木質纖維素類原料進行預處理。

目前，提高木質纖維類原料酶解效果的預處理方法有稀酸預處理、堿預處理法、氫氧化鈣預處理、氨浸漬預處理和SPORL法等[10-13]。堿預處理法能夠有效降低木質纖維素生物質的木質素含量，提高碳水化合物酶水解的速率和得率[14]。石灰法預處理條件不如NaOH和氨激烈，但具有操作簡單、成本低的優點，使其成為一種有吸引力的預處理方法[15]。氨浸漬法(SAA)是為了解決ARP工藝中半纖維素損失問題，將半纖維素以固體形式保留，可以進行同步發酵，避免了將含量較少的低聚糖單獨轉化為期望產品的難題[16]。SPORL方法是一種在酸性條件用少量亞硫酸鹽化學品聯合盤磨機械處理方法，可以克服木材中木質素對酶解的抗逆性，實現針葉木的高效生物轉化[17]。

本研究采用NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO34種化學聯合盤磨方法預處理玉米秸稈，在相同的反應條件下比較4種化學方法對玉米秸稈的物料得率和木質素的脫除率的差異；此外，通過優化反應因素(溫度、時間和纖維素酶用量)對NaOH預處理后玉米秸稈酶解還原糖得率的影響，考察4種不同預處理方法對還原糖得率、酶解還原糖得率、聚糖轉化率及結晶度的影響，以期為木質纖維素類物料的預處理工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及儀器

玉米秸稈來自山東，運至南京實驗室。5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、苯酚、葡萄糖等藥品購于國藥集團化學試劑公司，均為分析純。纖維素酶(Celluclast 1.5 L, Novozymes公司)和纖維二糖酶(Novozyme 188，Novozymes公司)。

MSD擠壓破碎機(Andritz-Sprout-Bauer公司)；蒸煮鍋(西北輕工業學院機械廠)；紫外分光光度計(UV-3100，Shimadzu公司)；X射線衍射儀(D8，Bruker)。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理與保存

運輸至實驗室的玉米秸稈，洗凈后直接進行MSD擠壓切碎，然后裝于黑色塑料袋中，放于冷庫保存。玉米秸稈的組分如表1所示。

表1 玉米秸稈的主要成分

1.2.2 測定方法

1)NaOH預處理玉米秸稈

稱取1 200 g上述絕干玉米秸稈，將其放置在15 L的蒸煮罐中，并加入一定量的NaOH溶液和水，保持固液比為1∶4(m/V)，其中NaOH的用量為10%。將蒸煮罐放入蒸煮鍋中進行加熱，130℃保溫60 min。反應結束后將預處理后的玉米秸稈多次洗滌、甩干后攪散裝入聚氯乙烯塑料袋密封，0～5℃冷藏保存備用。

2)氨水、氫氧化鈣和NaHSO3預處理玉米秸稈

氨水、氫氧化鈣、NaHSO3方法預處理玉米秸稈的實驗過程和步驟與上述NaOH預處理方法基本一致。其中，氨水、氫氧化鈣、H2SO4和NaHSO3用量分別為10%，10%，2%和8%。

經上述NaOH、氨水、氫氧化鈣和NaHSO3(2% H2SO4/8% NaHSO3)法預處理的玉米秸稈原料分別進行盤磨處理，其中，進料速度為800 r/min，盤磨間隙0.6～2.0 mm。盤磨處理后的物料分別置于聚氯乙烯塑料袋密封，分別命名為AP、SAP、LP和SPORL，0～5℃冷藏保存備用。

3)纖維素酶解

玉米秸稈纖維素酶解實驗方法參照Huo等[18]。其中，還原糖得率計算方法為：

式中：YR為還原糖得率，%；M1為預處理后物料絕干質量，g；V為水解液總體積，L；n為測定還原糖濃度時稀釋的倍數；C為還原糖質量濃度，g/L。

聚糖轉化率計算方法為：

式中：YC為聚糖轉化率，%；y為預處理后物料得率，%；YR為還原糖得率，%；YT為還原糖的理論得率，%(針對纖維素水解得到葡萄糖時YT=111.1%，針對戊糖水解得到木糖時YT=113.6%，YT根據試料中葡萄糖和木糖的比例進行取值)；yc為原料中的聚糖含量，%，本研究中玉米秸稈聚糖含量為原料中纖維素含量和戊糖含量，為59.89%。

