桑葚果酒專用酵母的分離、篩選及鑒定

曹倩雯，鄭飛云，趙佳迪，張明芳，李佳泰，王金晶*，李崎

1(江南大學(xué), 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

桑葚果酒專用酵母的分離、篩選及鑒定

曹倩雯1,2，鄭飛云1,2，趙佳迪1,2，張明芳1,2，李佳泰1,2，王金晶1,2*，李崎1,2

1(江南大學(xué), 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

以市售桑葚為分離源，從其自然發(fā)酵醪液中分離得到42株酵母，通過(guò)杜氏小管發(fā)酵法初篩，產(chǎn)酒精能力復(fù)篩，耐SO2能力及香氣活力值(odor activity value,OAV)三級(jí)篩選，最終得到最優(yōu)菌株JNB-14。采用18S rDNA 序列鑒定，確定其與1株釀酒酵母Saccharomycescerevisiae(序列ID: AFD50639.1)有最高匹配度，為100%。

桑葚果酒；酵母；篩選；鑒定

桑葚又名桑果，是桑科落葉灌木或小喬木的果實(shí)。據(jù)醫(yī)藥史書記載，桑葚味甘性寒，歸心、肝、腎經(jīng), 具有滋陰補(bǔ)血、生津止渴、補(bǔ)肝益腎等功效[1]。桑葚果肉多汁，色澤艷麗并且富含多種生物活性物質(zhì)如維生素、胡蘿卜素、黃酮醇、花青素、酚酸等酚類化合物[2]，是釀酒的極佳原料。

目前桑葚酒在市場(chǎng)上并不多見(jiàn)，一般都由一些小企業(yè)、小作坊采用葡萄酒通用酵母釀造而成。工業(yè)上尚無(wú)釀造桑葚酒的專用酵母，而在果酒釀造的過(guò)程中，酵母起著非常重要的作用，直接影響到所釀果酒的口感、風(fēng)味以及理化性質(zhì)，決定了果酒品質(zhì)的優(yōu)劣[3]，因此篩選適于桑葚酒發(fā)酵的酵母菌株非常重要。本實(shí)驗(yàn)從市售桑葚果發(fā)酵液中分離篩選適合釀造桑葚酒的優(yōu)良酵母，得到了1株發(fā)酵性能優(yōu)良、香氣馥郁、風(fēng)味優(yōu)良酵母菌并對(duì)其進(jìn)行了菌株鑒定。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

桑葚果、白砂糖，市售；酵母基因組DNA提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨、瓊脂粉、酵母粉，Thermo Fisher Oxoid；偏重亞硫酸鉀(K2S2O5)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

富集培養(yǎng)基(含抗菌素的YPD液體培養(yǎng)基)：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，青霉素1 g/L[4]。

YPD培養(yǎng)基平板：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L。

斜面保藏培養(yǎng)基(YPD固體培養(yǎng)基)：葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L。

1.2 儀器與設(shè)備

生化培養(yǎng)箱BSP-250、低溫水浴槽，上海博迅公司；阿貝折光儀，泰光有限公司；PL2002電子天平、AL204分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國(guó)瓦里安(Varian)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌種分離

將新鮮成熟的桑葚果榨汁，放入滅完菌的三角瓶中于28 ℃自然發(fā)酵，待三角瓶中有大量氣泡產(chǎn)生時(shí)，取10 mL發(fā)酵醪液接入富集培養(yǎng)基，28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將富集好的菌懸液稀釋5個(gè)梯度，采用YPD培養(yǎng)基平板涂布分離，每個(gè)梯度3個(gè)平行，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d。典型的酵母菌菌落表面光滑、濕潤(rùn)、黏稠，質(zhì)地柔軟，易挑起，多為乳白或奶油色，有酒香味[5]。據(jù)此特征從培養(yǎng)好的平板上選取有典型酵母形態(tài)的菌落，分別在YPD培養(yǎng)基平板上劃線分離，直到出現(xiàn)單菌落，將所得單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD斜面于4 ℃保存并進(jìn)行編號(hào)命名。

1.3.2 酵母的初篩

將活化好的酵母以5%的接種量接入無(wú)菌的桑葚汁中，采用杜氏管發(fā)酵法[6]觀察各菌株的產(chǎn)氣速度和產(chǎn)氣量。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步篩選出發(fā)酵能力強(qiáng)、發(fā)酵香氣宜人的菌株。

1.3.3 酵母的復(fù)篩

將初篩所得發(fā)酵力強(qiáng)且發(fā)酵氣味較好的菌株活化后按5%的接種量接入含糖22°Bx的桑葚汁中，24 ℃發(fā)酵7 d。采用蒸餾法測(cè)定每瓶發(fā)酵液的酒精度[7]，并對(duì)其進(jìn)行感官品評(píng)。

