槌果藤乙醇提純物保護釀酒酵母免受氧化損傷機制研究

張 鵬，王向星，楊雅萍，李士明，趙 輝，駱焱平,*

槌果藤乙醇提純物保護釀酒酵母免受氧化損傷機制研究

張 鵬1，王向星2，楊雅萍2，李士明3，趙 輝2，駱焱平1,*

在生物體內，由于抗氧化物缺少而無法及時有效地清除過多的活性氧（reactive oxygen species，ROS）時，會對機體造成嚴重的氧化損傷。在氧化應激過程中，不斷增長的ROS水平會損傷特定的分子靶標，導致細胞或組織受損。越來越多的研究表明，氧化應激與很多疾病的致病機理相關，如糖尿病、心腦血管疾病、腫瘤和認知障礙等[1-4]。清除體內過多的自由基對于維持機體結構和功能的穩定具有重要的意義。釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為常用的真核模式生物，由于其生命周期短，基因組小而且基因信息明確，在一些人類遺傳性疾病相關基因和疾病機理的研究中發揮了重要作用，如糖尿病和神經退化性疾病等[5-6]。近年來，許多植物來源的食物或者藥物被認為有較強的抗氧化功能，原因可能跟這些植物所含的天然抗氧化產物相關。而基于釀酒酵母篩選天然抗氧化物的模型已經被建立起來，并且展現出較高的實用價值。

槌果藤（Capparis zeylanica Linn，CZ），在海南又被稱為“牛眼睛”，屬于白菜花科槌果藤屬，主要生長于南亞的斯里蘭卡、印度和中國海南省等地[7]。在印度，槌果藤不僅被當地人民當作傳統的調味品沿用至今[8]，而且被廣泛應用于抗衰老，治療哮喘、炎癥、痛風和風濕等疾病[8-10]。藥理學研究表明，槌果藤含有重要的天然活性成分，在傳統中醫中廣泛應用于抗炎、治療感冒和記憶減退等相關疾病[8,11]，然而大量食用槌果藤果實會對機體造成一定傷害，甚至中毒。槌果藤植株不同部位的有效成分呈現出較大的差異。研究人員從整株植物提取物中分離出皂苷、丁香、香豆酸、阿魏酸和羥基酸等；而葉和果實中分離包含香豆脂醇、胡蘿卜素、硫苷和糖苷等[9-10]。白菜花科的多個種植物已經應用在多種疾病的治療上[12]，但是直接指明槌果藤作用機制的報道相對匱乏。在嚙齒類動物模型上的研究表明槌果藤具有免疫調節活性[13]，能夠提高空間學習和記憶力[10]，并且能夠抑制乙醇誘導的胃潰瘍[14]。綜合以上研究，推斷這些保護作用與槌果藤提取物中所含的抗氧化活性物質有關。但是，到目前為止還鮮有研究表明CZ對氧化應激細胞的保護作用。目前關于槌果藤提取物抗氧化活性的檢驗，主要集中在體外自由基（（1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基等）清除，這雖然一定程度上能說明提取物具有體外自由基清除活性，但是無法解釋CZ在細胞內的作用機制。

本實驗通過研究S.cerevisiae野生型及其同源性基因缺陷型菌株Sod1、Ctt1、Gsh1、Gtt1和Gtt2在氧化應激狀態下存活率、脂質過氧化和細胞內氧化水平，初步探索CZ的抗氧化作用機制，為進一步研究這些活性物質和后續的功能食品、保健品開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生型（WT）Saccharomyces cerevisiae BY4741（MATa、his3、leu2、met15和ura3）購自德國Euroscarf公司，其同源性基因缺陷型菌株Sod1、Ctt1、Gsh1、Gtt1和Gtt2由巴西南卡希亞斯大學的教授D. Pereira贈送。（Sod1編碼細胞質超氧化物歧化酶；Ctt1編碼過氧化氫酶T；Gsh1編碼谷胱甘肽；Gtt1和Gtt2是編碼谷胱甘肽硫轉移酶的同工酶）。

瓊脂粉 北京奧博星生物技術有限責任公司；LP0021酵母提取物 英國Oxoid公司；蛋白胨、D-葡萄糖 美國Amresco公司；酸洗玻璃微珠 北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸（分析純） 成都市科龍化工試劑廠；蘆丁、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、抗壞血酸（VC）、2,6-二叔丁基對甲苯酚（2,6-ditertbutyl-p-cresol，BHT）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、H2O2、CCl4、CdSO4等其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