1.3 分析方法

1.3.1 木質素的脫除率

原料和預處理后物料的酸不溶木質素、酸溶木質素和糖組分分析按照NREL方法進行分析[19-20]。木質素脫除率計算方法為：

式中：RL為預處理木質素脫除率，%；L1為原料中總木質素的含量，%；L2為預處理后物料總木質素含量(基于原料計算)，%。

1.3.2 結晶度分析

玉米秸稈原料和預處理后物料真空干燥后，研磨125～180 μm，采用X射線衍射儀測定物料衍射強度，結晶度計算公式為[21]：

式中：ICr為結晶度指數，%；I002為002晶面的最大衍射強度，2θ=22°附近的極大峰值；Iam為非結晶背景衍射的散射強度，2θ=18°附近的峰谷值。

2 結果與分析

2.1 4種預處理方法對木質素脫除率和物料得率的影響

預處理后玉米秸稈質量減少，主要是因為玉米秸稈在預處理過程中損失了部分溶解性物質，這些溶解性物質主要包括木質素、半纖維素和其他可溶性物質。從表2可以看出，4種化學處理條件較為溫和，只有部分木質素和半纖維素溶出，4種預處理方法的得率均較高[10,22]。不同預處理方法物料的木質素溶出程度存在較大差異，NaHSO3和NaOH預處理方法在木質素脫除方面具有明顯的優勢，而Ca(OH)2預處理后的玉米秸稈木質素脫除率非常低。

表2 4種預處理方法對木質素脫除率和物料得率的影響

注：表中木質素含量為基于原料計算所得。

2.2 反應因素對NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響

2.2.1 纖維素酶用量對玉米秸稈還原糖得率的影響

纖維素酶用量直接影響玉米秸稈酶解性能。實驗中采用NaOH預處理后的玉米秸稈，探究了纖維素酶用量對還原糖得率的影響，結果如圖1所示。實驗條件為：固液比1∶40(m/V)，酶解溫度50℃，時間24 h，纖維二糖酶用量10 U/g(即1 g絕干物料需10 U的纖維二糖酶，U為纖維二糖酶活力單位，在1 min內將1 μmol纖維素二糖轉化為2 μmol葡萄糖所用的酶量為一個β-葡萄糖苷酶活力單位)。

圖1 纖維素酶用量對NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響Fig. 1 Effect of enzyme loading on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

由圖1可知，隨著纖維素酶用量的增加，還原糖得率也隨之逐漸增加，且還原糖得率比較低。當纖維素酶用量低于30 U/g(即1 g絕干物料需30 U纖維素酶，U為纖維素酶活力單位,1 mL液體酶在50℃，指定酸性纖維素酶pH為4.8條件下，每小時由濾紙底物生成1 μmol葡萄糖所用的酶量為一個纖維素酶活力單位)時，隨著酶用量的增加，還原糖得率迅速增加；當酶用量高于30 U/g時，隨著酶用量的增加，還原糖得率稍有增加。這可能是由于酶解過程中，纖維素酶分子首先吸附到纖維素表面，反應生成還原糖，在固液比一定的情況下，底物中可酶解部分含量會逐漸減少，還原糖得率會逐漸接近某一極限值。因此當底物濃度一定時，纖維素酶充分吸附到纖維素表面，繼續增加纖維素酶量時，還原糖的酶解轉化率不能顯著提高。

2.2.2 酶解時間對玉米秸稈還原糖得率的影響

試驗探究了反應時間對于NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響，結果如圖2所示。其中反應條件為：固液比1∶40(m/V)，酶解溫度50℃，纖維素酶用量為30 U/g和纖維二糖酶用量10 U/g。由圖2可以看出，隨著反應時間增加，還原糖得率呈上升趨勢且不斷增大。在反應時間較短的初始階段，還原糖得率增加較為明顯，隨著時間的延長(≥72 h)，還原糖得率上升趨勢逐漸減小并趨于平穩。這可能是因為在反應剛開始時，纖維素酶與底物接觸吸附較為充分，反應速率較快，隨著反應的進行，無定形區纖維素基本水解完成。因此，纖維素酶的水解反應控制在72 h左右比較合適。

圖2 反應時間對NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響Fig. 2 Effect of reaction time on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

