低分子肝素制備方法研究進展

李美花

摘 要：低分子肝素由于吸收性好、安全性及生物利用率高等優(yōu)點，而逐漸取代肝素應(yīng)用于臨床。文章介紹了低分子肝素的基本概念，簡述了其發(fā)展過程，重點綜述了制備低分子肝素的化學(xué)降解法和酶解法，探討了其發(fā)展趨勢，為相關(guān)研究者提供參考。

關(guān)鍵詞：低分子肝素；LMWH；降解

低分子肝素（LMWH）是在普通肝素的基礎(chǔ)上發(fā)展的新一代肝素類抗凝血藥物，是使用合適方法將肝素分級或降解得到的具有較低分子量的肝素組分或片段。20世紀70年代中，在肝素研究史上取得了兩大突破：一是發(fā)現(xiàn)肝素中僅有30%～50%的組分可以結(jié)合ATⅢ發(fā)揮抗凝血活性，這改變了“肝素的每一個分子都有抗凝血活性”的老觀點；二是發(fā)現(xiàn)以往認為并無無活性的低分子肝素對Ⅱa因子有強的抑制作用[1]。20世紀70年代末，低分子肝素進入臨床使用。

低分子肝素的制備方法主要有物理制備法、化學(xué)降解法、酶解法和合成法。不同的制備方法可獲得不同分子量和生物活性的 LMWH，彼此不能代替使用。以下主要對化學(xué)降解法和酶解法進行綜述。

1 化學(xué)降解法

化學(xué)法是指利用化學(xué)反應(yīng)獲取低分子量肝素的方法，使肝素糖環(huán)或糖苷鍵斷裂，從而，大分子的肝素降解成低分子量的肝素及相應(yīng)寡糖，主要的方法有亞硝酸降解、β-消除降解法、過氧化氧降解法、光化學(xué)降解法。

1.1 亞硝酸降解法

這是最經(jīng)常使用的一種方法。酸性條件下，肝素中游離的氨基與亞硝酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，斷裂在氨基葡萄糖的殘基部位，最終生成低分子量肝素和氮氣。此反應(yīng)條件較溫和，并且這種方法在低分子肝素的末端引入了新的縮環(huán)的甘露糖殘基的還原基團。然而，亞硝酸降解法對N硫酸化的氨基葡萄糖殘基的保護作用不完全，又偏偏這些殘基是抗凝血酶III結(jié)合所必需的片段。反應(yīng)過程中，通過控制亞硝酸的量，酸堿度，反應(yīng)溫度和時間等，可控制生成的產(chǎn)物的分子量[2]。

1.2 β-消除降解法

β-消除降解法包括肝素季銨化、酯化和降解三個步驟[3]。在堿性條件下，肝素會發(fā)生β-消除反應(yīng)，斷裂在艾杜糖醛酸殘基部位，從而生成低分子量肝素，但會引起多糖鏈結(jié)構(gòu)的變化和多糖基上O-硫酸基團脫落，會喪失原有部分功能。酯化肝素中的糖醛酸可以增強α-H的酸度，非水相或水相介質(zhì)條件下，肝素酯更容易與親和基團發(fā)生β-消除反應(yīng)。肝素的鹵代芐基化合物和季銨鹽在DMF或二氯甲烷中能夠發(fā)生酯化反應(yīng)，生成的酯在堿性條件下可以水解成LMWH?？刂萍句@鹽的種類堿性條件、季銨鹽的用量可以控制肝素的降解程度，從而獲得不同分子量分布的產(chǎn)物。

1.3 過氧化氫法降解法

過氧化物由于擁有不配對電子的氧自由基，因此化學(xué)反應(yīng)性極高。該法關(guān)鍵是利用過氧化氫在銅離子催化下分解生成羥基自由基，在所生成的自由基攻擊下，糖鏈發(fā)生斷裂[4]。制備過程中，條件較溫和，溫度和pH均沒有顯著變化，肝素的活性中心不易被破壞，但是硫酸化程度較高，過程中銅離子等雜質(zhì)的引入為后期的處理造成了困難。過氧化氫法也適用于其他糖胺聚糖的解聚，如刺參糖胺聚糖、硫酸皮膚素和硫酸軟骨素等。

1.4 光化學(xué)降解法

電噴霧傅立葉變換質(zhì)譜和氫譜測試證明，光化學(xué)降解肝素是一個隨機的、可發(fā)生在Heparosan多糖中的N-乙酰胺殘基或葡糖醛酸的過程。Higashi等[5]利用TiO2催化下的光化學(xué)反應(yīng)，將E. coli K5發(fā)酵生產(chǎn)的分子量大于15000 Heparosan成功降解至8000左右，解聚前后結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化的過程。進一步地，Higashi等[6]還成功使用過濾器-硼硅玻璃燈降解硫酸化多糖-肝素并顯著減少硫酸化基團的脫去。

2 酶解法

通過控制肝素酶的用量和種類、降解時間等一系列條件可得到不同分子量分布范圍的低分子肝素。酶解法選擇性較強，肝素降解后在末端產(chǎn)生在232nm處有特異的光吸收的不飽和的糖醛酸，該光吸收特征可以作為檢測信號；Heparnase-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是目前常用的三種肝素酶[7]。這三種酶的基因序列不同，降解肝素的位點也有所差異。使用多種肝素酶降解肝素或類肝素，可生成肝素寡糖或二糖等小片段，這有利于對肝素結(jié)構(gòu)的分析。

3 總結(jié)與展望

酶解法反應(yīng)條件溫和、選擇性高，但是成本較其他方法高，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)還有待實現(xiàn)；光化學(xué)降解法能降低反應(yīng)過程中硫酸基團的丟失，保持樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好的保持肝素的抗凝血活性。其他化學(xué)降解法容易由于硫酸基團丟失而影響產(chǎn)物的抗凝血活性。除了抗凝活性，LMWH的抗炎作用臨床使用并不成熟；此外，其還有調(diào)節(jié)細胞增殖、抗腫瘤、預(yù)防腹部術(shù)后粘連等作用[8]，但均有待成熟。未來對于LMWH抗凝以外的生物活性及其臨床應(yīng)用是研究工作的主要方向。

參考文獻

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[2]張麗萍，李雷剛，馬中蘇.亞硝酸降解法制備低分子肝素的工藝參數(shù)優(yōu)化與確定[J].藥物分析雜志，2009（7）：1148-1152.

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[8]劉利.系列肝素藥物質(zhì)量分析及控制研究[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2014：1-48.