血清miR系列基因表達水平與非小細胞肺癌預后的相關性研究

陳群　石琴

[摘要] 目的 探討血清miR系列基因表達水平與非小細胞肺癌（NSCLC）預后的相關性。 方法 分別收集2010年4月～2013年4月收治的250例NSCLC患者冰凍組織和血清樣本，25例NSCLC及其癌旁組織，25例未經手術治療的晚期NSCLC患者化療前和3個療程后的血清樣本，200例未經任何抗癌治療的NSCLC患者血清，作為NSCLC組；選取100例健康志愿者的血清樣本，作為對照組。采用qRT-PCR方法檢測NSCLC組和對照組中血清miR系列基因表達水平，判斷血清miR系列基因表達水平與預后的關系。 結果 NSCLC組化療3個療程的患者的血清miR系列基因表達與化療前存在明顯差異（P<0.05）；對照組的血清miR系列基因表達與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后指標比較無統計學意義（P>0.05）。結論 血清miR系列基因表達水平在NSCLC患者明顯升高，治療后miR系列基因表達明顯下降，血清miR系列基因有可能成為預測NSCLC預后的分子標志物。

[關鍵詞] 非小細胞肺癌；miR系列基因；qRT-PCR法；基因表達

[中圖分類號] R734.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）04-0016-03

Study on the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer

CHEN Qun SHI Qin

Department of Oncology， Fujian Medical University Teaching Hospital， Fuzhou Pulmonary Hospital， Fuzhou 350008， China

[Abstract] Objective To investigate the correlation between the expression level of serum miR gene and the prognosis of non-small cell lung cancer （NSCLC）. Methods Frozen tissues and serum samples from 250 patients with NSCLC from April 2010 to April 2013 were collected. The serum samples of 25 cases of NSCLC and its adjacent tissues， 25 patients with advanced NSCLC without surgery before the chemotherapy and after 3 courses treatment， and 200 patients with NSCLC without any anticancer treatment were selected as the NSCLC group. Serum samples of 100 healthy volunteers were selected as the control group. The levels of serum miR gene expression in NSCLC group and control group were detected by qRT-PCR method， and the relationship between the expression level of serum miR gene and prognosis was judged. Results The expression of serum miR gene in the patients in NSCLC group after 3 courses of chemotherapy was significantly different from that before the chemotherapy（P<0.05）； the expression of serum miR gene in the control group was significantly different from that before chemotherapy（P<0.05）， and there was no significant difference in the patients after chemotherapy（P>0.05）. Conclusion Serum miR gene expression level is significantly increased in NSCLC patients. After the treatment， the expression of miR gene is decreased significantly. The serum miR gene may become a molecular marker for predicting the prognosis of NSCLC.

[Key words] Non-small cell lung cancer； miR gene； qRT-PCR method； Gene expression

非小細胞肺癌（NSCLC）是臨床上較為常見的惡性腫瘤，手術、放化療是治療非小細胞肺癌的主要手段，但非小細胞肺癌對術后輔助放、化療敏感性差[1，2]。而且評價化療后的效果，除常規指標，miR系列基因也被廣泛應用作為評價NSCLC的臨床療效指標，可以反映化療后指標的變化，從而確定化療效果。大部分學者關于miR系列基因與NSCLC預后的研究涉及其中的幾個指標，但是本研究涉及6個指標miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1，因此可以更準確地判斷。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

分別收集2010年4月～2013年4月的250例NSCLC患者冰凍組織和血清樣本，并按期整理臨床治療資料，25例為NSCLC及其癌旁組織，收集其手術前和手術后2周的血清樣本；25例未經手術治療的晚期NSCLC患者化療前和3個療程后的血清樣本；200例未經任何抗癌治療的NSCLC患者血清，作為NSCLC組；選取100例與NSCLC組年齡性別分布相同的健康志愿者的血清樣本，作為對照組。兩組對象在性別和年齡方面無統計學意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 RNA分離提取 按照試劑說明書，組織total RNA抽提使用The miRVana miRNA Isolation Kit（Ambion，Austin，Texas，USA）。血清的total RNA 使用microRNAs Isolation Kit（Applied Biosystems，Forster City，CA，USA）抽提。total RNA溶于DEPC處理水中，-80℃保存。RNA濃度使用Nanodrop 2100（NanoDrop，Wilmington，DE）測定。

