采用頂空固相微萃取和氣質聯用法分析氮源濃度對酵母香氣物質合成的影響

秦偉帥，董書甲，姜凱凱,2，封文濤，劉燦珍，趙新節*

1(齊魯工業大學，山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南，250353) 2(山東省農業科學院 農產品研究所，山東 濟南，250100) 3(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

采用頂空固相微萃取和氣質聯用法分析氮源濃度對酵母香氣物質合成的影響

秦偉帥1，董書甲1，姜凱凱1,2，封文濤3，劉燦珍1，趙新節1*

1(齊魯工業大學，山東省微生物工程重點實驗室，山東 濟南，250353) 2(山東省農業科學院 農產品研究所，山東 濟南，250100) 3(煙臺張裕葡萄釀酒股份有限公司，山東 煙臺，264000)

為探討氮源濃度對酵母香氣物質合成的影響，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPME)和氣質聯用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源濃度的模擬葡萄汁酒精發酵后的揮發性香氣成分。實驗結果表明：揮發性香氣成分的總量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯、乙酸、辛酸、己酸、2,3-丁二醇、異戊醇的含量隨氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量隨氮源濃度的提高而下降。

可同化氮;酵母;香氣物質;頂空固相微萃取(HS-SPME)；氣相色譜-質譜法(GC-MS)

氮源是酵母進行正常的生命活動所必需的營養元素。釀酒酵母在發酵代謝過程中優先利用簡單的氮源，如銨離子和游離的α-氨基氮化合物。脯氨酸為亞氨基酸，在酵母發酵過程中難以被利用，酵母在發酵過程中也可以利用一些小分子多肽，因此，酵母菌的可同化氮(yeast assimilable nitrogen，YAN)為除脯氨酸外的游離α-氨基氮化合物、銨態氮和小分子多肽[1]。葡萄酒的香氣是品種香氣、發酵香氣、陳釀香氣的特殊混合[2]，是葡萄酒品質與風格的重要標志。葡萄酒的香氣化合物包括高級醇、揮發性酸、酯類等等。酵母代謝是產生葡萄酒香氣的途徑之一，并與發酵基質中的氮源關系密切，因此氮源是葡萄酒中某些芳香物質的前體[3]。

目前較多的研究認為，釀酒酵母進行正常的生長代謝所需要的最低可同化氮濃度為 140～150 mg N/L，比較合適的可同化氮素含量為 200～500 mg N/L，超過500 mg N/L則認為可同化氮素含量過量[12]。HERNNDEZ-ORTE等[4]的研究表明,葡萄汁中的氨基酸與發酵后葡萄酒中的香氣存在相關性，并通過向葡萄汁中添加氨基酸的方法提高了葡萄酒中揮發性香氣化合物的含量，加快了酵母酒精發酵的速度，提高了葡萄酒的品質。BARBOSA等[6]的研究表明，適量提高可同化氮濃度可以提高葡萄酒中的香氣物質的含量。目前關于氮源與香氣成分關系的研究通常受到葡萄品種香氣的影響，而以模擬葡萄汁為試材研究氮源濃度與酵母自身香氣物質合成的報道相對較少。

本研究以模擬葡萄汁為試驗材料，采用頂空固相微萃取(headspace solid-phase microextraction，HS-SPM E)和氣質聯用法(gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS)分析了不同氮源濃度的模擬葡萄汁酒精發酵后的揮發性香氣成分，并研究了氮源濃度與香氣物質合成的聯系，為探究氮源與酵母自身香氣物質合成的關系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

商業釀酒酵母：EC1118，購自上海杰兔工貿有限公司。

材料：葡萄糖、酒石酸、蘋果酸、檸檬酸、肌醇、谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸、磷酸氫二銨(DAP)、NaCl(分析純)。

香氣標準品：1-丙醇、異丁醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、異戊醇、乙酸、異丁酸、辛酸、己酸、癸酸、乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯、己酸乙酯、月桂酸乙酯、辛酸乙酯，均購自美國Sigma公司；內標4-甲基-2-戊醇(色譜醇98%)購自美國Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

萬分之一天平、高壓蒸汽滅菌鍋、顯微鏡、分光光度計、培養箱、超凈工作臺、SPME手動進樣手柄、DVB/CAR/PDMS 復合萃取頭(50/30μm)，美國Supelco公司；GC-7890B/MS-5977A氣相色譜-質譜聯用儀，美國Agilent公司。

1.3 試驗設計

本試驗設計160、400、480 mg/L三種氮源濃度，以谷氨酰胺、丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、絲氨酸、谷氨酸、蘇氨酸作為有機氮源，磷酸氫二銨(DAP)作為無機氮源。