P300超微量分光光度計 德國Implen公司；Legend micro 17R離心機 美國Thermo公司；SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺、BLB-1000潔凈工作臺 蘇凈集團·蘇州安泰空氣技術有限公司；HK-180不銹鋼萬能粉碎機 廣州旭朗機械設備有限公司；TissuePrep細胞破碎儀 拜普諾國際有限公司；SpectraMax M5多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司。

1.3 方法

1.3.1 槌果藤樣品的制備

整株槌果藤采自海南五指山熱帶雨林，由海南大學龍文興教授鑒定。整株粉碎后，收集500 g，室溫條件下用4 L無水乙醇分別浸泡3、5、8 d。收集浸提液，離心去沉淀，再抽濾離心后的濾液。將所得到的濾液收集，50 ℃真空旋轉蒸發濃縮樣品。收集濃縮液，加蒸餾水稀釋濃縮液，然后過AB-8大孔樹脂，使用無水乙醇洗脫，得到洗脫液，冷凍干燥，得到槌果藤乙醇提純物（alcoholic extract of CZ，AECZ）10.7 g。取0.5 g樣品，溶于5 mL無水乙醇，得到100 mg/mL的母液。

1.3.2 總黃酮含量的測定

提純樣品的總黃酮含量測定采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH比色法[15]，以蘆丁作為標準品。將AECZ稀釋至1 mg/mL，測定稀釋液總黃酮含量，結果以每毫克樣品所含蘆丁等價物來表示。

1.3.3 DPPH自由基清除能力的測定

參考楊云舒等[16]的方法進行測定，使用VC溶液作為對照樣品溶液。

1.3.4 羥自由基清除能力的測定

參考劉駿[17]的結晶紫分光光度法檢測AECZ的羥自由基清除能力，VC作為對照樣品。

1.3.5 AECZ對氧化應激脅迫條件下酵母細胞存活率的影響

通過平板涂布法測定S. cerevisiae的存活率來檢測AECZ對氧化應激狀態下細胞耐受性的影響[18]。選取擴增培養3 d的單酵母菌落接種于液體YPD培養基中，28 ℃、200 r/min搖床過夜培養。用無菌水調細胞懸浮液OD600nm=1。取1 mL細胞懸液轉移至9 mL含有不同質量濃度樣品（40、80 μg/mL）的新鮮液體YPD培養基中，渦旋振蕩15 s后，28 ℃、200 r/min搖床培養2 h。然后，在培養液中分別加入H2O2、CCl4和CdSO4，使其終濃度分別達到2.0、10.0、2.5 mmol/L。渦旋振蕩15 s后，搖床培養1 h。取各處理的酵母細胞懸液，分別稀釋1 000 倍，取100 μL稀釋后的細胞懸液均勻涂布在固體YPD培養基中。放置于生化培養箱中，28 ℃倒置培養72 h。計數菌落個數，每個處理方法做3 個平行。

1.3.6 AECZ對酵母細胞脂質過氧化水平的影響

采用硫代巴比妥酸（thiobarbituri acid，TBA）法[18]測定脂質過氧化水平。

1.3.7 AECZ對酵母細胞細胞內氧化水平的影響

參考de Sá等[19]的方法，通過2’7’-二氯二乙酸酯熒光探針法測定酵母細胞內過氧化水平。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 AECZ樣品中總黃酮含量

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH分光光度法測定AECZ樣品的總黃酮含量，蘆丁含量標準曲線為：y=0.009 8x+ 0.060 5，R2=0.998。AECZ樣品的吸光度為0.55，相當于每毫克樣品含有44.95 μg蘆丁，既每克槌果藤材料中總黃酮含量為0.962 mg。

2.2 DPPH自由基和羥自由基清除能力

圖1 AECZ清除DPPH自由基（A）和羥自由基（B）的能力Fig. 1 DPPH (A) and hydroxyl (B) radical scavenging capacity of AECZ