1.3.4 酵母的三級(jí)篩選

1.3.4.1 酵母SO2耐受力實(shí)驗(yàn)

采用杜氏管發(fā)酵法，調(diào)整桑葚汁SO2濃度為40、80、120、160 mg/L，24 ℃下發(fā)酵2 d，觀察杜氏管中起泡情況。

1.3.4.2 香氣活力值(OAV)分析風(fēng)味篩菌

將復(fù)篩所得產(chǎn)酒精能力強(qiáng)且感官品評(píng)良好的菌株活化后按5%的接種量接入含糖22 °Bx的桑葚汁中，24 ℃發(fā)酵7 d。采用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)分析桑葚酒的香氣成分，并對(duì)其進(jìn)行感官品評(píng)。

樣品前處理萃取條件：20 mL頂空瓶中，加入8 mL桑葚酒樣品，3.0 g NaCl，在45 ℃預(yù)熱5 min，萃取60 min。萃取完成后，將萃取頭插入進(jìn)樣口，解吸附5 min，進(jìn)行GC-MS分析[8]。實(shí)驗(yàn)以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)作半定量分析。

分析條件為：GC條件：PEG-20M彈性石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 m×0.25 μm；載氣為高純氦氣，恒定流量為0.8 mL/min；升溫程序：從180 ℃開(kāi)始，保持2 min，以3 ℃/min升溫到230 ℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250 ℃，出樣口溫度200 ℃；檢測(cè)電壓350 V。MS條件：EI離子源，發(fā)射電流200 μA，電子能量70 eV，掃描范圍20～550 u。

1.3.5 菌株鑒定

以2%接種量取-80 ℃甘油貯存液接種于YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃、150 r/min培養(yǎng)24 h。取適量培養(yǎng)液離心1 min(12 000 r/min，4 ℃)，棄盡上清液，得到適量菌體，用酵母基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA。用酵母ITS通用引物對(duì)正向引物ITS1、反向引物ITS4擴(kuò)增基因組DNA，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min后進(jìn)入以下循環(huán)：94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。產(chǎn)物送往生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3.6 感官品評(píng)[9]

組織經(jīng)過(guò)感覺(jué)品評(píng)培訓(xùn)的老師及學(xué)生對(duì)每批桑葚酒進(jìn)行感官品評(píng)，結(jié)果取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

從市售桑葚果自然發(fā)酵液中共分離出42株酵母菌，可以看出桑葚汁自然發(fā)酵過(guò)程中可以富集其生長(zhǎng)環(huán)境中的酵母菌，且種類較多。

2.2 菌種初篩

對(duì)分離出的酵母菌進(jìn)行杜氏小管發(fā)酵，發(fā)酵溫度為24 ℃。恒溫靜置發(fā)酵48 h后，有33株酵母的杜氏小管內(nèi)都充滿了氣泡，并能聞到淡淡的酒香，說(shuō)明這些菌株發(fā)酵能力旺盛；有31株酵母發(fā)酵氣味優(yōu)良，具備桑葚酒發(fā)酵的典型香氣。其中，發(fā)酵能力強(qiáng)且發(fā)酵氣味愉悅的共有30株。初篩結(jié)果如表1。

表1 酵母初篩結(jié)果

注：“—”表示產(chǎn)氣很少不足 1/2 試管或者發(fā)酵氣味很差有酸敗味；“+”表示產(chǎn)氣較好，達(dá)到甚至超過(guò) 1/2 試管或者發(fā)酵無(wú)異味但香氣較淡；“++”表示產(chǎn)氣量充足超過(guò)2/3甚至充滿試管或者發(fā)酵氣味好、有酒香。

2.3 菌種復(fù)篩

對(duì)初篩所得的30株酵母進(jìn)行三角瓶發(fā)酵，調(diào)整桑葚汁糖度為22°Bx，24 ℃發(fā)酵7 d后測(cè)定酒精度情況如表2。其中，酒精度最高的桑葚酒為11.3%，酒精度最低的桑葚酒為7.0%。感官品評(píng)結(jié)果顯示得分較高的菌株共有15株，綜合產(chǎn)酒精情況，最終保留12株品評(píng)結(jié)果良好且產(chǎn)酒精能力強(qiáng)的酵母。