模擬葡萄汁參照張瑾等[5]的方法配制，由儲液Ⅰ、儲液Ⅱ和儲液Ⅲ組成，成分組成如下：

儲液Ⅰ:在 375 mL蒸餾水中加入 200 g葡萄糖,定容至 500 mL；

儲液Ⅱ:在 250 mL蒸餾水中加入 6 g酒石酸，3 g蘋果酸，0.5 g檸檬酸；

儲液Ⅲ:在 250 mL蒸餾水中加入 6 mg 肌醇、可同化氮(YAN)。160、400、480 mg/L三種氮源濃度(分別以YAN160、YAN400、YAN480表示)的模擬葡萄汁中的氮源組成見表1。

表1 不同濃度氮源模擬葡萄汁的氮源組成 單位：g/L

將儲液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ混合后用 KOH 調節pH至3.25，高壓滅菌，現用現配。

將酵母活化后，按0.3 g/L的標準接種于模擬葡萄汁中，將接種后的模擬葡萄汁放于培養箱中25 ℃下培養。

1.4 分析方法

1.4.1 酵母菌計數

發酵啟動后，每天進行酵母菌的稀釋平板計數，每組處理做3次重復取平均值。

1.4.2 還原糖的測定

還原糖采用DNS法測定。發酵開始后每隔100 h測定1次還原含量，每組處理做3次重復取平均值。

1.4.3 發酵參數測定

發酵結束后采用蒸餾法測定發酵液的酒精度；酸堿滴定法測定總酸；DNS法測定還原糖；蒸餾法測定揮發酸[17]，每組處理做3次重復取平均值。

1.4.4 香氣成分的定性與定量分析

香氣物質提取：參照BARBOSA等[6]的方法進行。在20 mL頂空瓶中，加入8 mL發酵液，2g Na Cl和20 μL的2.00 g/L內標物(4-甲基-2-戊醇)，以及轉子。放置于45 ℃的可加熱磁力攪拌器上，預熱10 min后進行萃取，萃取50 min后進樣，解析10 min。

色譜條件：色譜柱為VF-WAXms(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；升溫程序：40 ℃下保持2 min，然后以6 ℃/min的速度升到230 ℃，保持15 min；載氣為氦氣，平均線速度為25 cm/s;不分流進樣。

質譜條件：電子轟擊離子源；電子能量70 eV；離子源溫度 230 ℃；檢測器溫度250 ℃；質量掃描范圍m/z30～400。

定量分析：采用外標法進行定量分析。

2 結果與討論

2.1 氮源濃度對酵母生長與發酵速率的影響

由圖1可以看出，到達穩定期后酵母菌的數量隨著氮源濃度的升高逐漸增大，說明高氮條件有利于酵母菌的繁殖。酵母菌到達穩定期的時間隨著氮源濃度的升高逐漸增加，說明隨著氮源濃度的提高酵母的對數生長期逐漸延長。

圖1 發酵過程中酵母生長量的變化Fig.1 The dynamic change of yeasts during fermentation

由圖2可知，當發酵800 h后，3組發酵液的酒精發酵基本結束，說明3種氮源濃度都能滿足酵母酒精發酵的需要；發酵速率隨著氮源濃度的升高而加快，說明高氮條件可以加快酵母的發酵速率。

圖2 發酵過程中還原糖含量的變化Fig.2 The change of sugar concentration during fermentation

2.2 不同氮源濃度對發酵液理化指標的影響

由表2可以看出，3組發酵液的殘糖、總酸、酒精的含量差別很小；揮發酸的含量隨著氮源濃度的升高而增加。這說明發酵液的酒精度、殘糖、總酸受氮源濃度的影響較小，而揮發酸的含量與氮源密切相關。

表2 不同氮源濃度發酵液的理化指標

2.3 不同氮源濃度對揮發性香氣成分的影響

利用SPME-GC-MS對3種氮源濃度發酵液香氣成分進行分析,共定性定量16種揮發性香氣物質,包括6種酯、5種酸和5種高級醇。YAN480的發酵液中揮發性香氣化合物總量為1 335.63 mg/L，在3組發酵液中揮發性香氣物質的含量最多。由表3可以看出，香氣物質總量隨氮源濃度的提高而增加，這與JIMéNEZ-MART等[9]的研究結果相近。

葡萄酒中由酵母合成的酯類是在酵母體內合成酶的催化下，由醇和酸形成[7]。酯類能賦予葡萄酒新鮮的水果香氣，在葡萄酒的品評中發揮著重要的作用[8]。由表3可以看出，在3種氮源濃度的發酵液中，定性定量的酯類共有6種。其中3種氮源濃度的發酵液中乙酸乙酯的含量最高，占酯類化合物總量的90%以上，其次為辛酸乙酯。酯類化合物的總量隨氮源濃度的提高而增加，這與繆成鵬等[10]的研究結果相似。在所測定的酯類化合物中乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯的含量隨氮源濃度的提高變化不大。