1.2.2 qRT-PCR分析 差異表達使用Two-step qRT-PCR分析。第一步cDNA的反轉錄，第二步 real-time quantitative PCR。miRNA的反轉錄相關操作嚴格按試劑盒One Step Prime Script?；microRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，Tokyo，Japan）操作說明進行，反轉錄的反應體系為[3，4]：2×microRNA Reaction Buffer Mix 10 μL，0.1%BSA 2 μL，microRNA Prims Script?；RT Enzyme Mix 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free ddH2O 5 μL。反轉錄反應條件：37℃ 60 min，85℃變性5 s。microRNA的qRT-PCR嚴格按照試劑盒SYBR & reg；Premix EX TaqTM Ⅱ（Takara，Tokyo，Japan）操作說明進行，qRT-PCR的反應體系為SYBR?；Premix EX TaqTM Ⅱ 12.5 μL，PCR Forward Primer 1 μL，Uni-miR qPCR Primer 1 μL，模板2 μL，ddH2O 8.5 μL。qRT-PCR反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火和延伸30 s，共40個循環。定量PCR使用ABI 7900的Fast real time PCR system（Applied Biosystems，Carlsbad，CA）執行，每個樣本平行重復3次，采用U6 snRNA 做參考基因，2-△△Ct method 用于計算基因表達倍數變化。

1.3 統計學方法

數據分析使用SPSS21.0 統計學軟件，所有數據均符合正態分布，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，進行t檢驗，P<0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR系列基因表達水平比較

見表1。NSCLC組化療3個療程患者的血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達與化療前存在明顯差異（P<0.05）；對照組血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達與化療前患者存在明顯差異（P<0.05），與化療后患者比較無統計學意義（P>0.05）。

2.2 不同病理NSCLC患者化療前后血清miR系列基因表達水平比較

見表2。不同病理NSCLC患者化療后血清miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1基因表達與化療前比較存在明顯差異（P<0.05）。

3 討論

循環血miRNA對腫瘤早期診斷、腫瘤分期和預后效果等方面具有重要的警示作用，而且也可以很好地評價化療的效果[5，6]。大部分學者研究1個miRNA基因或2個可以在一定程度上評價腫瘤治療的效果，雖然血清中游離的miRNA 可能是來自裂解的腫瘤細胞，但也不能排除差異表達的miRNA是作為類激素效應而由其他器官炎癥引起的介導反應[7，8]。所以在鎖定與肺癌預后有關的miRNA之前，有必要驗證血清中游離的miRNA是否來源于病灶區域癌細胞的裂解。本課題同時利用組織和血清樣本檢測miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92-1表達水平，有助于提高篩選成功率。

研究[9，10]顯示miR-19a、miR-19b可以在膀胱癌、小泡狀橫紋肌肉瘤、結腸癌等腫瘤患者的血清中呈現高表達，而且結果顯示miR-19a、miR-19b的表達與腫瘤血管的發生、預后、復發及其生存率具有密切關系。也有研究[11，12]顯示將miR-19a、miR-19b應用于NSCLC患者的研究可以明顯出現高表達，而且化療后明顯降低。外周血miR系列基因的穩定性比較強，不受外界環境及自身的生理狀態的影響，可以準確地反應人體自身的生理變化[13]，因此外周血miR系列基因可以應用于NSCLC診斷及預后的評價。本研究結果顯示化療前NSCLC患者存在明顯miR系列基因高表達，而通過3個療程化療后患者的miR系列基因明顯降低，說明miR系列基因可以評價NSCLC診斷及預后。

miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在多種腫瘤細胞中表達異常[14，15]。而且在大多數惡性腫瘤中細胞或組織中，miR系列基因的表達均顯著升高。因此在腫瘤的診斷及治療中可以通過監測患者的miR系列基因的變化可以判斷NSCLC患者的發病情況、化療后患者的康復情況，也可以作為判斷NSCLC患者預后的重要指標。本研究的結果也顯示miR-17-3p、miR-18a、miR-20a和miR-92-1在NSCLC患者化療前存在高表達，而且通過化療后上述指標明顯降低，說明血清miR系列基因可以評價NSCLC患者的預后。因此本研究將NSCLC患者的預后與血清miR系列基因表達進行研究，表明血清miR系列基因表達在NSCLC患者中的高表達。

綜上所述，血清miR系列基因表達水平在NSCLC患者明顯升高，治療后miR系列基因表達明顯下降，血清miR系列基因有可能成為預測NSCLC預后的分子標志物。

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（收稿日期：2016-11-09）