表2 酵母產(chǎn)酒精能力篩選

2.4 酵母的三級(jí)篩選

2.4.1 菌株耐SO2能力篩選

果酒發(fā)酵一般會(huì)添加SO2，它可以抑制各種微生物的活動(dòng)(繁殖和發(fā)酵)。各種微生物對(duì)SO2的敏感性不同，細(xì)菌最為敏感，其次是尖端酵母，而釀酒酵母耐SO2的能力較強(qiáng)。通常在發(fā)酵前加入適量的SO2，可減少其他微生物對(duì)釀酒酵母的影響，確保發(fā)酵順利完成。在果酒貯藏過(guò)程中，適量SO2可以抑制所有微生物的影響(包括酵母、乳酸菌和醋酸菌)，防止果酒的二次發(fā)酵和果酒的腐敗[10]。但是SO2添加太多會(huì)影響酵母的活性，使其發(fā)酵遲緩，酒體變苦，GB 2760—2014規(guī)定了SO2添加劑最大使用量(以SO2殘留量計(jì))為0.25 g/L[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)添加偏重亞硫酸鉀來(lái)調(diào)節(jié)桑葚汁中SO2的濃度，用杜氏小管發(fā)酵法進(jìn)行酵母的SO2耐受性實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示復(fù)篩所得的酵母菌表現(xiàn)出與葡萄酒釀酒酵母D254相當(dāng)?shù)哪蚐O2能力，在最大實(shí)驗(yàn)添加量下都生長(zhǎng)較旺盛，并且考慮到實(shí)際發(fā)酵時(shí)SO2濃度一般為40～80 mg/L，此輪篩選保留所有菌株。

表3 酵母對(duì)SO2耐受性篩選

注：“+++”表示產(chǎn)氣量充滿杜氏管；“++”表示產(chǎn)氣量達(dá)到甚至超過(guò)2/3杜氏管；“+”表示產(chǎn)氣量達(dá)到甚至超過(guò)1/2杜氏管。

2.4.2 GC-MS風(fēng)味分析篩菌

某種香氣物質(zhì)的絕對(duì)含量并不能反映它對(duì)酒體整體香氣的貢獻(xiàn)，還需要結(jié)合它在酒中的閾值來(lái)分析[12]。OAV值是一種表征揮發(fā)化合物對(duì)酒體的整體風(fēng)味貢獻(xiàn)大小的參數(shù)。OAV值是指揮發(fā)性化合物的濃度與其閾值的比值，理論上，只有OAV值大于1的揮發(fā)性化合物才對(duì)酒體的整體風(fēng)味有貢獻(xiàn)，并且OAV值越大其香氣貢獻(xiàn)越大[13]。正如FERREIRA指出，酒的特征香氣成分，其含量往往都在閾值以上(OAV>1)，并且去掉這些香氣成分之后，酒原先所具有的典型香氣也會(huì)消失[14]。因此，OAV值對(duì)確定桑葚酒中的特征香氣和重要香氣成分非常有幫助。

在桑葚酒中共檢測(cè)出近50種香氣成分，綜合OAV值分析可知，桑葚酒中的重要香氣物質(zhì)(OAV>1)有：辛酸乙酯、β-大馬酮、正庚醇、異戊酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、芳樟醇、乙酸苯乙酯、乙醛二乙縮醛、里哪醇、辛酸和癸酸乙酯，主要呈現(xiàn)水果香和花香，賦予酒體怡人的香氣，對(duì)桑葚酒體有很大貢獻(xiàn)。酯類大部分來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中醇和酸的酯化反應(yīng)，蒸餾過(guò)程也有部分酯的產(chǎn)生；貯存過(guò)程既有酯化反應(yīng)，也有水解反應(yīng)，主要是支鏈酯的酯化反應(yīng)和高濃度的直鏈酯類的水解反應(yīng)[15]。由OAV總值分析可知，相比于葡萄酒釀酒酵母D254和其他篩選所得菌株，9號(hào)菌的總OAV值最高，且其感官品評(píng)結(jié)果也最好，其他常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)均正常。綜合考慮，9號(hào)菌更適合桑葚酒的釀造，得到的酒體顏色飽滿透亮，果香馥郁，口味純正，酒體豐滿，故將其命名為JNB-14并申請(qǐng)專利1篇。

表4 十二種桑葚酒的各指標(biāo)分析結(jié)果

2.5 菌種鑒定

2.5.1 菌種鑒定

如圖1所示，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果良好。將擴(kuò)增產(chǎn)物寄送生工基因測(cè)序，在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)JNB-14與1株釀酒酵母Saccharomycescerevisiae(序列ID:AFD50639.1)具有最高的18S rDNA 基因序列相似性( 100%) ，故將其鑒定為釀酒酵母。

2.5.2 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

測(cè)定釀酒酵母生長(zhǎng)曲線所使用的培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基，115 ℃滅菌15 min。以1%接種量取-80 ℃甘油貯存液接種于YEPD培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)測(cè)生長(zhǎng)曲線，生長(zhǎng)期每2 h取樣，穩(wěn)定期每4 h取樣，紫外分光光度計(jì)測(cè)2株酵母培養(yǎng)液在600 nm下的吸光值，共培養(yǎng)72 h。