在酵母的氨基酸代謝及糖酵解過程中產生的α-酮酸會經過脫羧反應生成相應的醛類，醛類再由乙醛脫氫酶氧化形成相應的酸[8]。適量的脂肪酸可以賦予葡萄酒新鮮感，但脂肪酸含量過高時則會掩蓋葡萄酒的其他風味，給葡萄酒帶來不好的影響[15]。乙酸是葡萄酒中的主要揮發酸,對葡萄酒的品質有著重要的影響。乙酸含量過高會使葡萄酒帶有濃郁的醋酸味，降低酒的品質[12]。本研究定性定量了5種酸，這5種酸中乙酸的含量最高，癸酸的含量最低。乙酸、辛酸、己酸的含量隨氮源濃度的提高而增加。HERNANDEZ-ORTE 等[11]的研究發現己酸、辛酸等中鏈脂肪酸隨可同化氮素含量的提高而增加，BELY等[13]研究發現，可同化氮含量為200 mg/L時，乙酸含量最低，降低或增加可同化氮含量都會增加乙酸含量，這與本研究的結果相近。3組樣品的異丁酸、癸酸的含量隨著氮源濃度的提高變化不大。

表3 不同氮源濃度發酵液的香氣物質濃度 單位：mg/L

葡萄酒中適量的高級醇有助于增強葡萄酒風味的復雜性，當總量≤300 mg/L時，對葡萄酒風味是有益的；當總量>400 mg/L，則會對葡萄酒的品質造成消極的影響[12]。葡萄醪液α-氨基態氮含量為180～195 mg/L時酵母高級醇的生成量適中[14]。本研究定性定量了5種醇類，這5種醇類中異戊醇的含量最高，其次為1-丙醇，2,3-丁二醇的含量最低。異戊醇、2,3-丁二醇的含量隨氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量與隨氮源濃度的提高而降低。GARDE-CERDN等[16]的研究表明異丁醇的含量與氮源濃度呈負相關，這與本研究的結果相似。3組樣品中1-丙醇含量變化不大。

3 結論

本試驗研究結果表明，隨著氮源濃度的提高，酵母菌達到穩定期的時間增加，酵母菌的數量增加，發酵速率加快，揮發酸的含量增加。利用SPME-GC-MS對3種氮源濃度發酵液香氣成分進行分析,共定性定量了16種揮發性香氣物質,包括6種酯、5種酸和5種高級醇。香氣物質總量隨氮源濃度的提高而增加；乙酸乙酯、乙酸苯乙酯、月桂酸乙酯的含量隨著氮源濃度的提高而增加；乙酸、辛酸、己酸的含量隨著氮源濃度的提高而增加；2,3-丁二醇、異戊醇的含量隨著氮源濃度的提高而增加；異丁醇的含量隨著氮源濃度的提高而降低。

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Effect of the different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast

QIN Wei-shuai1，DONG Shu-jia1，JIANG Kai-kai1,2，FENG Wen-tao3， LIU Can-zhen1，ZHAO Xin-jie1*

1(Shandong Key Laboratory of Microbial Engineering, Qilu University of Technology, Jinan 250353，China) 2(Institute of Agro-Food Science and Technology, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100，China) 3(Yantai ChangYu Pioneer Wine Company Limited ，Yantai 264000，China)

To explore the effect of different concentration of nitrogen sources on the formation of aroma compounds produced by yeast, the volatile aroma compounds of synthetic must from different concentration of nitrogen sources after alcoholic fermentation was determined by head space solid phase microextraction (HS-SPME) followed by the gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that the sum of aroma compound increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of ethyl acetate, acetic acid, 2-phenylethyl ester, dodecanoic acid, ethyl ester, acetic acid, octanoic acid, hexanoic acid, 2,3-butanediol, 1-butanol, and 3-methyl increased with the increase of nitrogen concentration. The concentration of 1-propanol, 2-methyl decreased with the increase of nitrogen concentration.

assimilation nitrogen;yeast;aroma compound;headspace solid-phase microextraction(HS-SPME)；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703011

博士(趙新節教授為通訊作者,E-mail：719612304@qq.com)。

山東省現代農業產業技術體系果品產業創新團隊(SDAIT-06-14);山東省現代農業產業技術體系專項基金(SDAIT-03-021-12)；山東省重點研發計劃項目“膠東半島產區特色葡萄酒香氣質量提升關鍵技術研究”(2015GNC113010)

2016-08-22,改回日期：2016-11-25