低分子肝素制備方法研究進(jìn)展

李美花

摘 要：低分子肝素由于吸收性好、安全性及生物利用率高等優(yōu)點(diǎn)，而逐漸取代肝素應(yīng)用于臨床。文章介紹了低分子肝素的基本概念，簡述了其發(fā)展過程，重點(diǎn)綜述了制備低分子肝素的化學(xué)降解法和酶解法，探討了其發(fā)展趨勢，為相關(guān)研究者提供參考。

關(guān)鍵詞：低分子肝素；LMWH；降解

低分子肝素（LMWH）是在普通肝素的基礎(chǔ)上發(fā)展的新一代肝素類抗凝血藥物，是使用合適方法將肝素分級(jí)或降解得到的具有較低分子量的肝素組分或片段。20世紀(jì)70年代中，在肝素研究史上取得了兩大突破：一是發(fā)現(xiàn)肝素中僅有30%～50%的組分可以結(jié)合ATⅢ發(fā)揮抗凝血活性，這改變了“肝素的每一個(gè)分子都有抗凝血活性”的老觀點(diǎn)；二是發(fā)現(xiàn)以往認(rèn)為并無無活性的低分子肝素對Ⅱa因子有強(qiáng)的抑制作用[1]。20世紀(jì)70年代末，低分子肝素進(jìn)入臨床使用。

低分子肝素的制備方法主要有物理制備法、化學(xué)降解法、酶解法和合成法。不同的制備方法可獲得不同分子量和生物活性的 LMWH，彼此不能代替使用。以下主要對化學(xué)降解法和酶解法進(jìn)行綜述。

1 化學(xué)降解法

化學(xué)法是指利用化學(xué)反應(yīng)獲取低分子量肝素的方法，使肝素糖環(huán)或糖苷鍵斷裂，從而，大分子的肝素降解成低分子量的肝素及相應(yīng)寡糖，主要的方法有亞硝酸降解、β-消除降解法、過氧化氧降解法、光化學(xué)降解法。

1.1 亞硝酸降解法

這是最經(jīng)常使用的一種方法。酸性條件下，肝素中游離的氨基與亞硝酸發(fā)生重氮化反應(yīng)，斷裂在氨基葡萄糖的殘基部位，最終生成低分子量肝素和氮?dú)狻４朔磻?yīng)條件較溫和，并且這種方法在低分子肝素的末端引入了新的縮環(huán)的甘露糖殘基的還原基團(tuán)。然而，亞硝酸降解法對N硫酸化的氨基葡萄糖殘基的保護(hù)作用不完全，又偏偏這些殘基是抗凝血酶III結(jié)合所必需的片段。反應(yīng)過程中，通過控制亞硝酸的量，酸堿度，反應(yīng)溫度和時(shí)間等，可控制生成的產(chǎn)物的分子量[2]。

1.2 β-消除降解法

β-消除降解法包括肝素季銨化、酯化和降解三個(gè)步驟[3]。在堿性條件下，肝素會(huì)發(fā)生β-消除反應(yīng)，斷裂在艾杜糖醛酸殘基部位，從而生成低分子量肝素，但會(huì)引起多糖鏈結(jié)構(gòu)的變化和多糖基上O-硫酸基團(tuán)脫落，會(huì)喪失原有部分功能。酯化肝素中的糖醛酸可以增強(qiáng)α-H的酸度，非水相或水相介質(zhì)條件下，肝素酯更容易與親和基團(tuán)發(fā)生β-消除反應(yīng)。肝素的鹵代芐基化合物和季銨鹽在DMF或二氯甲烷中能夠發(fā)生酯化反應(yīng)，生成的酯在堿性條件下可以水解成LMWH。控制季銨鹽的種類堿性條件、季銨鹽的用量可以控制肝素的降解程度，從而獲得不同分子量分布的產(chǎn)物。