DPPH自由基清除法是目前廣泛使用的一種測定生物樣品體外抗氧化能力的方法[20-21]。AECZ和VC兩種樣品清除DPPH自由基活性如圖1A所示。AECZ對DPPH自由基清除活性隨著AECZ質量濃度的增加而增加，當質量濃度都為1 000 μg/mL時，AECZ對DPPH自由基的清除能力大約相當于VC質量濃度為50 μg/mL時的清除效果，由此可見AECZ的對DPPH自由基的清除能力低于VC。與之相反，AECZ在羥自由基的清除實驗中展現出強勁的清除能力，如圖1B所示，在質量濃度為100 μg/mL時，清除率達到46%，而VC對羥自由基的清除能力（8%）遠遠低于AECZ；在AECZ質量濃度達到400 μg/mL時，清除率幾乎接近100%，而VC則僅40%左右。AECZ對于羥自由基的高清除率可能與羥自由基對AECZ所含的成分的敏感度有關。有研究對比了不同黃酮類化合物清除羥自由基的活性，結果表明不同的黃酮類化合物對羥自由基的清除率差異很大[20,22]。如兒茶素、蘆丁和桑黃素對羥自由基的清敏感性很高，而羥基黃酮、橙皮素、黃岑苷和柚皮苷等對羥自由基的敏感性則較低，進而清除率也較低[23-24]。AECZ展現出較高的清除率，說明AECZ中含有對羥自由基較敏感的黃酮、多酚或者皂苷類化合物，這需要分離和提純后，做進一步的研究。

2.3 AECZ提高酵母菌對氧化應激的耐受性

實驗采用模式生物釀酒酵母檢驗AECZ體內抗氧化活性。釀酒酵母已經成為一種成熟的評價天然產物體內抗氧化的模式生物[25]。為了更全面地評價AECZ的細胞保護作用，實驗采用肝毒素CCl4、CdSO4（環境致癌物重金屬鎘）和H2O2。

圖2 AECZ對氧化應激條件下酵母菌存活率的影響Fig. 2 Effect of AECZ on survival rates of yeast cells under oxidative stress conditions

本實驗結果與之前研究者報道結果類似，H2O2對釀酒酵母產生的毒性是最強的，接著是CCl4和CdSO4[20]。此外，所有測試菌株對AECZ均表現出不同程度的“劑量依賴性”，隨著AECZ質量濃度的增高，各菌株存活率表現出不同程度的增加。H2O2在細胞內產生高活性、強破壞力的羥自由基，而羥自由基是內源性細胞有毒物質，所以即使AECZ前處理不同程度地提高了酵母細胞對H2O2的耐受性，但是其存活率還是低于CCl4和CdSO4處理組。如圖2A所示，在H2O2處理組中，AECZ質量濃度為40 μg/mL時，對Gtt1突變株（Gtt1）的存活率與直接應激組相比提高不明顯；當AECZ質量濃度達到80 μg/mL時才較明顯提高Gtt1突變株（Gtt1）的存活率，但仍低于其他菌株類型，這說明Gtt1（谷胱甘肽轉移酶）在AECZ抵抗細胞內H2O2應激時發揮一定作用。而Gtt1在谷胱甘肽循環中扮演重要的角色[26]，AECZ有可能通過刺激Gtt1的表達，進而提高谷胱甘肽作用效率。

與H2O2應激不同，CCl4應激對各株酵母的氧化損失較輕。相比其他菌株，只有Sod1和Gsh1菌株對CCl4應激耐受性高一些，當AECZ質量濃度達到80 μg/mL時，該兩菌株存活率高于其他變異菌株（圖2B）。同時，AECZ預處理能明顯提高各株酵母對CdSO4應激的耐受性（圖2C）。數據表明Gtt1基因缺失型對CdSO4應激相對敏感，雖然AECZ能改善其對與Cd2+的耐受性，但是提高的存活率遠遠低于其他菌株類型?？梢奊tt1基因在AECZ提高酵母細胞對重金屬Cd2+的耐受性機制中同樣發揮重要作用。有研究表明，Gtt1基因突變株酵母相比于WT型酵母會攝入更多的Cd2+[27]，換言之，Cd2+對于Gtt1型酵母毒性相比WT要高，這與CdSO4直接應激后，Gtt1型酵母的存活率最低相一致。對于Gtt1基因，它參與形成GSH-Cd2+復合物，這是減弱重金屬鎘毒性最重要的一步；有研究同樣表明Gtt2基因在Cd2+解毒中同樣發揮作用，其機制更為復雜，它不能直接降低細胞對于Cd2+的吸收，有可能與γ-谷氨酰轉肽酶（γ-glutamyl transferase）協同作用清除Cd2+[28]，然而本實驗中的數據還不能說明這一點，具體原因還需進一步研究。