2.2.3 酶解溫度對玉米秸稈還原糖得率的影響

纖維素酶作為一種特殊的蛋白質，其理化性質和生物活性與溫度密切相關。圖3為溫度對NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響，其中實驗條件：固液比1∶40(m/V)，時間72 h，纖維素酶用量30 U/g和纖維二糖酶用量10 U/g。由圖3可知，當溫度低于50℃還原糖得率增加，之后隨著溫度的升高還原糖得率又開始下降。這主要是由于溫度變化會影響纖維素酶的活性，溫度升高可以激活纖維素酶的活性，但是溫度繼續升高時，蛋白質發生變性，從而使得纖維素酶失去活性。因此，50℃是纖維素酶活性的最佳溫度，此時玉米秸稈的酶解效果較好。

圖3 溫度對NaOH預處理玉米秸稈酶解還原糖得率的影響Fig. 3 Effect of reaction temperature on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by NaOH

2.3 不同預處理方法及盤磨前后對酶解還原糖得率的影響

圖4 不同方法預處理玉米秸稈盤磨前后對酶解還原糖得率的影響Fig. 4 Effect of before and after refining on the reducing sugar yield of corn stover pretreated by different pretreatment methods

為了進一步探究不同預處理方法對玉米秸稈酶解性能的影響，分別對不同預處理方法及盤磨前后的玉米秸稈進行了酶解實驗，其還原糖得率如圖4所示，其中實驗條件為：固液比1∶40(m/V)，時間72 h，溫度50℃，纖維素酶用量30 U/g，纖維二糖酶用量10 U/g。由圖4可知，不同預處理方法物料的木質素溶出程度存在較大差異，還原糖得率也存在較大差異。從表2可知，雖然NaOH法與NaHSO3法木質素溶出程度接近，但兩者還原糖得率存在較大差異，說明木質素溶出量并不是影響物料酶解效率的唯一因素，還可能與其他因素有關，例如細胞壁中木質素的溶出位置有關[23]。4種化學預處理中，NH3·H2O預處理的物料中木質素溶出量不大，比NaOH法和NaHSO3法低30%以上，但在相同酶水解條件下，還原糖得率高達54.13%，比NaOH預處理方法高31.91%，這可能與氨水預處理的特殊作用有關，氨水可以實現一定的木質素溶出效果。氨水對木質纖維素生物質的滲透和潤脹作用較強，水解時纖維素酶能夠更好地與纖維素接觸[24-25]。

此外，4種方法預處理后的玉米秸稈經盤磨后還原糖得率均高于盤磨前的玉米秸稈。NaOH聯合盤磨后的玉米秸稈的還原糖得率為41.00%，相比于盤磨前提高了17.78%；Ca(OH)2預處理后的玉米秸稈經盤磨后，其還原糖得率從16.87%升高至23.02%；盤磨后NH3·H2O處理的玉米秸稈還原糖得率提高了11.64%；SPORL處理后的玉米秸稈，還原糖得率為22.22%，提高了4.04%。這主要是由于玉米秸稈經盤磨后，其纖維長度和顆粒尺寸均減小，比表面積增大，暴露出更多的纖維素活性位點，從而有利于纖維素酶充分吸附到纖維素表面，使得還原糖含量增高[26]。

2.4 不同預處理方法對聚糖轉化率的影響

4種化學聯合盤磨預處理方法對玉米秸稈聚糖轉化率的影響如圖5所示。聚糖轉化率是從物料得率和還原糖得率兩個指標來綜合評價預處理的效果。從圖5可以看出物料經盤磨后，NH3·H2O盤磨預處理的物料聚糖轉化率最高，為70.49%；NaOH預處理的聚糖轉化率為39.04%；SPORL預處理的聚糖轉化率為21.33%，Ca(OH)2盤磨預處理的聚糖轉化率最低，為18.53%。綜合比較這4種預處理方法可以看出，NH3·H2O聯合盤磨預處理法是一種有前景的預處理方法。

2.5 不同預處理方法對結晶度的影響

木質纖維原料的結晶度反映的是結晶纖維素所占的比例，通常被認為是影響酶解的重要原因。本試驗采用X射線衍射法探究了原料和4種不同化學聯合盤磨預處理方法對于玉米秸稈結晶度的影響，其結果如圖6和表3所示。玉米秸稈預處理前后XRD和結晶指數分析結果表明，玉米秸稈預處理前后結晶度指數均減小，但纖維素的晶型沒有變化，這主要是由于木質素和半纖維素溶出較少，在潤脹和盤磨作用下，結晶度指數下降。預處理后結晶指數減小，說明在化學預處理聯合盤磨過程中原料的結晶結構得到了破壞。纖維在堿性條件下得到了充分的潤脹，體積膨大，然后在盤磨機的擠壓和碾磨作用下細胞結構進一步被破壞，因而結晶結構也會得到一定程度的破壞[27]。