1.3 過氧化氫法降解法

過氧化物由于擁有不配對電子的氧自由基，因此化學(xué)反應(yīng)性極高。該法關(guān)鍵是利用過氧化氫在銅離子催化下分解生成羥基自由基，在所生成的自由基攻擊下，糖鏈發(fā)生斷裂[4]。制備過程中，條件較溫和，溫度和pH均沒有顯著變化，肝素的活性中心不易被破壞，但是硫酸化程度較高，過程中銅離子等雜質(zhì)的引入為后期的處理造成了困難。過氧化氫法也適用于其他糖胺聚糖的解聚，如刺參糖胺聚糖、硫酸皮膚素和硫酸軟骨素等。

1.4 光化學(xué)降解法

電噴霧傅立葉變換質(zhì)譜和氫譜測試證明，光化學(xué)降解肝素是一個(gè)隨機(jī)的、可發(fā)生在Heparosan多糖中的N-乙酰胺殘基或葡糖醛酸的過程。Higashi等[5]利用TiO2催化下的光化學(xué)反應(yīng)，將E. coli K5發(fā)酵生產(chǎn)的分子量大于15000 Heparosan成功降解至8000左右，解聚前后結(jié)構(gòu)沒有發(fā)生變化的過程。進(jìn)一步地，Higashi等[6]還成功使用過濾器-硼硅玻璃燈降解硫酸化多糖-肝素并顯著減少硫酸化基團(tuán)的脫去。

2 酶解法

通過控制肝素酶的用量和種類、降解時(shí)間等一系列條件可得到不同分子量分布范圍的低分子肝素。酶解法選擇性較強(qiáng)，肝素降解后在末端產(chǎn)生在232nm處有特異的光吸收的不飽和的糖醛酸，該光吸收特征可以作為檢測信號(hào)；Heparnase-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ是目前常用的三種肝素酶[7]。這三種酶的基因序列不同，降解肝素的位點(diǎn)也有所差異。使用多種肝素酶降解肝素或類肝素，可生成肝素寡糖或二糖等小片段，這有利于對肝素結(jié)構(gòu)的分析。

3 總結(jié)與展望

酶解法反應(yīng)條件溫和、選擇性高，但是成本較其他方法高，大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)還有待實(shí)現(xiàn)；光化學(xué)降解法能降低反應(yīng)過程中硫酸基團(tuán)的丟失，保持樣品的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，從而更好的保持肝素的抗凝血活性。其他化學(xué)降解法容易由于硫酸基團(tuán)丟失而影響產(chǎn)物的抗凝血活性。除了抗凝活性，LMWH的抗炎作用臨床使用并不成熟；此外，其還有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、抗腫瘤、預(yù)防腹部術(shù)后粘連等作用[8]，但均有待成熟。未來對于LMWH抗凝以外的生物活性及其臨床應(yīng)用是研究工作的主要方向。

參考文獻(xiàn)

[1]張利 .低分子量肝素藥物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)綜述[J].科技傳播，2010，8（下）：91-92.

[2]張麗萍，李雷剛，馬中蘇.亞硝酸降解法制備低分子肝素的工藝參數(shù)優(yōu)化與確定[J].藥物分析雜志，2009（7）：1148-1152.

[3]王 .一種超低分子肝素鋼的制備方法及其應(yīng)用[P].中國專利：102952202，20130306.

[4]Robert J L， Pdnsg M S. Production and processing of low molecular weight heparins[J]. Semin Thmmb Hemost， 1999，25（3）：5-16.

[5]Higashi K，Ly M，Wang Z Y，et al. Controlled photochemical depolymerization of K5 heparosan，a bioengineered heparin precursor[J].Carbohydr Polym，2011，86（3）：1365-1370.

[6]Higashi K，Hosoyama S，Ohno A，et al. Photochemical preparation of a novel low molecular weight heparin[J]. Carbohydr Polym，2012，87（2）：1737-1743.

[7]Linhardt R J. Analysis of glycosaminoglycans with polysaccharidelyases[J]. Curr Protocols Mol Biol，1999，17（13B）：11-17.

[8]劉利.系列肝素藥物質(zhì)量分析及控制研究[D].江蘇：蘇州大學(xué)，2014：1-48.