由圖2可以看出，酵母JBN-14在培養(yǎng)第4 h就進(jìn)入了對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，第16 h進(jìn)入平穩(wěn)期且穩(wěn)定時(shí)間長(zhǎng)。這說(shuō)明該酵母的發(fā)酵能力較強(qiáng)。

表5 桑葚酒中揮發(fā)性成分的閾值和OAV值(僅列出OAV>1的香氣成分)

M-10kb ladder;1-樣品圖1 酵母PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖Fig.1 PCR products by agarose electrophoresis of yeast

圖2 酵母JNB-14生長(zhǎng)曲線圖Fig.2 Growth curve of yeast JNB-14

3 討論

果酒加工行業(yè)面臨的一個(gè)較大的問(wèn)題就是缺少專用水果品種和專用果酒釀造酵母。對(duì)于釀造產(chǎn)業(yè)而言，菌種是企業(yè)的命脈，選用葡萄酒釀酒酵母或者直接將野生型酵母菌投入生產(chǎn)會(huì)導(dǎo)致成品酒的質(zhì)量和產(chǎn)量均存在一定的不足。本實(shí)驗(yàn)主要目的是篩選出能在滿足桑葚酒釀造的基本要求的基礎(chǔ)上擁有較強(qiáng)發(fā)酵產(chǎn)香性能的酵母。一級(jí)篩選淘汰了發(fā)酵能力弱或發(fā)酵氣味不愉悅的酵母，二級(jí)篩選淘汰了產(chǎn)酒精能力弱的酵母，三級(jí)篩選的出發(fā)菌株均能滿足桑葚酒釀造基本要求，這就要求在篩選時(shí)通過(guò)對(duì)感官品評(píng)和發(fā)酵風(fēng)味綜合評(píng)估的方法淘汰那些風(fēng)味平淡、沒(méi)有典型性的酵母菌株，而選擇香氣濃郁、典型性好的菌株。果酒的關(guān)鍵香氣化合物是構(gòu)成酒體香氣感官輪廓的主要因素，但由于呈香物質(zhì)間存在增效作用、協(xié)同作用、抑制作用等，使得多種物質(zhì)并非都能呈現(xiàn)各自的香氣。要確定所有揮發(fā)性成分中哪些化合物加強(qiáng)了桑葚酒的整體香氣，哪些掩蔽了桑葚酒的整體香氣，儀器分析仍難以做到；而大量研究結(jié)果證實(shí)，經(jīng)過(guò)一定培訓(xùn)且有果酒基本知識(shí)的人員組成的品評(píng)小組具有良好的穩(wěn)定性，且組內(nèi)成員對(duì)同一酒樣的評(píng)價(jià)具有良好的一致性。感官分析與儀器分析各自存在優(yōu)勢(shì)和一定的局限性，可將二者結(jié)合，相互彌補(bǔ)。本實(shí)驗(yàn)中OAV值可以反映酒體中各香氣成分含量及其對(duì)酒體的貢獻(xiàn)，通過(guò)比較OAV總值，可以很直觀地分析出酵母的產(chǎn)香能力；而感官品評(píng)結(jié)果可以直接反映酒體的風(fēng)味協(xié)調(diào)性。結(jié)合兩者結(jié)果分析，本實(shí)驗(yàn)成功從桑葚表皮分離篩選出1株發(fā)酵性能良好、發(fā)酵香氣馥郁、風(fēng)味優(yōu)良、OAV值高的釀酒酵母JNB-14。利用這株酵母釀造的桑葚酒香氣優(yōu)雅且典型性明顯，具有較強(qiáng)的工業(yè)應(yīng)用前景。

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The isolation , screening and identification of yeasts for mulberry wine

CAO Qian-wen1,2, ZHENG Fei-yun1,2, ZHAO Jia-di1,2, ZHANG Ming-fang1,2, LI Jia-tai1,2, WANG Jin-jing1,2*, LI Qi1,2

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

A total of 42 yeast strains were isolated from natural fermented mash of commercially available mulberries. Through duchenne tubular screening, alcohol yield ability test, SO2resistance ability test and odor activity value (odor activity value,OAV) screening, the optimal strain JNB-14 was obtained finally. The 18S rDNA sequence amplification was conducted for molecular biology identification of JNB-14 and it turned out to have the highest degree of match (100%) withSaccharomycescerevisiae(sequence ID: AFD50639.1).

mulberry wine; yeast; screening; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703017

碩士研究生(王金晶副教授為通訊作者,E-mail：jjwang@jiangnan.edu.cn)。

江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)；國(guó)家高新技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃，No.2013AA102106-03)；國(guó)家自然科學(xué)基金(No.31271919，No. 31571942，No.31301539，No.31601558，& No.31601445)；江蘇省自然科學(xué)基金(BK20150159)；江蘇基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目(JUSRP51306A, JUSRP51402A & JUDCF13008)

2016-09-06，改回日期：2016-11-07