2.4 AECZ對酵母脂質過氧化水平和細胞內氧化水平的影響

機體內過多的自由基會攻擊細胞內的大分子，如蛋白、脂質和核酸等。自由基氧化膜脂發生脂質過氧化反應，產生丙二醛（malondialdehyde，MDA）。MDA含有一個活性很高的醛基（高活性的親電基團），容易導致細胞內蛋白交聯，進一步產生嚴重的細胞毒性，通常MDA作為評價機體內氧化應激（脂質過氧化）的標志物[29]。CCl4、H2O2和CdSO4在細胞內會誘導產生自由基，增加了WT、Sod1和Ctt1型酵母細胞的脂質過氧化水平，而且AECZ展現出對生物膜脂質氧化應激不同程度的保護作用。數據表明，H2O2對各株酵母細胞造成的脂質過氧化損傷是最高的，這與H2O2應激條件下酵母細胞存活率最低相一致。

與直接應激組相比，AECZ前處理會明顯地減輕酵母細胞內的脂質過氧化水平。 在H2O2處理組中，AECZ處理能顯著地降低H2O2應激WT酵母的脂質過氧化水平（從300%降至190%）。 CCl4和CdSO4直接應激提高了WT酵母細胞的脂質過氧化水平（分別為160%和130%），這明顯低于H2O2應激產生的脂質過氧化水平，這與CCl4和CdSO4應激組的高存活率相對應。Ctt1或Sod1突變株似乎對于CCl4或H2O2應激更敏感。相比于CCl4和H2O2應激產生的MDA，Cd2+應激產生的MDA水平低很多（表1）。

表1 AECZ對菌株過氧化水平（MDA含量）的影響Table 1 Effect of AECZ on lipid peroxidation levels (in terms of MDA contents)

AECZ展現出一定的體外自由基清除活性，并且能顯著地提高氧化應激狀態下酵母的存活率。為了進一步揭示AECZ對細胞內總ROS水平的影響，實驗采用2’7’-二氯二乙酸酯熒光探針（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）檢測細胞內總氧化水平。DCFH-DA進入細胞后，與ROS反應產生高熒光強度化合物，這種探針已經廣泛應用于評估細胞內ROS的水平[30]。

表2 AECZ對菌株細胞內總氧化水平的影響Table 2 Effect of AECZ on intracellular ROS levels

由表2可知，直接應激H2O2和CCl4的酵母細胞與空白對照組相比，細胞內氧化水平會明顯的增高，而且增量遠遠高于Cd2+應激的水平，這與Cd2+應激的高存活率是相一致的。AECZ可以明顯地改善WT酵母細胞對于H2O2應激的耐受性（8.1倍）。AECZ處理引起的細胞內總ROS水平的降低可能與AECZ的直接羥自由基清除活性及其對抗氧化酶系統激活作用有關，這與上文所述的脂質過氧化水平的降低與存活率的提高是相關的。

3 結 論

本實驗結果表明每克槌果藤材料中總黃酮含量為0.962 mg，經過AB-8大孔樹脂處理，能較高程度地提純槌果藤植株中黃酮、多酚和皂苷等化合物。DPPH自由基和羥自由基清除能力實驗數據表明，AECZ對羥自由基具有較高的靈敏度，能較有效地清除體外模擬環境中的羥自由基。為了更好地探究槌果藤乙醇提純物在生物體內的抗氧化活性，接下來的實驗采用氧化因素脅迫下釀酒酵母的模型。AECZ能顯著地提高CCl4、H2O2和CdSO4應激下WT酵母的存活率，而且隨著AECZ質量濃度增高，增益效果越明顯。尤其是Gtt1和Gtt2基因在AECZ提高酵母細胞對H2O2和Cd2+耐受性的機制中發揮重要作用。進一步的脂質過氧化水平和細胞內總ROS水平檢測結果表明，AECZ有可能是通過直接清除細胞內ROS和激活抗氧化酶系統發揮細胞保護作用。體外和體內的實驗數據均表明槌果藤乙醇提純物有較強的抗氧化活性，這為進一步研究開發槌果藤各部位在食品、藥品及人類健康方面的應用提供了較重要的依據。

