BIX—01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a在小細胞肺癌患者中的應用研究

王丹丹　朱丹燕　王丹　徐文震

[摘要] 目的 探討BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a在小細胞肺癌患者中的應用。 方法 選擇2016年2～8月醫院收治的小細胞肺癌患者50例，患者均行手術治療，取小細胞肺癌病灶標本及相應癌旁正常組織標本，采用HE染色及免疫組化染色檢測兩種不同標本中BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a表達情況。 結果 50例小細胞肺癌患者中，29例發生淋巴或遠處轉移，21例未發生轉移。50例腫瘤相應癌旁3 cm以上的肺組織均為正常組織。G9a抑制劑BIX-01294在兩種組織陽性表達率比較差異有統計學意義（P<0.05）；小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平與臨床分期、腫瘤分級關系密切（P<0.05）；G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌癌旁組織及小細胞肺癌中均有表達，主要集中在細胞質中，細胞膜及細胞核中也有表達，免疫組化顆粒呈棕黃色。小細胞肺癌組織中29份標本呈陽性表達，50例癌旁組織中，14例陽性表達。 結論 G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌組織中表達上調，能調控小細胞肺癌患者Wnt信號通路。

[關鍵詞] 小細胞肺癌；DNA異常甲基化；組化蛋白；Wnt信號通路；BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）04-0001-04

Study on the application of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in the patients with small cell lung cancer

WANG Dandan1 ZHU Danyan1 WANG Dan1 XU Wenzhen2

1.Department of Pharmacy， Taizhou Hospital of Zhejiang Province， Taizhou 318000， China； 2.Department of Thoracic Surgery， Sanmenwan Branch， the First Affiliated Hospital of Zhejiang University， Sanmen 317100， China

[Abstract] Objective To investigate the application of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in small cell lung cancer. Methods From February to August 2016， 50 patients with small cell lung cancer who were admitted to our hospital were selected. Patients were given surgical treatment. Small cell lung cancer specimens and the corresponding adjacent normal tissue specimens were collected. The expression of BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a in two different specimens was detected by HE staining and immunohistochemical staining. Results Of the 50 patients with small cell lung cancer， 29 patients had lymphatic or distant metastases and 21 had no metastases. In 50 cases of tumor， the lung tissues adjacent to the cancer 3 cm and above were normal tissues. The positive expression rate of G9a inhibitor BIX-01294 in two tissues was compared， and the differences were statistically significant（P<0.05）； the expression level of G9a inhibitor BIX-01294 in small cell lung cancer was closely related to clinical staging and tumor classifications（P<0.05）； G9a inhibitor BIX-01294 in paracancerous tissues of small cell lung cancer and small cell lung cancer was expressed， mainly concentrated in the cytoplasm. It was also expressed in cell membrane and nucleus， and immunohistochemical particles were brown. In the small cell lung cancer tissues， 29 specimens were positively expressed. In 50 cases of paracancerous tissue， 14 cases were positively expressed. Conclusion G9a inhibitor BIX-01294 is up-regulated in small cell lung cancer and can regulate Wnt signaling pathway in small cell lung cancer.

[Key words] Small cell lung cancer； DNA aberrant methylation； Immunohistochemical protein； Wnt signaling pathway； BIX-01294 targeted histone methyltransferase G9a

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，我國肺癌每年發病人數超過100萬，并且以每年26.9%的速度迅速增長，雖然臨床對于肺癌技術的治療取得了較大的發展，但是患者5年生存率低于15%。因此，肺癌已經取代肝癌成為惡性腫瘤死亡的主要原因[1]。根據病理特征不同，臨床上將肺癌分為兩類：非小細胞肺癌（包括肺腺癌、肺鱗癌、大細胞肺癌）和小細胞肺癌[2]。小細胞肺癌占肺癌的20.0%～25.0%，但是具有惡性程度最高、分化最低的一類腫瘤。目前，臨床上對于肺癌發病機制尚不完全知曉，多與吸煙、環境污染等有關，且隨著環境污染的加重，導致小細胞肺癌發生率呈現上升及年輕化趨勢，嚴重影響我國居民健康[3]。