圖6 原料與化學聯合盤磨預處理后物料的X射線衍射圖Fig. 6 The XRD patterns of raw and pretreated materials

預處理種類預處理方法結晶度指數/%原料-3140化學+盤磨NaOH+盤磨(AP)2423Ca(OH)2+盤磨(LP)1248NH3·H2O+盤磨(SAP)1870NaHSO3+盤磨(SPORL)2022

3 結 論

1)玉米秸稈采用4種溫和的化學預處理(NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3)物料得率均較高，得率范圍為64%～74%，NaOH和NaHSO3預處理法木質素的脫除率比較高。

2)NaOH預處理玉米秸稈酶解效果最佳條件為：纖維素酶用量30 U/g，β-葡萄糖苷酶用量10 U/g，酶解溫度50℃和時間72 h。在此條件下，NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3聯合磨盤預處理后的玉米秸稈酶解的還原糖得率分別為41.00%，23.02%，65.77%和22.22%。

3)預處理的玉米秸稈經過機械盤磨后可以降低纖維尺寸，增加纖維素酶和纖維素的接觸面積，從而提高還原糖得率，且預處理后物料的結晶度降低。NaOH、Ca(OH)2、NH3·H2O和NaHSO3預處理玉米秸稈經盤磨后，還原糖得率提高了17.78%，6.15%，11.64%和4.04%，聚糖轉化率分別為39.04%，18.53%，70.49%和21.33%。

4)氨水預處理后的玉米秸稈，酶解效果最佳，物料得率、還原糖得率和聚糖轉化率都比較高，分別為72.12%，65.77%和70.49%。NH3·H2O預處理法是一種有前景的預處理方法，對于木質纖維素類資源的有效利用具有重要的作用。

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Effect of different pretreatments on the enzymolysis propertiesof corn stalk

TIAN Qingwen1,2, FANG Guigan1,2,3*, SHEN Kuizhong1,2,3, LIU Wenwen1,2, LIANG Long1,2

(1. Institute of Chemical Industry of Forestry Products,CAF, National Engineering Lab. for Biomass Chemical Utilization, Key Lab. of Forest Chemical Engineering,SFA, Key Lab. of Biomass Energy and Material, Nanjing 210042, China; 2. Collaborative Innovation Center for High Efficient Processing and Utilization of Forestry Resources, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 3. Institute of New Technology of Forestry, CAF, Beijing 100091, China)

The effects of different chemical pretreatment methods with NaOH, Ca(OH)2, NH3·H2O and NaHSO3associated with mechanical refining on the enzymatic hydrolysis of corn stalk were evaluated. The solid yield, delignification rate, reducing sugars yield, polysaccharide conversion and crystallinity of the corn stalk resulted from the four aforementioned pretreatment methods were compared. The crystallinity of the corn stalk decreased after the four pretreatments, indicating that the crystal structure of the raw materials was damaged to a certain extent during the chemical pretreatment combined with the grinding process. The length of the fibers and size of the corn stalk particles all decreased while the specific surface area increased after the mechanical disk grinding. More active sites of the cellulose were exposed after the pretreatment, resulting in more adequate contact between cellulose and cellulase, and therefore enhancing the efficiency of the enzymatic process. The optimum enzymatic performance of cellulose was obtained at 50℃ for 72 h with the cellulase and glucosidase doses of 30 U/g and 10 U/g, respectively. Under the optimal condition, the reducing sugars yields of corn stalk from pretreatment by NaOH, Ca(OH)2, NH3·H2O and NaHSO3associated with mechanical refining were 41.00%, 23.02%, 65.77% and 22.22%, and the polysaccharide conversions were 39.04%, 18.53%,70.49% and 21.33%, respectively. Furthermore, the reducing sugars yield of corn stalk also increased after mechanical refining. Corn stalk pretreated by NH3·H2O with mechanical refiner gave the highest reducing sugar yield and polysaccharide conversion.

pretreatment; corn stalk; enzymolysis; reducing sugars yield; polysaccharide conversion

2016-08-09

2016-10-11

“十二五”國家科技支撐計劃課題(2014BAD02B02)。

田慶文，男，實習研究員，研究方向為生物質預處理技術及環境保護技術。通信作者：房桂干，男，研究員。E-mail: fangguigan@icifp.cn

TQ401

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2096-1359(2017)02-0089-06