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（1.海南大學熱帶農林學院，海南 ?？?570228；2.天津商業大學 天津市食品生物技術重點實驗室，天津 300134；3.黃岡師范學院 湖北省經濟林種質資源改良與資源重點實驗室，湖北 黃岡 438000）

采用AB-8大孔樹脂純化槌果藤乙醇浸提物，得到槌果藤乙醇提純物（alcoholic extract of Capparis zeylanica Linn，AECZ）。體外1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和羥自由基清除實驗表明AECZ具有較強的自由基清除能力。之后采用釀酒酵母BY4741及其基因缺失型（Ctt1、Sod1、Gsh1、Gtt1和Gtt2）探索AECZ對氧化應激條件下對酵母細胞的保護作用。結果表明AECZ能明顯地提高酵母細胞對于H2O2、CCl4和CdSO4氧化應激的耐受性，同時能明顯地降低應激狀態下酵母的脂質過氧化和細胞內氧化水平。GTT1基因在AECZ減輕氧化應激下酵母損傷中發揮重要的作用。本實驗驗證了AECZ在細胞內具有顯著的抗氧化活性，可為進一步開發利用槌果藤提供理論依據。

槌果藤；抗氧化；釀酒酵母；細胞內氧化；脂質過氧化

The Alcoholic Extract of Capparis zeylanica Linn Protects against Oxidative Damage in Saccharomyces cerevisiae: An Investigation into the Mechanism

ZHANG Peng1, WANG Xiangxing2, YANG Yaping2, LI Shiming3, ZHAO Hui2, LUO Yanping1,*
(1. Institute of Tropical Agriculture and Forestry, Hainan University, Haikou 570228, China; 2. Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China; 3. Hubei Provincial Key Laboratory of Economic Forest Germplasm Improvement and Resources Comprehensive Utilization, Huanggang Normal University, Huanggang 438000, China)

The crude alcoholic extract of Capparis zeylanica Linn (AECZ) was purif i ed through AB-8 macroporous resin. The in vitro tests indicated that AECZ had potent hydroxyl radical and (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical scavenging activities. The cytoprotection of AECZ in Saccharomyces cerevisiae BY4741 and its homogenous strains deficient in antioxidant enzyme genes under oxidative stress induced by H2O2, CCl4and CdSO4was explored. Interestingly, AECZ could dramatically protect yeasts against oxidative stresses induced by H2O2, CCl4and CdSO4. Adaptive treatment with AECZ could reduce the level of intracellular lipid peroxidation and reactive oxygen species in yeasts under stress conditions. Moreover, the GTT1 gene played an important role in alleviating oxidative damage in yeast cells. This study for the fi rst time demonstrated the intracellular antioxidant activity of AECZ, which will provide theoretical evidence for further exploitation and utilization of Capparis zeylanica Linn.

Capparis zeylanica Linn; antioxidant; Saccharomyces cerevisiae; cellular oxidation; lipid peroxidation

10.7506/spkx1002-6630-201707009

TS201.2

A

1002-6630（2017）07-0049-06

張鵬, 王向星, 楊雅萍, 等. 槌果藤乙醇提純物保護釀酒酵母免受氧化損傷機制研究[J]. 食品科學, 2017, 38(7): 49-54. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201707009. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Peng, WANG Xiangxing, YANG Yaping, et al. The alcoholic extract of Capparis zeylanica Linn protects against oxidative damage in Saccharomyces cerevisiae: an investigation into the mechanism[J]. Food Science, 2017, 38(7): 49-54. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201707009. http://www.spkx.net.cn

2016-09-12

國家自然科學基金面上項目（21162007）；國家大學生創新項目（201510069043 ）；天津市農產品加工新工藝及相關機理研究創新團隊項目（TD12-5049）

張鵬（1991—），男，碩士研究生，研究方向為天然產物篩選與應用。E-mail：Tjcu408@gmail.com

*通信作者：駱焱平（1973—），男，教授，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：yanpluo@yahoo.com.cn