組蛋白修飾是指發生在組蛋白氨基酸殘基上一系列化學修飾，主要包括乙酰化、甲基化、磷酸化等[4]。而組蛋白修飾則是表性遺傳的一種主要機制，在多種腫瘤的發生、發展中發揮了重要的作用[5]。G9a是一種組蛋白甲基化轉移酶，主要負責常染色質區域蛋白H3中K9及K27位點的甲基化[6]。G9a可以通過兩種不同的機制完成基因轉錄的調控，一方面能促進基因啟動子區域組蛋白或DNA甲基化，能有效地甲基化。而G9a能作為腳手架蛋白進一步激活轉錄因子，從而能促進基因的轉錄[7]。文獻報道顯示[8]，BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a能直接參與腫瘤的發生、發展，但是該機制尚不完全知曉。為探討BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a在小細胞肺癌患者中的應用，取2016年2～8月醫院收治的小細胞肺癌患者50例，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年2～8月醫院收治的小細胞肺癌患者50例，男31例，女19例，年齡39～79歲，平均（60.14±4.21）歲。腫瘤組織病理分級：高分化23例，中分化12例，低分化15例。TNM分期： Ⅰ～Ⅱ期22例，Ⅲ～Ⅳ期28例。29例發生淋巴或遠處轉移，21例未發生轉移。納入標準：①符合小細胞肺癌臨床診斷標準；②均經過手術病理檢查最終確診為小細胞肺癌；③患者均行手術治療，術中取病灶組織及癌旁組織；④對本課題知情同意，自愿簽署知情同意書。排除標準：①排除不符合小細胞肺癌臨床診斷標準者；②排除合并有影響效應指標觀測、判斷其他生理或病理者；③排除合并由于電解質紊亂以及酸堿平衡失調引起的心律失常。不同患者性別、年齡、腫瘤組織病理分級及TNM分期比較差異無統計學意義。

1.2主要儀器與試劑

為保證試驗順利完成，采用的主要儀器和試劑主要由倒置相差顯微鏡（Leica，Germany ）、兔抗人G9a抗體（美國 Upsate 公司）、Ultrasensitive TMS-P試劑盒（福州邁新生物有限公司）、石蠟切片機（德國 Leica RM2016）、數碼醫學圖像分析系統（德國Motic Med 6.0B）、電熱恒溫培養箱（上海躍進醫療器械廠）、DAB顯色試劑盒（中杉公司）等。

1.3 方法

采用HE染色及免疫組化染色檢測兩種不同標本中BIX-01294靶向組蛋白甲基轉移酶G9a表達情況。對每一例病理標本連續制備3張4 μm切片，并進行染色。抗G9a抗體稀釋濃度為1：100，PBS代替一抗作為對照。（1）HE染色。取新鮮的病灶組織及癌旁組織，放入10.0%中性甲醛溶液中固定，常規脫水、透明，浸潤包埋后處理，采用切片機制備4 μm切片，HE染色，倒置顯微鏡下觀察細胞的形態[9，10]。（2）免疫組化染色。制備4 μm石蠟切片，采用二甲苯脫蠟、乙醇水化，利用高壓鍋高溫、高壓下進行抗原修復，自然冷卻后水洗采用PBS在pH為7.4下進行漂洗，滴加50 μL兔抗人G9a抗體，放入4℃冰箱中過夜，采用PBS進行沖抵，滴加50 μL二抗（酶標抗兔聚合物）在37℃孵育，采用PBS進行3次沖洗，加入DAB顯色劑顯色，利用自來水進行漂洗，蘇木精襯染及藍花，梯度乙醇脫水后，二甲苯透明，中性樹脂膠封片，倒置顯微鏡下觀察細胞形態[11，12]。

1.4 判斷標準

（1）HE染色。采用單盲法對病理學進行復查，確診為小細胞肺癌，并進行病理分級。（2）G9a抑制劑BIX-01294免疫組化表達判斷標準。對病灶組織與癌旁組織采用二級積分法進行判定[13]。①根據染色范圍進行積分。著色范圍<1%記為0分，1%～19%記1分，20%～50%記2分，>50%記3分；②根據著色程度進行評分。無著色記0分，較淺記1分，較深著色記2分。將兩種評分相加作為總計分。總得分≤1.9分為陰性（-），2.0～2.9分弱陽性（+），3.0～3.9分為陽性（2+），≥4.0分為強陽性[14，15]。

1.5 統計學分析

采用SPSS18.0統計學軟件處理，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 50例小細胞肺癌患者HE染色結果

50例小細胞肺癌患者中，29例發生淋巴或遠處轉移，21例未發生轉移。50例腫瘤相應癌旁3 cm以上的肺組織均為正常組織。

2.2 G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌組織及正常組織中的表達

G9a抑制劑BIX-01294在50例胃癌患者中29例陽性表達，21例表達缺失，陽性表達率為58.0%。而在50例癌旁組織中，14例陽性表達，36例表達缺失，陽性表達率為28.0%，兩種組織陽性表達率比較差異有統計學意義（P<0.05），見封三圖1。

2.3 小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平與臨床分期、腫瘤分級的相關性

小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平與臨床分期、腫瘤分級關系密切（P<0.05），見表1。

表1 小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平與臨床分期、腫瘤分級的相關性

2.4 小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平免疫組化染色結果

G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌癌旁組織及小細胞肺癌中均有表達，主要集中在細胞質中，細胞膜及細胞核中也有表達，免疫組化顆粒呈棕黃色。小細胞肺癌組織中29份標本呈陽性表達，50例癌旁組織中，14例陽性表達，見封三圖2。

3討論

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，根據WHO最新報道，2015年全世界每年有640萬人死于肺癌，比2005年增加了100萬。我國每年肺癌新增例數超過100萬，成為世界上“肺癌第一大國”。臨床根據肺癌的病理特征不同將其分為非小細胞肺癌和小細胞肺癌[16，17]。前者又分為肺腺癌、肺鱗癌及大細胞肺癌。數據報道顯示，小細胞肺癌僅占肺癌的20.0%～25.0%，是肺癌中惡性程度最高、分化最低的惡性腫瘤。流行病學調查研究顯示[18]，小細胞肺癌發病年齡在30～70歲之間，且男性多于女性，起源于支氣管黏膜或腺上皮內的Kulchitsky細胞，具有一定的神經內分泌功能。

組蛋白甲基化是染色質結構改變和基因轉錄的重要調控機制，多于腫瘤的發生、發展有關。組蛋白甲基化轉移酶是一類催化1～3個甲基基團轉移到組蛋白賴氨酸或精氨酸上的酶[19，20]。而G9a屬于含SET結構的Suv39h蛋白家族成員之一，屬于小細胞肺癌中比較重要的常染色質HMT，在肺癌的發生、發展中發揮重要的作用。本研究中，50例小細胞肺癌患者中，29例發生淋巴或遠處轉移，21例未發生轉移。50例腫瘤相應癌旁3 cm以上的肺組織均為正常組織。從大的角度來說，G9a又稱為常染色質組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶-2，在哺乳動物中相對保守。數據報道顯示，人源、牛源、大鼠與小鼠G9a同源性高達95.0%。而小鼠G9a的N端含谷氨酸和半胱氨酸區域，可能參與G9a自身的甲基化。同時，G9a在多種組織中表達[21]。相關學者對正常不同小鼠G9a表達進行測定，結果顯示：G9a在肌肉、心臟、腦等組織中存在高表達，而在白色脂肪、脾臟及肺部組織中表達相對較低。當機體肺部組織發生異常后，G9a水平將會出現上升趨勢[22]。本研究中，G9a抑制劑BIX-01294在50例胃癌患者中29例陽性表達，21例表達缺失，陽性表達率為58.0%。而在50例癌旁組織中，14例陽性表達，36例表達缺失，陽性表達率為28.0%，兩種組織陽性表達率比較差異有統計學意義（P<0.05）。

G9a抑制劑BIX-01294是繼Suv39h1后發現的第2個哺乳動物中甲基化賴氨酸的HMT，能直接作用在H3K9和K27等位點[23]。同時，G9a抑制劑BIX-01294能將甲基從SAM轉移到目的氨基上，從而能有效地抑制基因的轉錄。同時，G9a抑制劑BIX-01294與GLP關系密切，人源G9a抑制劑BIX-01294與GLP的相似度達到45.0%。此外，G9a抑制劑BIX-01294不僅能調控組蛋白的甲基化，還能調控DNA甲基化程度，并且能在DNA甲基轉移酶的作用下出現高表達。本研究中，小細胞肺癌G9a抑制劑BIX-01294表達水平與臨床分期、腫瘤分級關系密切（P<0.05）。由此看出：G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌中具有高表達，并且其表達水平與腫瘤的臨床分期、腫瘤的分級等有關。因此，小細胞肺癌患者治療過程中應該加強G9a抑制劑BIX-01294水平監測，根據監測結果調整治療方案，使得患者的治療更具針對性[24]。本研究中，G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌癌旁組織及小細胞肺癌中均有表達，主要集中在細胞質中，細胞膜及細胞核中也有表達，免疫組化顆粒呈棕黃色。小細胞肺癌組織中29份標本呈陽性表達，50例癌旁組織中，14例陽性表達。文獻報道顯示：G9a抑制劑BIX-01294能有效地促進腫瘤的發生、發展，能持續引發自噬，從而引起癌細胞的增殖和分化，并且G9a抑制劑BIX-01294能座位癌細胞自噬誘導劑，能為癌癥的治療提供新的思路和方法[25]。

綜上所述，G9a抑制劑BIX-01294在小細胞肺癌組織中表達上調，能調控小細胞肺癌患者Wnt信號通路，直接參與腫瘤的發生、發展，加強G9a抑制劑BIX-01294監測能為臨床治療提供依據和參考。

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（收稿日期：2016-12-06）